Einzelne Tropfen digitale Polymerase-Kettenreaktion für umfassende und gleichzeitigen Nachweis von Mutationen im Hotspot-Regionen
Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll, um mehrere genetische Veränderungen der Zielregion in einer einzelnen Reaktion mit Drop-off-DdPCR und ein einzigartiges paar Hydrolyse Sonden genau zu quantifizieren.
Abstract
Droplet digitale Polymerase-Kettenreaktion (DdPCR) ist eine hochempfindliche quantitative Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Methode basiert auf Probe Fraktionierung in Tausende von nanogrösse Wasser-in-Öl-individuelle Reaktionen. Vor kurzem, ist eines der genauesten und sensible Instrumente für zirkulierenden Tumor DNA (CtDNA) Erkennung DdPCR geworden. Die wesentlichen Einschränkungen der standard DdPCR-Technik gehört die begrenzte Anzahl von Mutationen, die pro Reaktion gezeigt werden kann als spezifische Hydrolyse Sonden erkennen jede mögliche Allele Version erforderlich sind. Eine alternative Methode, die Drop-off-DdPCR erhöht den Durchsatz, da es nur ein einzelnes Paar von Sonden erfordert zu erkennen und zu quantifizieren, potenziell alle genetische Veränderungen in der gezielten Region. Drop-off-DdPCR zeigt vergleichbare Sensitivität zu konventionellen DdPCR Assays mit dem Vorteil eine größere Anzahl von Mutationen in einer einzelnen Reaktion zu erkennen. Es ist kostengünstig, schont wertvolle Probenmaterial und kann auch als ein Discovery-Tool verwendet werden, wenn Mutationen kein-prioribekannt sind.
Introduction
Tausende von somatischen Mutationen, die im Zusammenhang mit Krebsentstehung wurden berichtet1. Unter diesen sind einige prädiktive Marker für die Wirksamkeit der gezielten Therapie 2,3 und genetisches screening dieser Mutationen ist jetzt klinischen Routine. Tröpfchen-Digitaltechnik-PCR (DdPCR) verwendet werden, um das Vorhandensein oder das Fehlen von Mutationen mit hoher Erkennungsgenauigkeit zu überwachen und ist sehr kompatibel mit nicht-invasiven flüssigen Biopsien4,5. Aktuelle DdPCR Assays sind jedoch in erster Linie Mutationen bekannt a-priorizu erkennen. Dies schränkt die Verwendung von DdPCR als ein Discovery-Tool die Mutation ist nicht bekannt. In der Tat konkurriert in der konventionellen DdPCR Design, eine Hydrolyse-Sonde erkennt das Wildtyp Allel (WT-Sonde) mit einer speziellen Sonde erkennen die mutierten Allels (MUT-Sonde) (Abbildung 1A). Sonde mit höherer Affinität zur Vorlage hybridisiert und veröffentlicht seine Fluorophor, unter Angabe der Art des entsprechenden Allels. Die Fluoreszenz Daten für jedes Tröpfchen können in einem Streudiagramm repräsentieren die Fluoreszenz emittiert durch den WT und MUT Sonden in verschiedenen Dimensionen visualisiert werden. Eine schematische Darstellung der ein typisches Ergebnis für einen herkömmlichen DdPCR-Assay ist in Figur 1Apräsentiert. In diesem Beispiel entspricht die Blaue Wolke Tröpfchen mit WT Allele identifiziert durch die WT-Sonde, während die rote Wolke Tröpfchen entspricht in der MUT-Allel verstärkt und durch die MUT-Sonde identifiziert. Abhängig von der Menge der DNA in der Reaktion geladen können doppelte positive Tröpfchen mit WT und MUT Amplifikate (grüne Wolke) angezeigt werden. Die helle graue Wolke entspricht leer Tröpfchen.
Da die meisten Plattformen für den Nachweis von einer begrenzten Anzahl von Fluorophore (in der Regel 2, aber bis zu 5) ermöglichen, ist Durchsatz von konventionellen DdPCR begrenzt. Daher erfordert die Ausrichtung auf Regionen mit mehreren angrenzenden Mutationen Design von technisch anspruchsvollen multiplex DdPCR Assays oder die Verwendung von mehreren Reaktionen auf jede Mutation parallel. Die Drop-off-DdPCR-Strategie, überwindet diese Einschränkung, da es möglicherweise genetische Veränderung innerhalb einer Zielregion mit einer einzigartigen WT Hydrolyse Sonden erkennen kann. Die erste Sonde (Sonde 1) Abdeckungen ist eine nicht-Variablen Sequenz, angrenzend an die Zielregion und die zweite Sonde (Sonde 2) Ergänzend zu der WT-Sequenz der Zielregion wo Mutationen sind zu erwarten (Abbildung 1 b). Während die erste Sonde den Gesamtbetrag der amplifiable Moleküle in der Reaktion quantifiziert, diskriminiert die zweite Sonde WT und MUT Allele durch suboptimale Hybridisierung auf mutierte Sequenzen. Fühler 2 kann mehrere Arten von Mutationen in der Ziel-Region (einzelne oder mehrere Nukleotid Substitutionen, löschen, etc.)-6identifizieren. Wie bei konventionellen DdPCR entspricht die helle graue Wolke Tröpfchen enthalten keine DNA-Moleküle. Es ist wichtig, daran zu erinnern, dass bei dieser Art des Tests, optimale Trennung von WT und MUT Wolken abhängig von der Menge der DNA geladen in der Reaktion ist, da Tröpfchen mit WT und MUT Ziel Allele von Tröpfchen enthalten nur das WT nicht zu unterscheiden Form. Dieser Test erfordert daher, dass die meisten Tropfen nicht mehr als eine Kopie des Gens gezielte enthalten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um eine effiziente Drop-off-DdPCR-Assay zu entwerfen, Optimierung ist entscheidend, und das Protokoll muss sorgfältig beachtet werden. Jede Kombination von Primer und Sonden hat eine einzigartige Effizienz der PCR-Reaktion. So hat eine einzelne Probe sorgfältig auf Kontrollproben überprüft werden, bevor Sie auf wertvolle Proben verwendet wird. Optimierung und Validierung sind wichtig zur Zertifizierung Peak Signalerkennung und Spezifität und Sensitivität zu beurteilen. Wie im Protokoll beschrieben, können potenzie…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom Institut Curie SiRIC (Grant Inka-DGOS-4654) unterstützt. Die Autoren möchte auch Caroline Hego für ihre Verdienste um das Video zu danken.
Materials
| K2EDTA tube (color code : lavender) | BD | 367863 | EDTA tubes are used to obtain a whole blood or EDTA plasma sample |
| QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (manual protocol) | Qiagen | 55114 | For isolation of free-circulating DNA from human plasma |
| QIAsymphony DSP Circulating DNA Kit (automated protocol) | Qiagen | 937556 | For isolation of free-circulating DNA from human plasma |
| QIAsymphony SP system | Qiagen | 9001297 | fully integrated and automated system for cfDNA, DNA or RNA purification |
| QIAvac 24 Plus | Qiagen | 19413 | For purification of up to 24 cfDNAs simultaneously |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | Q33226 | The Qubit fluorometer is a benchtop fluorometer for the quantitation of DNA |
| QX100 or QX200 reader | Bio-Rad | 186-3003 or186-4003, respectively | The reader measures fluorescence intensity of each droplet and detects the size and shape as droplets pass the detector |
| QX100 or QX200 droplet generator | Bio-Rad | 186-3002 or 186-4002, respectively | Instrument used for droplet generation |
| C1000 thermal cycler | Bio-Rad | 1851196 | Modular thermal cycler platform, includes C1000 Touch thermal cycler chassis, 96-well fast reaction module |
| Plate sealer | Bio-Rad | 181-4000 | PX1™ PCR plate sealer |
| DG8 cartridge holder | Bio-Rad | 186-3051 | Positions and holds the DG8 cartridge in the instrument for droplet generation |
| Droplet generator cartridges and gaskets | Bio-Rad | 186-4007 | Microfluidic DG8 cartridge used to mix sample and oil to generate droplets; DG8 gaskets seal the cartridge to prevent evaporation and apply the pressure required for droplet formation |
| PCR supermix | Bio-Rad | 186-3010 | ddPCR supermix for probes (no dUTP) |
| 96-well PCR plates | Eppendorf | 951020362 | 96-well semi-skirted plates |
| Foil seal | Bio-Rad | 181-4040 | Pierceable foil heat seal |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio-Rad | 186-3004 | oil used in the read |
| Droplet Generation Oil for Probes | Bio-Rad | 186-3005 | oil for droplet generation |
| DNA loBind Tube 1.5 mL | Eppendorf | 0030 108.051 | Eppendorf LoBind Tubes maximize sample recovery by significantly reducing sample-to-surface binding |
| Multiplex I cfDNA Reference Standard Set | HORIZON | HD780 | The Multiplex I cfDNA Reference Standards are highly-characterized, biologically-relevant reference materials used to assess the performance of cfDNA assays that detect somatic mutations |
| QUBIT DSDNA HS ASSAY KIT, 500 | Life Technologies | Q32854 | The HS assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/µL to 100 ng/µL |
| Qubit Assay Tubes | Life Technologies | Q32856 | Qubit assay tubes are 500 µL thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer |
References
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