Reação em Cadeia da Polimerase Digital de Gota Única para Detecção Abrangente e Simultânea de Mutações em Regiões de Hotspot

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para quantificar com precisão a múltiplas alterações genéticas de uma região de destino em uma única reação usando ddPCR de entrega e um único par de testes de hidrólise.

Abstract

Reação em cadeia da polimerase digital da gota (ddPCR) é um método de reação em cadeia (PCR) polimerase quantitativos altamente sensível baseado no fracionamento de amostra em milhares de reações individuais nanométricas de água em óleo. Recentemente, ddPCR tornou-se uma das ferramentas mais precisas e sensíveis para a deteção de DNA (ctDNA) tumor de circulação. Uma das principais limitações da técnica padrão ddPCR é o número restrito de mutações que podem ser rastreados por reação, como sondas de hidrólise específica reconhecendo cada possível versão alélico são necessárias. Um método alternativo, o ddPCR de entrega, aumenta a taxa de transferência, pois requer apenas um único par de sondas para detectar e quantificar potencialmente todas as alterações genéticas na região alvo. Entrega ddPCR exibe sensibilidade comparável para ensaios de ddPCR convencional com a vantagem de detectar um maior número de mutações em uma única reação. É cost-effective, conserva o material precioso de amostra e também pode ser usado como uma ferramenta de descoberta quando mutações não são conhecidas a priori.

Introduction

Milhares de mutações somáticas relacionadas ao desenvolvimento de câncer foram relatados¹. Entre estes, alguns são marcadores preditivos da eficácia da terapia-alvo ^2,3 e genética triagem destas mutações é agora rotina clínica. Tecnologia digital de PCR (ddPCR) da gota pode ser usada para monitorar a presença ou ausência de mutações com exatidão elevada da deteção e é altamente compatível com não-invasivos biópsias líquido^4,5. No entanto, ensaios de ddPCR atual principalmente são projetados para detectar mutações conhecidas a priori. Isto limita severamente o uso de ddPCR como uma ferramenta de descoberta quando a mutação é desconhecida. Com efeito, na concepção convencional ddPCR, uma sonda de hidrólise, reconhecendo o alelo selvagem-tipo (sonda de WT) concorre com uma sonda específica, reconhecendo o alelo mutante (MUT sonda) (figura 1A). A sonda com maior afinidade se para o modelo e libera seu fluoróforo, indicando a natureza do alelo correspondente. Os dados de fluorescência obtidos para cada gota podem ser visualizados em um gráfico de dispersão representando a fluorescência emitida por sondas WT e MUT em dimensões diferentes. Uma representação esquemática de um resultado típico para um ensaio de ddPCR convencional é apresentada na figura 1A. Neste exemplo, a nuvem azul corresponde as gotículas contendo alelos WT identificados pela sonda WT, Considerando que a nuvem vermelha corresponde a gotículas no qual o alelo MUT foi amplificado e identificado pela sonda MUT. Dependendo da quantidade de DNA carregado na reação, duplas positivas gotículas contendo tanto WT e MUT amplicons podem aparecer (nuvem verde). A nuvem de cinza luz corresponde ao vazias gotículas.

Desde que a maioria das plataformas de permitir a detecção de um número limitado de fluorophores (normalmente 2, mas até 5), a taxa de transferência de ddPCR convencional é limitada. Portanto, segmentando regiões com várias mutações adjacentes requer projeto de tecnicamente desafiador multiplex ddPCR ensaios ou o uso de múltiplas reações alvejando cada mutação em paralelo. A estratégia de ddPCR de entrega, supera essa limitação como potencialmente pode detectar qualquer alteração genética dentro de uma região de destino usando um único par de sondas de hidrólise do WT. As tampas de sonda (Probe 1) primeiras que uma sequência não-variável, adjacente à região de destino e a segunda sonda (sonda 2) é complementar à sequência de WT da região de destino, onde as mutações são esperados (figura 1B). Enquanto a primeira sonda quantifica a quantidade total de moléculas ampliáveis na reação, a segunda sonda discrimina WT e MUT alelos por hibridação sub-ótimo para sequências de mutantes. Sonda 2 pode identificar vários tipos de mutações na região (substituições de nucleotídeo único ou múltiplo, exclusão, etc.) alvo⁶. Como em ddPCR convencional, a nuvem de cinza luz corresponde a gotículas não contendo nenhuma molécula de DNA. É importante recordar que, neste tipo de ensaio, separação ideal de nuvens WT e MUT é dependente da quantidade de DNA carregado na reação, desde que gotículas contendo tanto WT e MUT alelos de destino não podem ser distinguidas gotículas contendo apenas o WT formulário. Portanto, este ensaio requer que a maioria das gotículas contenham não mais de uma cópia do gene alvo.

Protocol

O protocolo aqui apresentado segue as diretrizes de ética do Institut Curie. Todas as amostras humanas foram obtidas de pacientes matriculados, após consentimento informado, em estudos aprovados pelo Conselho de revisão institucional no Institut Curie. 1. recolha, armazenamento de Plasma e extração de DNA sem célula de sangue Nota: O DNA extraído de qualquer tipo de “tecido” pode ser usado (por exemplo, fresco ou formaldeído-fixo parafina incorporado …

Representative Results

Em um estudo de prova de conceito, KRAS exon 2 mutações (códons 12 e 13) e EGFR exon 19 exclusões foram investigadas em FFPE tecidos e amostras de plasma de pacientes com câncer usando o declive ddPCR estratégia6. A sonda de entrega KRAS interrogado uma região bp 16, englobando várias mutações no exon 2 do gene KRAS , que abrigam mais de 95% das mutações con…

Discussion

Para projetar um ensaio de ddPCR de entrega eficiente, otimização é crucial, e o protocolo deve ser seguido cuidadosamente. Cada combinação de primers e sondas tem uma eficiência de reação de PCR exclusiva. Assim, um ensaio individual tem de ser cuidadosamente validado em amostras de controle antes de serem utilizados em amostras de teste valioso. Otimização e validação são importantes para a detecção do sinal de pico de certificar e avaliar a sensibilidade e especificidade. Conforme descrito no protocolo,…

Materials

K2EDTA tube (color code : lavender)	BD	367863	EDTA tubes are used to obtain a whole blood or EDTA plasma sample
QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (manual protocol)	Qiagen	55114	For isolation of free-circulating DNA from human plasma
QIAsymphony DSP Circulating DNA Kit (automated protocol)	Qiagen	937556	For isolation of free-circulating DNA from human plasma
QIAsymphony SP system	Qiagen	9001297	fully integrated and automated system for cfDNA, DNA or RNA purification
QIAvac 24 Plus	Qiagen	19413	For purification of up to 24 cfDNAs simultaneously
Qubit fluorometer	Invitrogen	Q33226	The Qubit fluorometer is a benchtop fluorometer for the quantitation of DNA
QX100 or QX200 reader	Bio-Rad	186-3003 or186-4003, respectively	The reader measures fluorescence intensity of each droplet and detects the size and shape as droplets pass the detector
QX100 or QX200 droplet generator	Bio-Rad	186-3002 or 186-4002, respectively	Instrument used for droplet generation
C1000 thermal cycler	Bio-Rad	1851196	Modular thermal cycler platform, includes C1000 Touch thermal cycler chassis, 96-well fast reaction module
Plate sealer	Bio-Rad	181-4000	PX1™ PCR plate sealer
DG8 cartridge holder	Bio-Rad	186-3051	Positions and holds the DG8 cartridge in the instrument for droplet generation
Droplet generator cartridges and gaskets	Bio-Rad	186-4007	Microfluidic DG8 cartridge used to mix sample and oil to generate droplets; DG8 gaskets seal the cartridge to prevent evaporation and apply the pressure required for droplet formation
PCR supermix	Bio-Rad	186-3010	ddPCR supermix for probes (no dUTP)
96-well PCR plates	Eppendorf	951020362	96-well semi-skirted plates
Foil seal	Bio-Rad	181-4040	Pierceable foil heat seal
ddPCR Droplet Reader Oil	Bio-Rad	186-3004	oil used in the read
Droplet Generation Oil for Probes	Bio-Rad	186-3005	oil for droplet generation
DNA loBind Tube 1.5 mL	Eppendorf	0030 108.051	Eppendorf LoBind Tubes maximize sample recovery by significantly reducing sample-to-surface binding
Multiplex I cfDNA Reference Standard Set	HORIZON	HD780	The Multiplex I cfDNA Reference Standards are highly-characterized, biologically-relevant reference materials used to assess the performance of cfDNA assays that detect somatic mutations
QUBIT DSDNA HS ASSAY KIT, 500	Life Technologies	Q32854	The HS assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/µL to 100 ng/µL
Qubit Assay Tubes	Life Technologies	Q32856	Qubit assay tubes are 500 µL thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer