Reacción en cadena polimerasa Digital sola gota para la detección integral y simultánea de mutaciones en las regiones de Hotspot

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para cuantificar con precisión múltiples alteraciones genéticas de una región de destino en una sola reacción usando ddPCR de bajada y un único par de sondas de hidrólisis.

Abstract

Reacción en cadena de polimerasa digital gota (ddPCR) es un método de reacción en cadena (PCR) alta sensibilidad cuantitativa de polimerasa basado en fraccionamiento de la muestra en miles de reacciones individuales de agua en aceite tamaño nanométrico. Recientemente, ddPCR ha convertido en uno de los instrumentos más precisos y sensibles para la detección de ADN (ctDNA) de tumor de circulación. Una de las principales limitaciones de la técnica de ddPCR estándar es el número limitado de mutaciones que pueden ser defendidos por reacción, como sondas de hidrólisis específica reconociendo cada versión alélica posible son necesarias. Una metodología alternativa, el ddPCR de entrega, aumenta el rendimiento, ya que requiere solamente un solo par de sondas para detectar y cuantificar potencialmente todas las alteraciones genéticas en la región específica. Entrega ddPCR muestra sensibilidad comparable a ensayos ddPCR convencional con la ventaja de detectar un mayor número de mutaciones en una sola reacción. Es rentable, conserva muestras preciosas y puede usarse como una herramienta de descubrimiento cuando las mutaciones se desconocen a priori.

Introduction

Miles de mutaciones somáticas relacionadas con el desarrollo de cáncer han sido reportados¹. Entre éstos, algunos son marcadores predictivos de la eficacia de la terapia dirigida ^2,3 y detección de estas mutaciones genética es la práctica clínica habitual ahora. Tecnología PCR (ddPCR) digital de la gotita puede utilizarse para monitorizar la presencia o la ausencia de mutaciones con precisión de detección alta y es altamente compatible con biopsias líquido no invasivos^4,5. Sin embargo, ensayos de ddPCR actual están diseñados principalmente para detectar las mutaciones conocidas a priori. Esto limita severamente el uso de ddPCR como una herramienta de descubrimiento cuando la mutación es desconocida. De hecho, en el diseño convencional de ddPCR, una sonda de hidrólisis reconociendo el alelo de tipo salvaje (WT sonda) compite con una sonda específica reconociendo el alelo mutante (MUT Probe) (figura 1A). La sonda con mayor afinidad cruza por hibridación a la plantilla y libera su fluoróforo, indicando la naturaleza del alelo correspondiente. Los datos de fluorescencia obtenidos para cada gotita se pueden visualizar en un diagrama de dispersión que representa la fluorescencia emitida por las sondas WT y MUT en diferentes dimensiones. Una representación esquemática de un resultado típico de un ensayo de ddPCR convencional se presenta en la figura 1A. En este ejemplo, la nube azul corresponde a las gotitas que contienen alelos WT identificados por la punta de prueba de peso, mientras que la nube roja corresponde a gotitas en el que el alelo MUT ha sido amplificado e identificado por la sonda MUT. Dependiendo de la cantidad de DNA en la reacción, doble positivo gotitas que contienen peso y MUT amplicones pueden aparecer (nube verde). La nube gris clara corresponde a gotas de vacías.

Puesto que la mayoría de las plataformas permite la detección de un número limitado de fluoróforos (generalmente 2, pero hasta 5), rendimiento de ddPCR convencional es limitado. Por lo tanto, dirigida a las regiones con múltiples mutaciones adyacentes requiere diseño de técnicamente difícil ensayos multiplex ddPCR o el uso de múltiples reacciones dirigidas a cada mutación en paralelo. La estrategia de ddPCR de entrega, supera esta limitación como es potencialmente capaz de detectar cualquier alteración genética dentro de una región de destino utilizando un único par de sondas de hidrólisis WT. La primera cubre sonda (sonda 1) es complementaria a la secuencia de la WT de la región de destino donde las mutaciones son una secuencia no variable, adyacente a la región de destino y la segunda sonda (sonda 2) espera (figura 1B). Mientras que la primera punta de prueba cuantifica la cantidad total de amplificable moléculas en la reacción, la segunda sonda discrimina alelos WT y MUT óptimo hibridación a las secuencias mutantes. Punta de prueba 2 puede identificar varios tipos de mutaciones en la región (substituciones del nucleótido único o múltiples, eliminación, etc.) de destino⁶. Como en ddPCR convencional, la nube gris clara corresponde a las gotas que contienen no las moléculas de ADN. Es importante recordar que en este tipo de análisis, separación óptima de WT y MUT nubes depende de la cantidad de ADN cargado en la reacción, ya que no se pueden distinguir las gotitas que contienen alelos objetivo WT y MUT de gotitas que contienen sólo el peso forma. Por lo tanto, este análisis requiere que la mayoría de las gotas contienen no más de una copia del gen objetivo.

Protocol

El protocolo que presentamos sigue las pautas de ética del Instituto Curie. Todas las muestras humanas fueron obtenidas de pacientes inscritos, tras consentimiento informado, en estudios aprobado por la Junta de revisión institucional en el Instituto Curie. 1. recolección, almacenamiento de Plasma y extracción de ADN libre de células de la sangre Nota: Se puede utilizar la DNA extraída de cualquier tipo de “tejido” (por ejemplo, parafina fresca o formal…

Representative Results

En un estudio de prueba de concepto, mutaciones del exón 2 de KRAS (codones 12 y 13) y EGFR exón 19 eliminaciones fueron investigados en los tejidos FFPE y las muestras de plasma de pacientes con cáncer mediante la entrega ddPCR estrategia6. La punta de prueba KRAS entrega interrogó a una región de bp 16 que abarca múltiples mutaciones en el exón 2 del gen KRAS ,…

Discussion

Para diseñar un ensayo de ddPCR de entrega eficiente, la optimización es crucial, y el protocolo debe seguirse cuidadosamente. Cada combinación de cebadores y sondas tiene un única eficiencia de reacción de PCR. Así, un ensayo individual tiene que ser cuidadosamente validado en muestras de control antes de ser utilizado en muestras de prueba valiosos. Optimización y validación son importantes para la detección de la señal de pico de certificar y evaluar sensibilidad y especificidad. Como se describe en el proto…

Materials

K2EDTA tube (color code : lavender)	BD	367863	EDTA tubes are used to obtain a whole blood or EDTA plasma sample
QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (manual protocol)	Qiagen	55114	For isolation of free-circulating DNA from human plasma
QIAsymphony DSP Circulating DNA Kit (automated protocol)	Qiagen	937556	For isolation of free-circulating DNA from human plasma
QIAsymphony SP system	Qiagen	9001297	fully integrated and automated system for cfDNA, DNA or RNA purification
QIAvac 24 Plus	Qiagen	19413	For purification of up to 24 cfDNAs simultaneously
Qubit fluorometer	Invitrogen	Q33226	The Qubit fluorometer is a benchtop fluorometer for the quantitation of DNA
QX100 or QX200 reader	Bio-Rad	186-3003 or186-4003, respectively	The reader measures fluorescence intensity of each droplet and detects the size and shape as droplets pass the detector
QX100 or QX200 droplet generator	Bio-Rad	186-3002 or 186-4002, respectively	Instrument used for droplet generation
C1000 thermal cycler	Bio-Rad	1851196	Modular thermal cycler platform, includes C1000 Touch thermal cycler chassis, 96-well fast reaction module
Plate sealer	Bio-Rad	181-4000	PX1™ PCR plate sealer
DG8 cartridge holder	Bio-Rad	186-3051	Positions and holds the DG8 cartridge in the instrument for droplet generation
Droplet generator cartridges and gaskets	Bio-Rad	186-4007	Microfluidic DG8 cartridge used to mix sample and oil to generate droplets; DG8 gaskets seal the cartridge to prevent evaporation and apply the pressure required for droplet formation
PCR supermix	Bio-Rad	186-3010	ddPCR supermix for probes (no dUTP)
96-well PCR plates	Eppendorf	951020362	96-well semi-skirted plates
Foil seal	Bio-Rad	181-4040	Pierceable foil heat seal
ddPCR Droplet Reader Oil	Bio-Rad	186-3004	oil used in the read
Droplet Generation Oil for Probes	Bio-Rad	186-3005	oil for droplet generation
DNA loBind Tube 1.5 mL	Eppendorf	0030 108.051	Eppendorf LoBind Tubes maximize sample recovery by significantly reducing sample-to-surface binding
Multiplex I cfDNA Reference Standard Set	HORIZON	HD780	The Multiplex I cfDNA Reference Standards are highly-characterized, biologically-relevant reference materials used to assess the performance of cfDNA assays that detect somatic mutations
QUBIT DSDNA HS ASSAY KIT, 500	Life Technologies	Q32854	The HS assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/µL to 100 ng/µL
Qubit Assay Tubes	Life Technologies	Q32856	Qubit assay tubes are 500 µL thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer