Particulas de Lentivirus terapia gênica mediada por vetor de hepatócitos Ex Vivo para transplante autólogo em suínos
Summary
Este protocolo destina-se a descrever o hepatócito porcina isolamento e ex vivo gene entrega para curar modelos de doenças metabólicas através do transplante de células autólogas. Embora este modelo em particular beneficia de vantagens únicas que favorecem a terapia bem sucedida, o aplicativo é uma Fundação relevante para tratar doenças adicionais e indicações.
Abstract
Terapia gênica é a escolha ideal para curar muitos erros inatos do metabolismo do fígado. Ex-vivo, vetores de Lentivirus terem sido utilizadas com sucesso no tratamento de muitas doenças hematopoiéticas em seres humanos, sua utilização oferece a expressão do transgene estável devido à capacidade do vetor para integrar o genoma do hospedeiro. Este método demonstra a aplicação ex vivo da terapia do gene dos hepatócitos para uma grande modelo animal de tirosinemia hereditária tipo eu. Este processo consiste em 1) isolamento dos hepatócitos primários do animal doador/beneficiário autólogo, 2) ex vivo entrega de gene via transdução de hepatócitos com um vetor de Lentivirus e 3) autólogo transplante de hepatócitos corrigidos através do portal injeção da veia. Sucesso do método baseia-se geralmente em cima da remoção eficiente e estéril da ressecção hepática, cuidadosa de manipulação do espécime extirpado para isolamento dos hepatócitos viáveis suficientes para transdução re-engrafting, alta porcentagem de células isoladas, e procedimentos cirúrgicos assépticos por toda parte para prevenir a infecção. Falha técnica em qualquer dessas etapas irá resultar em baixo rendimento dos hepatócitos transduzidos viáveis para transplante autólogo ou infecção do animal doador/beneficiário. O modelo de porco de tirosinemia hereditária humana tipo 1 (HT-1) escolhido para esta abordagem é excepcionalmente favorável para tal método, como até mesmo uma pequena porcentagem de enxertia das células corrigidas levará para repovoamento do fígado com células saudáveis com base em um poderoso vantagem seletiva sobre hepatócitos nativo-doentes. Embora esta selecção de crescimento não será verdadeira para todas as indicações, esta abordagem é uma Fundação para expansão em outras indicações e permite a manipulação deste ambiente para tratar doenças adicionais, ambos dentro do fígado e para além dele, enquanto controle para a exposição ao vetor viral e oportunidade para toxicidade fora do alvo e tumorigenicidade.
Introduction
Erros inatos do metabolismo do fígado são uma família de doenças genéticas que afetam coletivamente como muitos como 1 em 800 nascidos vivos1. Muitas destas doenças são único gene defeitos2 e podem ser curadas funcionalmente através da introdução de uma única cópia corrigida do gene afetado em um número suficiente de hepatócitos3. Percentagem efectiva de hepatócitos que precisa ser corrigido varia de acordo com a doença de4 e é largamente dependente da natureza da proteína que ele codifica, por exemplo, excretadas proteínas contra citoplasmática. Na maioria dos casos, a eficácia de qualquer tratamento para a doença metabólica é facilmente analisada através da presença de biomarcadores, muitas vezes disponíveis na circulação.
HT-1 é um erro inato do metabolismo do fígado que resulta de um defeito no fumarylacetoacetate hidrolase (FAH)5, a última etapa enzimática em tirosina metabolismo6. Deficiência de FAH conduz a compilação de metabólitos tóxicos no fígado que pode causar morte e insuficiência hepática aguda ou na forma crônica da doença pode causar cirrose e carcinoma hepatocelular. Clinicamente, a doença é gerenciada pela administração de 2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC), um inibidor de pequenas moléculas de uma enzima montante de FAH no metabolismo da tirosina. A doença fornece um ambiente ideal testar métodos de terapia de gene, como correção de sucesso de até mesmo um pequeno número de hepatócitos eventualmente resultará no repovoamento do fígado inteiro com células corrigidas em modelos animais pequenos e grandes 7 , 8. isso ocorre porque corrigido as células têm uma vantagem de sobrevivência profunda sobre células não corrigidas devido ao acúmulo de metabólitos tóxicos no último. A perda de hepatócitos não corrigidas permite a expansão seletiva dos hepatócitos corrigidos consistente com a capacidade regenerativa do fígado. Tratamento pode ser seguido facilmente medindo a diminuição nos níveis de tirosina e succinylacetone após transplante circulante.
Para justificar a natureza invasiva do procedimento, que inclui uma hepatectomy parcial, o objectivo desta abordagem deve ser uma cura durável. Portanto, vetores de Lentivirus incompetente de replicação são usados porque eles estàvel integrará no hepatócito genoma9. garantindo a entrega do gene corrigida de todas as células-filhas como o fígado cresce e se expande para substituir a rápida perda de células não corrigidas. Isto é vantajoso sobre vetores virais adeno-associado (AAV), que existe principalmente como episomes que só podem ser passados para uma única célula-filha durante a mitose10 , perdendo assim qualquer efeito da terapia em questão de semanas.
Apesar de um crescente corpo de literatura oferece suporte a segurança de lentivirus11, preocupações sobre genotóxicos eventos são atenuados, limitando a transdução das células do hospedeiro a um ambiente controlado em vitro . Vetor livre nunca sistemicamente é introduzido para o host quando este método é executado, limitar a exposição para os hepatócitos que será re-introduzida com transplante autólogo através da veia portal.
Este relatório descreve o método da cirúrgica e procedimentos ex vivo usados para isolar os hepatócitos para gene terapia ex vivo e posterior transplante autólogo12 para o tratamento do porco HT-18. O processo completo inclui 1) uma hepatectomy parcial que serve como uma fonte de hepatócitos e um estímulo de crescimento para o fígado do hospedeiro, 2) isolamento dos hepatócitos do fígado extirpado seguido por ex vivo correção do gene e, finalmente, 3) reintrodução do hepatócitos corrigidos de volta para o host. O método descrito é aplicável a todos os modelos animais grandes, com algumas modificações, mas apenas o FAH-deficiente porco13 terá a vantagem do ambiente seletivo para hepatócitos corrigidos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este relatório descreve uma ex vivo gene autólogo terapia abordagem para curar um modelo suíno de HT-1. Envolve uma hepatectomy parcial, seguido por ex vivo hepatócito isolamento e transdução de hepatócitos isolados com lenti vírus carregando o transgene corretivo. Hepatócitos autólogos corrigidos então são transplantados para o animal deficiente FAH através da veia porta8. Embora o método descrito é aplicável a todos os modelos animais grandes, com algumas modifi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecer o Duane Meixner expertise em realizar a injeção de veia porta, Steve Krage, Joanne Pederson e Lori Hillin pelo apoio durante os procedimentos cirúrgicos. Este trabalho foi apoiado pelo Hospital de Minnesota Foundation e Minnesota medicina regenerativa das crianças. R.D.H. era financiado por um prêmio de NIH K01 DK106056 e um centro da clínica de Mayo para a concessão do desenvolvimento da carreira da medicina regenerativa.
Materials
| 2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC) | Yecuris | 20-0027 | |
| 12 mm Trocar | Covidien | B12STS | |
| 5 mm Trocar | Covidien | B5SHF | |
| Endo Surgical Stapler 60 | Covidien | EGIA60AMT | |
| Endo Surgical Stapler 45 | Covidien | EGIA45AVM | |
| Endo Surgical Stapler 30 | Covidien | SIG30AVM | |
| Endo catch bag | Covidien | 173050G | |
| 0 PDS | Ethicon | Z340H | |
| 2-0 Vicryl | Ethicon | J459H | |
| 4-0 Vicryl | Ethicon | J426H | |
| Dermabond | Ethicon | DNX12 | Sterile Dressing |
| Williams’-E Powder | Gibco | ME16060P1 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S8875-1KG | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-011-CV | |
| NaCl (g/L) | Sigma Aldrich | S1679-1KG | |
| KCl (g/L) | Sigma Aldrich | P3911-500G | |
| EGTA (g/L) | Oakwood Chemical | 45172 | |
| N-acetyl-L-cysteine | Oakwood Chemical | 3631 | |
| (N-A-C, g/L) | Sigma Aldrich | A9165-100G | |
| CaCl2 2H2O (g/L) | Sigma Aldrich | 223506-500G | |
| Collagenase D (mg/mL) | Crescent Chemical | 17456.2 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Corning | 15-013-CV | |
| Dexamethasone | Fresenius Kabi | NDC6337 | |
| Epidermal Growth Factor | Gibco | PHG0314 |
Referências
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