العلاج الجيني بوساطة ناقلات لينتيفيرال من خلايا الكبد فيفو السابقين للزرع الذاتي في الخنازير
Summary
يهدف هذا البروتوكول لوصف تتمثل الخنزير العزلة و السابقين فيفو إيصال الجينات لعلاج نماذج لأمراض التمثيل الغذائي عن طريق زرع الخلايا ذاتي. على الرغم من أن هذا النموذج خاصة تتمتع بمزايا فريدة من نوعها لصالح العلاج الناجح، التطبيق مؤسسة ذات صلة لمعالجة أمراض إضافية والمؤشرات.
Abstract
العلاج الجيني اختيار مثالي لعلاج العديد من أخطاء فطرية من الأيض في الكبد. السابقين فيفو، ناقلات لينتيفيرال قد استخدمت بنجاح في معالجة العديد من الأمراض المكونة للدم في البشر، كما يوفر الاستخدام التعبير التحوير مستقرة بسبب متجه القدرة على الاندماج في جينوم مضيف. هذا الأسلوب يوضح التطبيق السابقين فيفو العلاج الجيني لخلايا الكبد لنموذج حيوانات كبيرة من نوع tyrosinemia الوراثية أنا. تتكون هذه العملية من 1) عزل خلايا الكبد الأولية من الحيوان ذاتي الجهات المانحة والمتلقية، 2) السابقين فيفو إيصال الجينات عن طريق توصيل تتمثل مع ناقل لينتيفيرال، وزرع خلايا الكبد تصحيحها عن طريق بوابة 3) ذاتي حقن الوريد. ويعتمد نجاح الأسلوب عموما عند إزالة كفاءة والعقيمة لاستئصال الكبد، حذراً في التعامل مع العينة قصت لعزل خلايا الكبد سليمة كافية لتوصيل إعادة انجرافتينج، ونسبة عالية من الخلايا المعزولة، و الإجراءات الجراحية معقمة في جميع أنحاء للوقاية من العدوى. عطل فني في أي من هذه الخطوات سيؤدي منخفضة الغلة من خلايا الكبد ترانسدوسيد صالحة للزرع الذاتي أو العدوى من الحيوان المانح والمتلقي. نموذج الخنزير tyrosinemia الوراثية النوع البشري 1 (HT-1) المختارة لهذا النهج فريد قابلة لمثل هذا أسلوب، حتى نسبة مئوية صغيرة من انجرافتمينت خلايا تم تصحيحها سيؤدي إلى إعادة تعمير الكبد مع الخلايا السليمة التي تستند إلى قوي ميزة انتقائية على خلايا الكبد الأم مريضة. على الرغم من أن هذا التحديد النمو لن يكون صحيحاً لجميع المؤشرات، هذا النهج هو أساس للتوسع إلى دلائل أخرى ويسمح بالتلاعب بهذه البيئة معالجة أمراض إضافية، سواء داخل الكبد وما بعدها، في حين التحكم في التعرض لناقلات الأمراض الفيروسية والفرصة لسمية خارج الهدف وتوموريجينيسيتي.
Introduction
أخطاء فطرية من الأيض في الكبد هي عائلة من الأمراض الوراثية التي تؤثر مجتمعة ما يصل إلى 1 في 800 مولود حي1. كثير من هذه الأمراض هي عيوب وحيدة الجين2 ويمكن الشفاء من الناحية الوظيفية بإدخال عدد كاف من خلايا الكبد3نسخة مصححة واحدة من الجينات المتأثرة. يختلف حسب المرض4 النسبة المئوية الفعلية لخلايا الكبد التي يحتاج إلى تصحيح وهو يعتمد إلى حد كبير على طبيعة البروتين من ترميز، على سبيل المثال، أغلبه بروتينات مقابل هيولى. في معظم الحالات، هو جزيئي فعالية أي علاج للأمراض الأيضية بسهولة من خلال وجود المؤشرات الحيوية غالباً ما تتوفر في الدورة الدموية.
HT-1 هو خطأ وراثي في التمثيل الغذائي في الكبد ناجم عن خلل في فوماريلاسيتواسيتاتي هيدرولاز (فاه)5، الانزيمية الخطوة الأخيرة في عملية التمثيل الغذائي تيروزين6. يؤدي نقص فاه للبناء من نواتج الأيض السامة في الكبد يمكن أن يسبب فشل الكبد الحاد والموت أو في شكل المرض المزمن يمكن أن يسبب تليف الكبد وسرطانه الخلية الكبدية. المرض سريرياً تديره إدارة 2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (نتبك)، مثبط جزيء صغير من إنزيم المنبع من فاه في التمثيل الغذائي تيروزين. المرض ويوفر بيئة مثالية لاختبار أساليب العلاج الجيني، كتصحيح ناجحة حتى عدد صغير من خلايا الكبد في نهاية المطاف سيؤدي إلى إعادة تعمير الكبد الكامل مع الخلايا المصححة في نماذج حيوانية كل صغيرة وكبيرة 7 , 8. وهذا يحدث بسبب تصحيح خلايا تتمتع بميزة بقاء عميقة على الخلايا التي لم يتم تصحيحها بسبب تراكم نواتج الأيض السامة في الأخير. فقدان خلايا الكبد غير المصححة يسمح للتوسيع الانتقائي لخلايا الكبد المصوبة تتسق مع قدرة التجدد في الكبد. يمكن أن يتبع العلاج بسهولة بقياس الانخفاض في تعميم مستويات التيروزين وسوكسينيلاسيتوني بعد زرع الأعضاء.
يجب أن يكون الهدف من هذا النهج بغية تبرير الطبيعة الغازية من الإجراءات، التي تشمل ظهرت جزئي، علاج دائم. ولذلك، تستخدم النسخ المتماثل غير كفء ناقلات لينتيفيرال نظراً لأنهم سوف ستابلي دمج الجينوم تتمثل9. ضمان إيصال الجينات المصححة لجميع الخلايا الوليدة كالكبد ينمو ويتسع ليحل محل الفقدان السريع للخلايا التي لم يتم تصحيحها. وهذا مفيد على ناقلات (إف) الفيروسية الغدد المرتبطة، والتي توجد أساسا ابيسوميس التي يمكن فقط أن تنتقل إلى خلية ابنه واحدة أثناء الانقسام10 وبالتالي فقدان أي أثر للعلاج في غضون أسابيع.
على الرغم من أن مجموعة متنامية من الأدب يدعم سلامة lentivirus11، المخاوف عبر أحداث سمية جينية تخفف عن طريق الحد من توصيل الخلايا المضيفة لبيئة التي تسيطر عليها في المختبر . ابدأ عناصره هو عرض الحرة ناقل المضيف عندما يتم تنفيذ هذا الأسلوب، الحد من التعرض لخلايا الكبد التي سيتم إعادة عرض مع الزرع الذاتي عن طريق الوريد البابي.
يصف هذا التقرير أسلوب العمليات الجراحية و السابقين فيفو الإجراءات المستخدمة لعزل خلايا الكبد للجينات العلاج السابقين فيفو و الزرع الذاتي اللاحقة12 لعلاج الخنازير HT-18. تتضمن عملية كاملة 1) ظهرت جزئي الذي يخدم كمصدر لخلايا الكبد وتحفيز النمو للكبد للمضيف، 2) عزل خلايا الكبد من الكبد قصت تليها السابقين فيفو تصحيح الجينات، وأخيراً 3) إعادة خلايا الكبد تصحيحها مرة أخرى في البلد المضيف. الطريقة الموصوفة تنطبق على جميع نماذج حيوانية كبيرة مع إدخال بعض التعديلات، ولكن فقط تفتقر إلى فاه خنزير13 سوف تتميز ببيئة انتقائية لخلايا الكبد المصوبة.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويصف هذا التقرير السابقين فيفو جينات ذاتي علاج نهج لعلاج نموذجا الخنزير HT-1. أنها تنطوي ظهرت جزئية، تليها السابقين فيفو تتمثل العزلة وتوصيل لعزل خلايا الكبد بالفيروس لينتي تحمل التحوير التصحيحية. ثم يتم زرع خلايا الكبد ذاتي المصوبة العودة إلى الحيوان فاه قاصرة عن طريق الوريد الب…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون دوان [مياكسنر] للخبرة في أداء حقن الوريد البابي، ستيف كراج، جوان بيدرسون، وهيلين لوري للدعم أثناء الإجراءات الجراحية. هذا العمل كان تدعمها مؤسسة مينيسوتا لمستشفى الأطفال و “الطب التجديدي” مينيسوتا. تم تمويل R.D.H. من خلال جائزة DK106056 K01 المعاهد الوطنية للصحة ومركز عيادة مايو كلينيك “جائزة تنمية مهنة الطب التجديدي”.
Materials
| 2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC) | Yecuris | 20-0027 | |
| 12 mm Trocar | Covidien | B12STS | |
| 5 mm Trocar | Covidien | B5SHF | |
| Endo Surgical Stapler 60 | Covidien | EGIA60AMT | |
| Endo Surgical Stapler 45 | Covidien | EGIA45AVM | |
| Endo Surgical Stapler 30 | Covidien | SIG30AVM | |
| Endo catch bag | Covidien | 173050G | |
| 0 PDS | Ethicon | Z340H | |
| 2-0 Vicryl | Ethicon | J459H | |
| 4-0 Vicryl | Ethicon | J426H | |
| Dermabond | Ethicon | DNX12 | Sterile Dressing |
| Williams’-E Powder | Gibco | ME16060P1 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S8875-1KG | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-011-CV | |
| NaCl (g/L) | Sigma Aldrich | S1679-1KG | |
| KCl (g/L) | Sigma Aldrich | P3911-500G | |
| EGTA (g/L) | Oakwood Chemical | 45172 | |
| N-acetyl-L-cysteine | Oakwood Chemical | 3631 | |
| (N-A-C, g/L) | Sigma Aldrich | A9165-100G | |
| CaCl2 2H2O (g/L) | Sigma Aldrich | 223506-500G | |
| Collagenase D (mg/mL) | Crescent Chemical | 17456.2 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Corning | 15-013-CV | |
| Dexamethasone | Fresenius Kabi | NDC6337 | |
| Epidermal Growth Factor | Gibco | PHG0314 |
Referências
- Mak, C. M., Lee, H. C., Chan, A. Y., Lam, C. W. Inborn errors of metabolism and expanded newborn screening: review and update. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 50 (6), 142-162 (2013).
- Hansen, K., Horslen, S. Metabolic liver disease in children. Liver Transplantation. 14 (5), 713-733 (2008).
- Schneller, J. L., Lee, C. M., Bao, G., Venditti, C. P. Genome editing for inborn errors of metabolism: advancing towards the clinic. BMC Medicine. 15 (1), 43 (2017).
- Brunetti-Pierri, N. Gene therapy for inborn errors of liver metabolism: progress towards clinical applications. Italian Journal of Pediatrics. 34 (1), 2 (2008).
- Carlson, D. F., et al. Efficient TALEN-mediated gene knockout in livestock. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (43), 17382-17387 (2012).
- Lindblad, B., Lindstedt, S., Steen, G. On the enzymic defects in hereditary tyrosinemia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (10), 4641-4645 (1977).
- Hickey, R. D., et al. Noninvasive 3-dimensional imaging of liver regeneration in a mouse model of hereditary tyrosinemia type 1 using the sodium iodide symporter gene. Liver Transplantation. 21 (4), 442-453 (2015).
- Hickey, R. D., et al. Curative ex vivo liver-directed gene therapy in a pig model of hereditary tyrosinemia type 1. Science Translational Medicine. 8 (349), (2016).
- Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272 (5259), 263-267 (1996).
- Bouard, D., Alazard-Dany, D., Cosset, F. L. Viral vectors: from virology to transgene expression. British Journal of Pharmacology. 157 (2), 153-165 (2009).
- Sakuma, T., Barry, M. A., Ikeda, Y. Lentiviral vectors: basic to translational. Biochemical Journal. 443 (3), 603-618 (2012).
- Chowdhury, J. R., et al. Long-term improvement of hypercholesterolemia after ex vivo gene therapy in LDLR-deficient rabbits. Science. 254 (5039), 1802-1805 (1991).
- Elgilani, F., et al. Chronic Phenotype Characterization of a Large-Animal Model of Hereditary Tyrosinemia Type 1. The American Journal of Pathology. 187 (1), 33-41 (2017).
- Patyshakuliyeva, A., et al. Carbohydrate utilization and metabolism is highly differentiated in Agaricus bisporus. BMC Genomics. 14, 663 (2013).
- Hickey, R. D., et al. Fumarylacetoacetate hydrolase deficient pigs are a novel large animal model of metabolic liver disease. Stem Cell Research. 13 (1), 144-153 (2014).
