돼지에서 자가 이식 Hepatocytes 전 비보 의 lentiviral 벡터 중재 된 유전자 치료
Summary
이 프로토콜은 돼지 hepatocyte 격리와 ex vivo 유전자 배달 모델 autologous 세포 이식 통해 대사 질환의 치료를 설명 하는 위한 것입니다. 이 특정 모델은 성공적인 치료를 선호 하는 독특한 장점, 있지만 응용 프로그램은 추가 질병 징후를 해결 하기 위해 관련 기초 이다.
Abstract
유전자 치료는 치료 많은 선된 천 성 간 물질 대사의 이상적인 선택 이다. Ex vivo, lentiviral 벡터 사용 되었습니다 성공적으로 인 간에, 많은 조 혈 질환의 치료에 그들의 사용은 주인 게놈으로 통합 하는 벡터의 능력으로 인해 안정적인 transgene 식으로. 이 메서드는 유전 tyrosinemia 형식의 큰 동물 모델에 ex vivo 유전자 치료 hepatocytes의의 응용 프로그램을 보여 줍니다 나. 헌 혈 기증자/받는 동물, 2에서에서 기본 hepatocytes의 1) 절연 이루어져이 프로세스) ex vivo 유전자 배달 hepatocyte 변환 lentiviral 벡터와 포털을 통해 수정된 hepatocytes의 3) 헌 식을 통해 사출 맥락 메서드의 성공 일반적으로 간 절제, 격리 된 셀의 다시 engrafting, 높은 백분율 변환에 대 한 충분 한 실행 가능한 hepatocytes의 격리에 대 한 삭제 견본 취급 주의의 효율적이 고 살 균 제거에 의존 하 고 전체 감염을 방지 하기 위해 무 균 수술 절차입니다. 이 단계에서 기술적인 실패 자가 이식 가능한 불리고 hepatocytes의 낮은 수익률 또는 기증자/받는 사람 동물의 감염 발생 합니다. 인간의 유형 1 유전 tyrosinemia (HT-1)이이 접근에 대 한 선택의 돼지 모델은 이러한 메서드를 고유 하 게 의무가 engraftment 수정된 세포의 심지어 작은 비율 간 repopulation 건강 한 세포는 강력한 기반으로 이어질 것으로 기본 병 hepatocytes에 선택적인 이점입니다. 성장 선택이 모든 표시에 대 한 사실이 되지 않을 것입니다, 하지만이 방법은 다른 표시로 확장을 위한 기초 이며 추가 질병, 간 내에서 모두 해결 하 고 넘어, 동안에이 환경 조작할 수 있습니다. 바이러스 성 벡터와 오프 대상 독성 및 tumorigenicity에 대 한 기회에 대 한 노출 제어.
Introduction
선된 천 성 간 물질 대사의 총칭 1에 800 생존 출생1만큼 영향을 미치는 유전 질환의 가족입니다. 이 질병의 많은 단일 유전자 결함2 고 hepatocytes3의 충분 한 수에 영향을 받는 유전자의 단일 수정 된 복사본을 도입 하 여 기능적으로 치료 될 수 있습니다. 수정 해야 hepatocytes의 실제 비율 질병4 에 의해 변화 하 고 인코딩, 단백질 세포질 대 예 배설된 단백질의 특성에 크게 좌우 됩니다. 대부분의 경우, 신진 대사 질환에 대 한 어떤 치료의 효능은 순환에서 자주 사용할 수 있는 바이오 마커의 존재를 통해 쉽게 분석 됩니다.
HT-1은 fumarylacetoacetate 가수분해 효소 (파)5결함, 티로신 물질 대사6의 마지막 효소 단계에서 결과 간 대사의 선천적인된 오류가. 파 결핍 리드 빌드 급성 간 기능 장애 및 사망을 일으킬 수 있습니다 또는 질병의 만성 모양에서 경 변 증 및 간세포 암 하면 간 독성 대사 산물의. 질병은 임상 2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC), 효소 상류 파의 티로신 물질 대사에서의 작은 분자 억제 물의 행정에 의해 관리 됩니다. Hepatocytes의도 적은 수의 성공적인 교정 결국 모두 크고 작은 동물 모델에 수정 된 셀의 전체 간 repopulation에 발생 질병 유전자 치료 방법, 테스트할 수 있는 이상적인 환경을 제공 합니다. 7 , 8.이 때문에 발생 합니다 수정 세포는 깊은 생존 이점을 독성 대사 산물의 축적으로 인해 수정 되지 않은 셀에서 후자. 수정 되지 않은 hepatocytes의 손실 수 있습니다 수정된 hepatocytes의 선택적 확장 간 재생 용량와 일치. 치료는 쉽게 순환 이식 다음 티로신 및 succinylacetone 수준에 감소를 측정 하 여 다음 수 있습니다.
부분 hepatectomy 포함, 절차의 침략 적인 본질을 정당화 하기 위해이 방법의 목표 내구성 치료 해야 합니다. 따라서, 복제 무능 한 lentiviral 벡터 때문에 그들은 안정적으로 hepatocyte 게놈9를 통합할 것 이다 데 사용 됩니다. 간으로 모든 딸 세포에는 수정 된 유전자의 배달 보장 성장 하 고 확장 합니다 수정 되지 않은 세포의 급속 한 손실 대체. 이 주로 유사 분열10 주만 치료의 어떤 효력 든 지 그로 인하여 잃는 동안 단일 딸 세포에 전달 될 수 있는 episomes로 존재 adeno 관련 바이러스 (AAV) 벡터에 유리 하다.
문학의 성장 시체 위에 lentivirus11, 관심사의 안전 지원 하지만 차적인 이벤트 환경 제어 생체 외에서 호스트 셀 변환 제한 하 여 완화 됩니다. 이 방법은 수행 되는 문맥을 통해 헌 이식으로 다시 소개 될 hepatocytes에 노출 제한 무료 벡터 적 체계적으로 호스트에 도입 되었습니다.
이 보고서는 수술의 방법 및 절차 ex vivo 유전자 치료 비보 전 을 위한 hepatocytes와 HT-1 돼지8의 치료에 대 한 후속 헌 이식12 를 격리 하는 데 사용에 대해 설명 합니다. 1) 부분 hepatectomy hepatocytes와 호스트의 간 성장 자극의 근원, 2) 삭제 간 뒤에 ex vivo 유전자 보정, 그리고 마지막으로 3)의 재 소개부터에서 hepatocytes의 절연 역할을 포함 하는 전체 프로세스는 수정된 hepatocytes 호스트에 다시. 설명 하는 방법을 몇 가지 수정, 모든 큰 동물 모델에 적용 됩니다 하지만 파 불충분 한 돼지13 수정된 hepatocytes에 대 한 선택적 환경 활용 해야한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 보고서에는 비보 전 헌 유전자 치료 접근을 돼지 모델 HT-1의 치료를 설명 합니다. 그것은 교정 transgene 들고 lenti 바이러스 비보 전 hepatocyte 고립과 격리 hepatocytes의 변환 다음 부분 hepatectomy 포함. 수정된 헌 hepatocytes는 다음 다시 문맥8파 결핍 동물에 이식 됩니다. 설명 하는 방법을 몇 가지 수정 모든 큰 동물 모델에 적용 됩니다, 하지만 파 불충분 한 돼지는 매우 ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 전문성 수술 절차 동안 지원을 위한 포털 정 맥 주입, 스티브 Krage, 조 앤 로버츠, 그리고로 리 Hillin를 수행에 대 한 드 웨인 Meixner을 감사 합니다. 이 작품은 어린이 병원의 미네소타 기초 및 재생 의학 미네소타에 의해 지원 되었다. R.D.H. 재생 의학 경력 개발 상을 위한 NIH K01 DK106056 보너스와 메이 요 클리닉 센터를 통해 투자 되었다.
Materials
| 2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC) | Yecuris | 20-0027 | |
| 12 mm Trocar | Covidien | B12STS | |
| 5 mm Trocar | Covidien | B5SHF | |
| Endo Surgical Stapler 60 | Covidien | EGIA60AMT | |
| Endo Surgical Stapler 45 | Covidien | EGIA45AVM | |
| Endo Surgical Stapler 30 | Covidien | SIG30AVM | |
| Endo catch bag | Covidien | 173050G | |
| 0 PDS | Ethicon | Z340H | |
| 2-0 Vicryl | Ethicon | J459H | |
| 4-0 Vicryl | Ethicon | J426H | |
| Dermabond | Ethicon | DNX12 | Sterile Dressing |
| Williams’-E Powder | Gibco | ME16060P1 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S8875-1KG | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-011-CV | |
| NaCl (g/L) | Sigma Aldrich | S1679-1KG | |
| KCl (g/L) | Sigma Aldrich | P3911-500G | |
| EGTA (g/L) | Oakwood Chemical | 45172 | |
| N-acetyl-L-cysteine | Oakwood Chemical | 3631 | |
| (N-A-C, g/L) | Sigma Aldrich | A9165-100G | |
| CaCl2 2H2O (g/L) | Sigma Aldrich | 223506-500G | |
| Collagenase D (mg/mL) | Crescent Chemical | 17456.2 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Corning | 15-013-CV | |
| Dexamethasone | Fresenius Kabi | NDC6337 | |
| Epidermal Growth Factor | Gibco | PHG0314 |
Referências
- Mak, C. M., Lee, H. C., Chan, A. Y., Lam, C. W. Inborn errors of metabolism and expanded newborn screening: review and update. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 50 (6), 142-162 (2013).
- Hansen, K., Horslen, S. Metabolic liver disease in children. Liver Transplantation. 14 (5), 713-733 (2008).
- Schneller, J. L., Lee, C. M., Bao, G., Venditti, C. P. Genome editing for inborn errors of metabolism: advancing towards the clinic. BMC Medicine. 15 (1), 43 (2017).
- Brunetti-Pierri, N. Gene therapy for inborn errors of liver metabolism: progress towards clinical applications. Italian Journal of Pediatrics. 34 (1), 2 (2008).
- Carlson, D. F., et al. Efficient TALEN-mediated gene knockout in livestock. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (43), 17382-17387 (2012).
- Lindblad, B., Lindstedt, S., Steen, G. On the enzymic defects in hereditary tyrosinemia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (10), 4641-4645 (1977).
- Hickey, R. D., et al. Noninvasive 3-dimensional imaging of liver regeneration in a mouse model of hereditary tyrosinemia type 1 using the sodium iodide symporter gene. Liver Transplantation. 21 (4), 442-453 (2015).
- Hickey, R. D., et al. Curative ex vivo liver-directed gene therapy in a pig model of hereditary tyrosinemia type 1. Science Translational Medicine. 8 (349), (2016).
- Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272 (5259), 263-267 (1996).
- Bouard, D., Alazard-Dany, D., Cosset, F. L. Viral vectors: from virology to transgene expression. British Journal of Pharmacology. 157 (2), 153-165 (2009).
- Sakuma, T., Barry, M. A., Ikeda, Y. Lentiviral vectors: basic to translational. Biochemical Journal. 443 (3), 603-618 (2012).
- Chowdhury, J. R., et al. Long-term improvement of hypercholesterolemia after ex vivo gene therapy in LDLR-deficient rabbits. Science. 254 (5039), 1802-1805 (1991).
- Elgilani, F., et al. Chronic Phenotype Characterization of a Large-Animal Model of Hereditary Tyrosinemia Type 1. The American Journal of Pathology. 187 (1), 33-41 (2017).
- Patyshakuliyeva, A., et al. Carbohydrate utilization and metabolism is highly differentiated in Agaricus bisporus. BMC Genomics. 14, 663 (2013).
- Hickey, R. D., et al. Fumarylacetoacetate hydrolase deficient pigs are a novel large animal model of metabolic liver disease. Stem Cell Research. 13 (1), 144-153 (2014).
