猪自体移植肝细胞外细胞外细胞基因治疗
Summary
本方案旨在描述猪肝细胞分离和体外基因传递, 通过自体细胞移植治疗代谢疾病模型。虽然这种特殊的模式具有独特的优势, 有利于成功的治疗, 但应用是解决其他疾病和适应症的相关基础。
Abstract
基因治疗是治疗肝脏代谢许多先天错误的理想选择。在体内, 慢病毒载体已成功地用于治疗人类的许多造血疾病, 因为它们的使用提供了稳定的转基因表达, 因为载体能够融入宿主基因组。该方法表明肝细胞体外基因治疗在 i 型遗传性酪氨酸血症大型动物模型中的应用。这个过程包括 1) 从自体供体受者动物中分离原代肝细胞, 2) 通过肝细胞转导和慢病毒载体进行体内基因传递, 以及 3) 通过门静脉移植矫正肝细胞静脉注射。该方法的成功通常取决于有效和无菌地去除肝切除术, 仔细处理切除标本的存活肝细胞足以重新移植, 分离细胞的高百分比转导,无菌外科手术贯穿始终, 以防止感染。在这些步骤中的任何一个步骤的技术故障都将导致用于自体移植或捐献者受者动物感染的活转染肝细胞的低产量。为这种方法选择的人类1型遗传性酪氨酸血症 (ht-1) 的猪模型是唯一适合这种方法, 因为即使是一小部分矫正细胞的植入将导致肝脏的再繁殖与健康的细胞基于强大的相对于本土病肝细胞的选择性优势。虽然这种生长选择并不适用于所有适应症, 但这种方法是扩展到其他适应症的基础, 并允许操纵这种环境, 以解决肝脏内外的其他疾病, 同时控制接触病毒载体和机会的非目标毒性和致瘤性。
Introduction
肝脏代谢的先天错误是一个遗传性疾病的家族, 共同影响多达每800例活产 1.其中许多疾病是单一基因缺陷2 , 可以通过将受影响基因的单一纠正副本引入足够数量的肝细胞3来功能治愈。需要纠正的肝细胞的实际百分比因疾病4而异, 在很大程度上取决于其编码的蛋白质的性质, 例如, 排泄蛋白与细胞质的关系。在大多数情况下, 任何代谢疾病治疗的疗效都很容易通过循环中经常存在的生物标志物来检测。
ht-1 是由富马3-1 乙酸水拉酶 (fah)5的缺陷引起的肝脏代谢的先天错误, 是酪氨酸代谢的最后一步。fah 缺乏导致肝脏中有毒代谢物的积累, 可导致急性肝功能衰竭和死亡, 或慢性形式的疾病可导致肝硬化和肝细胞癌。本病通过 2-(2-硝基-4-四氟甲基苯甲酰)-1, 3-环己二酮 (ntbc) 的管理进行临床管理, 这是一种小分子抑制剂的一种酶上游 fah 在酪氨酸代谢。这种疾病为测试基因治疗方法提供了一个理想的环境, 因为即使是少数肝细胞的成功矫正, 最终也会导致整个肝脏的重新繁殖, 在大小动物模型中都有修正的细胞7.,8. 出现这种情况的原因是, 由于毒性代谢物在未纠正的细胞中积累, 经校正的细胞具有深刻的生存优势。未矫正肝细胞的丢失允许与肝脏再生能力一致的修正肝细胞选择性扩张。治疗后, 可以很容易地测量移植后循环酪氨酸和琥珀酰丙酮水平的下降。
为了证明该程序的侵入性, 其中包括部分肝切除术, 这种方法的目标必须是持久的治疗。因此, 复制不称职的慢病毒载体被使用, 因为他们将稳定地融入肝细胞基因组9。确保随着肝脏的生长和扩张, 将修正后的基因传递给所有的子细胞, 以取代未矫正细胞的快速丢失。这是有利的腺病毒相关 (aav) 载体, 主要存在作为会代体, 只能通过一个单一的子细胞在有丝分裂10 , 从而失去任何效果的治疗在几个星期内。
尽管越来越多的文献支持慢病毒11的安全性, 但通过将宿主细胞的转导限制在受控的体外环境中, 缓解了人们对遗传毒性事件的担忧。自由载体从来没有系统地引入到宿主时, 这种方法进行, 限制暴露于肝细胞, 将通过自体移植通过门静脉重新引入。
本报告介绍了用于分离肝细胞的手术和体外程序的方法, 用于体内基因治疗和随后的自体移植 12治疗 ht-1 猪8。整个过程包括: 1) 部分肝切除术, 作为肝细胞的来源和生长刺激宿主的肝脏, 2) 肝细胞从切除的肝脏, 然后进行体外基因校正, 最后 3) 重新引入修正肝细胞回到宿主。所述方法适用于所有具有一定修饰的大型动物模型, 但只有缺乏 fah 的猪13将具有修正肝细胞的选择性环境的优势。
Protocol
Representative Results
Discussion
本报告介绍了一种治疗猪 ht-1 模型的体外自体基因治疗方法。它包括部分肝切除术, 其次是体外肝细胞分离和分离肝细胞与伦蒂病毒携带纠正转基因。经修正的自体肝细胞然后通过门静脉8移植回 fah 缺乏的动物。虽然所述方法适用于所有经过一定修改的大型动物模型, 但缺乏 fah 的猪具有对校正细胞13,15具有高度选择性的独…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢 duane meixner 在执行门静脉静脉注射方面的专业知识, steve krage、joanne pederson 和 lori hillin 在外科手术期间的支持。这项工作得到了明尼苏达州儿童医院基金会和明尼苏达州再生医学的支持。r. d. h. 的资金来自 nih k01 dk106056 奖和梅奥再生医学职业发展中心奖。
Materials
| 2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC) | Yecuris | 20-0027 | |
| 12 mm Trocar | Covidien | B12STS | |
| 5 mm Trocar | Covidien | B5SHF | |
| Endo Surgical Stapler 60 | Covidien | EGIA60AMT | |
| Endo Surgical Stapler 45 | Covidien | EGIA45AVM | |
| Endo Surgical Stapler 30 | Covidien | SIG30AVM | |
| Endo catch bag | Covidien | 173050G | |
| 0 PDS | Ethicon | Z340H | |
| 2-0 Vicryl | Ethicon | J459H | |
| 4-0 Vicryl | Ethicon | J426H | |
| Dermabond | Ethicon | DNX12 | Sterile Dressing |
| Williams’-E Powder | Gibco | ME16060P1 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S8875-1KG | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-011-CV | |
| NaCl (g/L) | Sigma Aldrich | S1679-1KG | |
| KCl (g/L) | Sigma Aldrich | P3911-500G | |
| EGTA (g/L) | Oakwood Chemical | 45172 | |
| N-acetyl-L-cysteine | Oakwood Chemical | 3631 | |
| (N-A-C, g/L) | Sigma Aldrich | A9165-100G | |
| CaCl2 2H2O (g/L) | Sigma Aldrich | 223506-500G | |
| Collagenase D (mg/mL) | Crescent Chemical | 17456.2 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Corning | 15-013-CV | |
| Dexamethasone | Fresenius Kabi | NDC6337 | |
| Epidermal Growth Factor | Gibco | PHG0314 |
Referências
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