豚に自家移植用肝細胞Ex Vivoのレンチ ウイルス媒介性遺伝子治療
Summary
このプロトコルは、自家細胞移植を介して代謝性疾患モデルを治すため豚肝細胞分離とex vivo遺伝子デリバリーを記述したものです。この特定のモデルは、成功した療法を支持するユニークな利点を楽しんでいます、アプリケーションはその他の病気と徴候に対処する関連する財団。
Abstract
遺伝子治療は、多くの先天性肝臓の代謝異常を治療するに最適です。Ex vivo、として彼らの使用を提供する安定した遺伝子発現の宿主ゲノムに統合する能力をベクトルのために、ヒトでは、多くの造血器疾患の治療にレンチウイルスベクターを正常に使用されています。このメソッドは、肝細胞の遺伝子治療前のヴィヴォの遺伝性の tyrosinemia タイプの大型動物モデルへの応用を示します私。このプロセスは、1) 自家ドナー/受信者動物、2 から初代肝細胞の分離) レンチウイルスベクター、ポータル経由で修正された肝細胞の 3) 自家移植と肝細胞伝達を介して遺伝子配達前のヴィヴォ静脈注射。メソッドの成功は、一般的に肝切除術、単離細胞の再接が、高割合の伝達のための十分な実行可能な肝細胞の分離切除標本の取り扱い注意の効率的かつ滅菌除去に依存していて、感染を防ぐために全体の無菌手術。これらの手順のいずれかで技術的な障害は、自家移植のため導入された肝細胞実行可能な低収量やドナー/受信者動物の感染症になります。強力なに基づいて健康な細胞と小さな修正された細胞の生着率も肝臓の再作成につながるとヒト 1 型遺伝性 tyrosinemia (HT 1) このアプローチのために選択の豚モデルが一意にそのような方法に従うネイティブ病気肝細胞の選択的優位は。この成長の選択は、すべての兆候には当てはまらないだろう、このアプローチに他の適応症の拡大のための基盤は、肝臓内の両方その他の疾病に対処し、ながら、この環境の操作は、ウイルスのベクトルと的外れの毒性と腫瘍のための機会への暴露を制御します。
Introduction
先天性肝臓の代謝は、総称してできるだけ多くの 1 の 800 出生1に影響を与える遺伝病の家族です。これらの疾患の多くは単一遺伝子の欠陥は2であり、機能的肝3の十分な数に影響を受けた遺伝子の単一の修正されたコピーを導入することによって治すことができます。修正が必要な肝細胞の実際の割合病気4によって異なりますが、たとえば、排泄蛋白質細胞質対それをエンコードし、タンパク質の性質に大きく依存します。ほとんどの場合、代謝性疾患の任意の治療の有効性はしばしば循環で利用可能なバイオ マーカーの存在によって簡単に試金します。
HT 1 は先天性欠陥 4-フマリルアセト酢酸加水分解酵素 (ファー)5、チロシン代謝6の最後の酵素ステップからの結果肝臓の代謝異常です。FAH の欠乏は、急性肝不全と死を引き起こすことができるまたは病気の慢性の形態が原因で肝硬変や肝細胞癌肝毒性代謝産物のビルドに します。病気は、2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC) をもたらすチロシン代謝の FAH の上流酵素の小分子阻害薬の投与により臨床的に管理されます。病気は、肝細胞の数が少ないもの成功補正で結局起因する肝臓全体の再作成両方の小規模および大規模な動物モデルに修正された細胞の遺伝子治療法をテストする理想的な環境7,8します。 これは、修正細胞後者で裸眼の細胞毒性代謝産物の蓄積のために深遠な生存の利点があります。肝臓の再生能力と一貫性のある修正された肝細胞の選択的な拡大のため裸眼肝細胞の損失ができます。治療は、移植チロシンと succinylacetone のレベルを循環の減少を測定することによって簡単に続くことが。
部分肝切除を含むプロシージャの侵襲を正当化するためにこのアプローチの目的は、耐久性のある治療法をする必要があります。したがって、レプリケーション無能なレンチウイルスベクターは、安定して肝細胞ゲノム9に統合されるために使用されます。肝臓としての娘のすべてのセルに修正された遺伝子の配信を確保する成長し、裸眼の細胞の急速な損失を置き換えるに拡大します。これは有糸分裂10週間の問題で治療の効果を失うことの間に 1 つの娘細胞にのみ渡されるエピソームとして主に存在している関連付けられているアデノ ウイルス (AAV) ベクターで有利であります。
文献の成長するボディにレンチ ウイルス11懸念の安全性をサポートしていますが、遺伝毒性イベントが制御体外環境に宿主細胞の情報伝達を制限することによって軽減されます。このメソッドを実行すると、門脈内自家移植と再導入される肝細胞への暴露を制限するとき、無料ベクトルがホストに導入決して全身。
このレポートでは、手術の方法と分離肝細胞遺伝子療法前のヴィヴォと後続の自家移植12 HT 1 豚8の治療のために使用される前のヴィヴォプロシージャについて説明します。完全なプロセスには 1) 肝細胞と肝臓のホストの成長刺激の源、2) 遺伝子補正前のヴィヴォ、最終的に 3) の再導入に続いて摘出した肝臓から肝細胞の分離として機能する部分切除が含まれています、修正された肝細胞は、ホストにバックアップします。説明する方法をいくつか修正して、すべての大型動物モデルに適用されますが、FAH 欠損豚13だけは修正された肝細胞の選択的な環境の利点があります。
Protocol
Representative Results
Discussion
このレポートでは、HT 1 の豚のモデルを治す自己遺伝子ex vivo療法アプローチについて説明します。部分肝切除、肝細胞分離前のヴィヴォと分離肝細胞の情報伝達に続いて是正遺伝子を運ぶ遺伝子導入ウイルスが含まれます。修正自己肝細胞は門脈8を介して FAH 欠乏動物に戻って、移植されます。説明する方法はいくつかの変更とすべての大動物モデルに適用で?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者はデュアン Meixner の門脈内注入、スティーブ Krage、ジョアン Pederson ロリ Hillin サポート、手術中に行う専門知識をありがちましょう。この作品は、子供の病院のミネソタ州財団と再生医療のミネソタによって支えられました。R.D.H. は、NIH K01 DK106056 賞とメイヨー クリニック センターを通じて再生医学のキャリア開発賞に資金を供給されました。
Materials
| 2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC) | Yecuris | 20-0027 | |
| 12 mm Trocar | Covidien | B12STS | |
| 5 mm Trocar | Covidien | B5SHF | |
| Endo Surgical Stapler 60 | Covidien | EGIA60AMT | |
| Endo Surgical Stapler 45 | Covidien | EGIA45AVM | |
| Endo Surgical Stapler 30 | Covidien | SIG30AVM | |
| Endo catch bag | Covidien | 173050G | |
| 0 PDS | Ethicon | Z340H | |
| 2-0 Vicryl | Ethicon | J459H | |
| 4-0 Vicryl | Ethicon | J426H | |
| Dermabond | Ethicon | DNX12 | Sterile Dressing |
| Williams’-E Powder | Gibco | ME16060P1 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S8875-1KG | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-011-CV | |
| NaCl (g/L) | Sigma Aldrich | S1679-1KG | |
| KCl (g/L) | Sigma Aldrich | P3911-500G | |
| EGTA (g/L) | Oakwood Chemical | 45172 | |
| N-acetyl-L-cysteine | Oakwood Chemical | 3631 | |
| (N-A-C, g/L) | Sigma Aldrich | A9165-100G | |
| CaCl2 2H2O (g/L) | Sigma Aldrich | 223506-500G | |
| Collagenase D (mg/mL) | Crescent Chemical | 17456.2 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Corning | 15-013-CV | |
| Dexamethasone | Fresenius Kabi | NDC6337 | |
| Epidermal Growth Factor | Gibco | PHG0314 |
Referências
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