Лентивирусные вектор опосредованной генотерапии гепатоцитов Ex Vivo аутологичной трансплантации в свиней
Summary
Этот протокол предназначен для описания свиных гепатоцитов изоляции и ex vivo гена доставки вылечить модели метаболических заболеваний через трансплантация аутологичных клеток. Хотя эта конкретная модель имеет уникальные преимущества, которые способствуют успешной терапии, является применение соответствующей основой для решения дополнительных заболеваний и указаний.
Abstract
Генная терапия является идеальным выбором для лечения многие врожденные дефекты метаболизма печени. Экс vivo, лентивирусные векторы успешно используются в лечении многих кроветворных заболеваний в организме человека, как их использование обеспечивает стабильное трансген выражение благодаря вектор способность интегрироваться в хост геномов. Этот метод демонстрируется применение ex vivo генной терапии гепатоцитов к большой животной модели наследственных Тирозинемия типа I. Этот процесс состоит из 1) изоляции первичных гепатоцитов из аутологичной доноров/получателей помощи животным, 2) ex vivo гена доставки через гепатоцитов трансдукция с лентивирусные вектор и 3) аутологичной трансплантации исправленные гепатоцитов через портал вен инъекций. Успех метода обычно опирается на эффективный и стерильные удаления резекции печени, тщательной обработке подакцизным образца для изоляции жизнеспособных гепатоцитов достаточно для повторного голокоренные, высокий процент трансдукции изолированных клеток, и Асептические хирургические процедуры по всему для предотвращения инфекции. Технический сбой в любой из этих шагов приведет к низкой урожайностью жизнеспособных transduced гепатоцитов аутологичной трансплантации или заражения животного доноров/получателей помощи. Свинья модель наследственной Тирозинемия человека типа 1 (HT-1) выбрали для этого подхода является однозначно поддаются такой метод, как даже небольшой процент приживления исправленные клеток приведет к заселения печени с здоровые клетки, основанный на мощный Селективное преимущество над родной больной гепатоцитов. Хотя этот рост выбор не будет справедливо для всех указаний, этот подход является основой для расширения в другие показания и позволяет для манипулирования этой среды для решения дополнительных заболеваний, как в печени и за ее пределами, в то время как контроль за воздействием вирусный вектор и возможность пробить токсичности и tumorigenicity.
Introduction
Врожденные дефекты метаболизма печени — семейство генетических заболеваний, которые коллективно затрагивают как многие, как 1 в 800 живорожденных1. Многие из этих заболеваний одного гена дефекты2 и функционально могут быть вылечены путем введения одной исправленные копии гена пострадавших в достаточное количество гепатоцитов3. Фактический процент гепатоцитов, которые необходимо исправить варьируется в зависимости от заболевания4 и в значительной степени зависит от характера белка, который кодирует, например, экскретируется белки против цитоплазмы. В большинстве случаев эффективность любого лечения для метаболических заболеваний легко assayed через присутствие биомаркеров часто доступны в циркуляции.
HT-1 является врожденным ошибка метаболизма в печени, что приводит к от дефекта в fumarylacetoacetate гидролазы (ФА)5, последний шаг ферментативные тирозин метаболизм6. FAH дефицит приводит к построению токсичных метаболитов в печени, что может привести к острой печеночной недостаточности и смерти или в хронической формы болезни могут вызвать цирроз и гепатоцеллюлярной карциномы. Заболевание клинически управляется администрацией 2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC), малые молекулы ингибитора фермента вверх по течению от ФА в метаболизме тирозина. Заболевание представляет собой идеальную среду для проверки методов генной терапии, как успешной коррекции даже небольшое количество гепатоцитов в конечном итоге приведет к заселения всей печени с исправленной ячейки в больших и малых животных моделях 7 , 8. это происходит потому, что исправить клетки имеют глубокие выживания преимущество над нескорректированной клетки за счет накопления токсичных метаболитов в последнем. Потеря нескорректированной гепатоцитов позволяет для выборочного расширения исправленные гепатоцитов в соответствии с регенеративной способностью печени. Лечение может легко следовать измерения сокращение циркулирующих тирозин и succinylacetone уровнях, после трансплантации.
Для того, чтобы оправдать захватнический характер процедуры, которая включает в себя частичной гепатектомии, Цель этого подхода должен быть прочный лечения. Таким образом некомпетентных лентивирусные векторы репликации используются потому, что они будут стабильно интегрироваться в геном гепатоцитов9. обеспечение доставки исправленные гена для всех дочерних клеток в печени растет и расширяется заменить быстрой потери нескорректированной клеток. Это выгодно над адено связанных вирусных векторов (AAV), которые существуют главным образом как episomes, которые могут передаваться только на одну ячейку дочь во время митоза10 тем самым потерять любой эффект терапии в течение нескольких недель.
Несмотря на растущий объем литературы поддерживает безопасность человека11, опасения за генотоксичных события смягчаются путем ограничения трансдукции клеток хозяина в среде с контролируемой в пробирке . Бесплатные Векторные вводится никогда не системно принимающей страны при выполнении этого метода, ограничивая воздействие гепатоцитов, которые будет вновь внесен с аутологичной трансплантацией через воротной вены.
Этот доклад описывает метод хирургического и ex vivo процедуры, используемые для изоляции гепатоцитов для генной терапии ex vivo и12 последующих аутологичной трансплантации для лечения свинья HT-18. Весь процесс включает в себя 1) частичной гепатектомии, который служит источником гепатоцитов и стимулом роста для печени хоста, 2) изоляции гепатоцитов из подакцизным печени, следуют ex vivo гена коррекции и, наконец, 3) реинтродукция исправленные гепатоцитов обратно в узле. Метод, описанный для всех крупных животных моделей с некоторыми изменениями, но только свинья фа недостаточным13 будет иметь преимущество выборочного среды для исправленной гепатоцитов.
Protocol
Representative Results
Discussion
В настоящем докладе описываются ex vivo аутологичной генной терапии подход к вылечить свинину модель HT-1. Она включает в себя частичной гепатектомии, следуют ex vivo изоляции гепатоцитов и трансдукция изолированных гепатоцитов с вирусом lenti, проведение корректирующих трансген. Исп?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Дуэйн Meixner за профессионализм в выполнении инъекций воротной вены, Стив Краке, Джоан Педерсон и Лори Hillin для поддержки во время хирургических процедур. Эта работа была поддержана Детская больница Миннесота фонда и регенеративной медицины Миннесота. R.D.H. финансировалась через центр клиники Майо и NIH K01 DK106056 награду для регенеративной медицины премии развития карьеры.
Materials
| 2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC) | Yecuris | 20-0027 | |
| 12 mm Trocar | Covidien | B12STS | |
| 5 mm Trocar | Covidien | B5SHF | |
| Endo Surgical Stapler 60 | Covidien | EGIA60AMT | |
| Endo Surgical Stapler 45 | Covidien | EGIA45AVM | |
| Endo Surgical Stapler 30 | Covidien | SIG30AVM | |
| Endo catch bag | Covidien | 173050G | |
| 0 PDS | Ethicon | Z340H | |
| 2-0 Vicryl | Ethicon | J459H | |
| 4-0 Vicryl | Ethicon | J426H | |
| Dermabond | Ethicon | DNX12 | Sterile Dressing |
| Williams’-E Powder | Gibco | ME16060P1 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S8875-1KG | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-011-CV | |
| NaCl (g/L) | Sigma Aldrich | S1679-1KG | |
| KCl (g/L) | Sigma Aldrich | P3911-500G | |
| EGTA (g/L) | Oakwood Chemical | 45172 | |
| N-acetyl-L-cysteine | Oakwood Chemical | 3631 | |
| (N-A-C, g/L) | Sigma Aldrich | A9165-100G | |
| CaCl2 2H2O (g/L) | Sigma Aldrich | 223506-500G | |
| Collagenase D (mg/mL) | Crescent Chemical | 17456.2 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Corning | 15-013-CV | |
| Dexamethasone | Fresenius Kabi | NDC6337 | |
| Epidermal Growth Factor | Gibco | PHG0314 |
Referências
- Mak, C. M., Lee, H. C., Chan, A. Y., Lam, C. W. Inborn errors of metabolism and expanded newborn screening: review and update. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 50 (6), 142-162 (2013).
- Hansen, K., Horslen, S. Metabolic liver disease in children. Liver Transplantation. 14 (5), 713-733 (2008).
- Schneller, J. L., Lee, C. M., Bao, G., Venditti, C. P. Genome editing for inborn errors of metabolism: advancing towards the clinic. BMC Medicine. 15 (1), 43 (2017).
- Brunetti-Pierri, N. Gene therapy for inborn errors of liver metabolism: progress towards clinical applications. Italian Journal of Pediatrics. 34 (1), 2 (2008).
- Carlson, D. F., et al. Efficient TALEN-mediated gene knockout in livestock. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (43), 17382-17387 (2012).
- Lindblad, B., Lindstedt, S., Steen, G. On the enzymic defects in hereditary tyrosinemia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (10), 4641-4645 (1977).
- Hickey, R. D., et al. Noninvasive 3-dimensional imaging of liver regeneration in a mouse model of hereditary tyrosinemia type 1 using the sodium iodide symporter gene. Liver Transplantation. 21 (4), 442-453 (2015).
- Hickey, R. D., et al. Curative ex vivo liver-directed gene therapy in a pig model of hereditary tyrosinemia type 1. Science Translational Medicine. 8 (349), (2016).
- Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272 (5259), 263-267 (1996).
- Bouard, D., Alazard-Dany, D., Cosset, F. L. Viral vectors: from virology to transgene expression. British Journal of Pharmacology. 157 (2), 153-165 (2009).
- Sakuma, T., Barry, M. A., Ikeda, Y. Lentiviral vectors: basic to translational. Biochemical Journal. 443 (3), 603-618 (2012).
- Chowdhury, J. R., et al. Long-term improvement of hypercholesterolemia after ex vivo gene therapy in LDLR-deficient rabbits. Science. 254 (5039), 1802-1805 (1991).
- Elgilani, F., et al. Chronic Phenotype Characterization of a Large-Animal Model of Hereditary Tyrosinemia Type 1. The American Journal of Pathology. 187 (1), 33-41 (2017).
- Patyshakuliyeva, A., et al. Carbohydrate utilization and metabolism is highly differentiated in Agaricus bisporus. BMC Genomics. 14, 663 (2013).
- Hickey, R. D., et al. Fumarylacetoacetate hydrolase deficient pigs are a novel large animal model of metabolic liver disease. Stem Cell Research. 13 (1), 144-153 (2014).
