Singola goccia digitale Polymerase Chain Reaction per rilevazione completa e simultanea delle mutazioni nelle regioni di Hotspot

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per quantificare con precisione le alterazioni genetiche multiple di una regione di destinazione in una singola reazione usando drop-off ddPCR e un paio di idrolisi sonde uniche.

Abstract

Reazione a catena della polimerasi digitale gocciolina (ddPCR) è un metodo di reazione a catena (PCR) altamente sensibile della polimerasi quantitativa basato sul frazionamento del campione in migliaia di dimensioni nano reazioni individuali di acqua in olio. Recentemente, ddPCR è diventato uno degli strumenti più precisi e sensibili per la rilevazione di DNA (ctDNA) del tumore di circolazione. Uno dei principali limiti della tecnica standard ddPCR è il limitato numero di mutazioni che possono essere sottoposti a screening per reazione, come sonde specifiche idrolisi riconoscendo ogni possibile versione alleliche sono necessari. Una metodologia alternativa, il ddPCR di drop-off, aumenta il throughput, poiché richiede solo una singola coppia di sonde per rilevare e quantificare potenzialmente tutte le alterazioni genetiche dalla regione di destinazione. Drop-off ddPCR Visualizza sensibilità paragonabile ai saggi di ddPCR convenzionale con il vantaggio di rilevare un maggior numero di mutazioni in una singola reazione. È conveniente, conserva materiale prezioso campione e può essere utilizzato anche come strumento di scoperta, quando le mutazioni non sono noti a priori.

Introduction

Migliaia di mutazioni somatiche legate allo sviluppo del cancro è stati segnalati¹. Tra questi, alcuni sono marcatori predittivi dell’efficacia della terapia mirata ^2,3 e la selezione di queste mutazioni genetica è pratica clinica di routine in questo momento. Tecnologia digitale di PCR (ddPCR) della gocciolina può essere utilizzata per monitorare la presenza o l’assenza di mutazioni con elevata accuratezza ed è altamente compatibile con biopsie liquido invasivo^4,5. Tuttavia, la corrente ddPCR saggi sono progettati principalmente per rilevare mutazioni conosciute a priori. Questo limita fortemente l’uso di ddPCR come uno strumento di scoperta quando la mutazione è sconosciuta. Infatti, nella progettazione convenzionale ddPCR, una sonda di idrolisi riconoscendo l’allele wild-type (WT sonda) compete con una sonda specifica per riconoscere l’allele del mutante (MUT sonda) (Figura 1A). La sonda con maggiore affinità ibridizza con il modello e rilascia il fluoroforo, che indica la natura dell’allele corrispondente. I dati di fluorescenza ottenuti per ciascuna gocciolina possono essere visualizzati in un grafico a dispersione che rappresenta la fluorescenza emessa dalle sonde WT e MUT in diverse dimensioni. Una rappresentazione schematica di un risultato tipico per un dosaggio di ddPCR convenzionale è presentata in Figura 1A. In questo esempio, la nuvola blu corrisponde alle goccioline contenenti alleli WT identificati dalla sonda WT, mentre la nuvola rossa corrisponde a goccioline in cui l’allele MUT è stato amplificato e identificato dalla sonda MUT. A seconda della quantità di DNA caricato nella reazione, doppie positive goccioline contenenti sia WT e MUT ampliconi possono apparire (nuvola verde). La nuvola grigia luce corrisponde a goccioline vuote.

Poiché la maggior parte delle piattaforme consentono la rilevazione di un numero limitato di fluorofori (solitamente 2, ma fino a 5), velocità effettiva di ddPCR convenzionale è limitata. Targeting per regioni con mutazioni multiple adiacenti richiede pertanto, progettazione di tecnicamente impegnativi saggi multiplex ddPCR o l’utilizzo di reazioni multiple targeting ogni mutazione in parallelo. La strategia di ddPCR di drop-off, supera questa limitazione come potenzialmente può rilevare qualsiasi alterazione genetica all’interno di un’area di destinazione utilizzando un unico paio di WT idrolisi sonde. Le prime coperture di sonda (sonda 1) una sequenza non variabile, adiacente alla regione di destinazione e la seconda sonda (sonda 2) è complementare alla sequenza WT della regione di destinazione, dove le mutazioni sono attesi (Figura 1B). Mentre la prima sonda quantifica la quantità totale di molecole amplificabile nella reazione, la seconda sonda discrimina gli alleli WT e MUT tramite l’ibridazione sub-ottima alle sequenze mutanti. Sonda 2 può identificare diversi tipi di mutazioni in destinazione regione (sostituzioni nucleotidiche singole o multiple, cancellazione, ecc.)⁶. Come ddPCR convenzionale, la nuvola grigia luce corrisponde a goccioline non contenenti nessun molecole di DNA. È importante ricordare che in questo tipo di analisi, una ottimale separazione delle nuvole WT e MUT è dipenda dalla quantità di DNA caricato nella reazione, dal momento che le goccioline contenenti sia WT e MUT alleli di destinazione non possono essere distinto da goccioline contenenti solo il WT modulo. Pertanto, questo test richiede che la maggior parte delle goccioline contengono non più di una copia del gene mirato.

Protocol

Il protocollo presentato qui segue le linee guida di etica dell’Institut Curie. Tutti i campioni umani sono stati ottenuti da pazienti arruolati, previo consenso informato, in studi approvati dalla Institutional Review Board presso Institut Curie. 1. raccolta, conservazione di Plasma ed estrazione di DNA libero di sangue Nota: Può essere utilizzato DNA Estratto da qualsiasi tipo di “tessuto” (ad es., fresco o formaldeide-fisso paraffina embedded tessuti (FFP…

Representative Results

In uno studio di proof-of-concept, mutazioni di KRAS esone 2 (codoni 12 e 13) ed EGFR esone 19 delezioni sono stati studiati nei tessuti FFPE e campioni di plasma dai malati di cancro utilizzando il drop-off ddPCR strategia6. La sonda di drop-off KRAS interrogato una regione di bp 16 comprendente più mutazioni nell’esone 2 del gene KRAS , che oltre il 95% delle mutazio…

Discussion

Per progettare un’analisi ddPCR di consegna efficiente, ottimizzazione è fondamentale, e il protocollo deve essere seguito attentamente. Ogni combinazione di primer e sonde ha un unico efficienza di reazione di PCR. Pertanto, un’analisi individuale deve essere convalidato con attenzione su campioni di controllo prima di essere utilizzati su campioni di prova importante. Ottimizzazione e validazione sono importanti per certificare il rilevamento del segnale di picco e valutare la sensibilità e specificità. Come descrit…

Materials

K2EDTA tube (color code : lavender)	BD	367863	EDTA tubes are used to obtain a whole blood or EDTA plasma sample
QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (manual protocol)	Qiagen	55114	For isolation of free-circulating DNA from human plasma
QIAsymphony DSP Circulating DNA Kit (automated protocol)	Qiagen	937556	For isolation of free-circulating DNA from human plasma
QIAsymphony SP system	Qiagen	9001297	fully integrated and automated system for cfDNA, DNA or RNA purification
QIAvac 24 Plus	Qiagen	19413	For purification of up to 24 cfDNAs simultaneously
Qubit fluorometer	Invitrogen	Q33226	The Qubit fluorometer is a benchtop fluorometer for the quantitation of DNA
QX100 or QX200 reader	Bio-Rad	186-3003 or186-4003, respectively	The reader measures fluorescence intensity of each droplet and detects the size and shape as droplets pass the detector
QX100 or QX200 droplet generator	Bio-Rad	186-3002 or 186-4002, respectively	Instrument used for droplet generation
C1000 thermal cycler	Bio-Rad	1851196	Modular thermal cycler platform, includes C1000 Touch thermal cycler chassis, 96-well fast reaction module
Plate sealer	Bio-Rad	181-4000	PX1™ PCR plate sealer
DG8 cartridge holder	Bio-Rad	186-3051	Positions and holds the DG8 cartridge in the instrument for droplet generation
Droplet generator cartridges and gaskets	Bio-Rad	186-4007	Microfluidic DG8 cartridge used to mix sample and oil to generate droplets; DG8 gaskets seal the cartridge to prevent evaporation and apply the pressure required for droplet formation
PCR supermix	Bio-Rad	186-3010	ddPCR supermix for probes (no dUTP)
96-well PCR plates	Eppendorf	951020362	96-well semi-skirted plates
Foil seal	Bio-Rad	181-4040	Pierceable foil heat seal
ddPCR Droplet Reader Oil	Bio-Rad	186-3004	oil used in the read
Droplet Generation Oil for Probes	Bio-Rad	186-3005	oil for droplet generation
DNA loBind Tube 1.5 mL	Eppendorf	0030 108.051	Eppendorf LoBind Tubes maximize sample recovery by significantly reducing sample-to-surface binding
Multiplex I cfDNA Reference Standard Set	HORIZON	HD780	The Multiplex I cfDNA Reference Standards are highly-characterized, biologically-relevant reference materials used to assess the performance of cfDNA assays that detect somatic mutations
QUBIT DSDNA HS ASSAY KIT, 500	Life Technologies	Q32854	The HS assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/µL to 100 ng/µL
Qubit Assay Tubes	Life Technologies	Q32856	Qubit assay tubes are 500 µL thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer