Lentivirali terapia genica mediata da vettore di epatociti Ex Vivo per trapianto autologo nei suini
Summary
Questo protocollo è destinato per descrivere la consegna di porcino dell’epatocita isolamento ed ex vivo del gene per curare modelli di malattie metaboliche tramite trapianto autologous della cellula. Anche se questo particolare modello gode di vantaggi unici che favoriscono la riuscita terapia, l’applicazione è una Fondazione pertinente all’indirizzo di indicazioni e altre malattie.
Abstract
La terapia genica è una scelta ideale per curare molti errori congeniti del metabolismo del fegato. Ex-vivo, vettori lentivirali sono stati utilizzati con successo nel trattamento di molte malattie ematopoietiche in esseri umani, come il loro utilizzo offre l’espressione del transgene stabile grazie alla capacità del vettore di integrare nel genoma ospite. Questo metodo viene illustrata l’applicazione di ex vivo terapia genica degli epatociti a un grande modello animale della tirosinemia ereditaria di tipo I. Questo processo è costituito da 1) isolamento di epatociti primari dall’animale autologo donatore/ricevente, 2) ex vivo consegna del gene tramite trasduzione degli epatociti con un vettore lentivirale e 3) autologo trapianto di epatociti corretti tramite portale della vena di iniezione. Successo del metodo si basa generalmente su rimozione efficiente e sterile della resezione epatica, un’attenta gestione dell’esemplare asportato per l’isolamento degli epatociti vitali sufficienti per trasduzione del ri-innesto, ad alta percentuale di cellule isolate, e procedure chirurgiche asettiche in tutto per prevenire l’infezione. Guasto tecnico presso uno di questi passaggi si tradurrà in basso rendimento degli epatociti trasdotte praticabili per trapianto autologo o infezione dell’animale donatore/ricevente. Il modello di maiale di tirosinemia ereditaria di tipo 1 umano (HT-1) scelto per questo approccio è unicamente suscettibile di tale metodo, come anche una piccola percentuale di attecchimento di cellule corrette porterà alla ripopolazione del fegato con le cellule sane, basate su un potente vantaggio selettivo negli epatociti nativo-malato. Anche se questa selezione di crescita non sarà vera per tutte le indicazioni, questo approccio è una Fondazione per l’espansione in altre indicazioni e permette per la manipolazione di questo ambiente di affrontare ulteriori malattie, sia all’interno del fegato e oltre, controllo per l’esposizione al vettore virale e opportunità per fuori bersaglio tossicità e carcinogenicità.
Introduction
Errori congeniti del metabolismo del fegato sono una famiglia di malattie genetiche che colpiscono collettivamente altretanto come 1 in 800 nati vivi1. Molte di queste malattie sono singolo gene difetti2 e può essere curate in modo funzionale con l’introduzione di una singola copia corretta del gene interessato in un numero sufficiente di epatociti3. La percentuale effettiva di epatociti che deve essere corretto varia a seconda della malattia4 e dipende in larga misura la natura della proteina che codifica, ad esempio, viene escreta proteine contro citoplasmico. Nella maggior parte dei casi, l’efficacia di qualsiasi trattamento per la malattia metabolica è facilmente analizzato attraverso la presenza di biomarcatori spesso disponibile nella circolazione.
HT-1 è un errore innato del metabolismo del fegato che deriva da un difetto in fumarylacetoacetate idrolasi (FAH)5, l’ultimo passaggio enzimatico in tirosina metabolismo6. Deficit di FAH conduce alla generazione di metaboliti tossici nel fegato che può causare morte e insufficienza epatica acuta o in forma cronica della malattia possono causare cirrosi e carcinoma epatocellulare. La malattia è clinicamente gestita dall’amministrazione di 2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC), un inibitore di piccola molecola di un enzima a Monte di FAH nel metabolismo della tirosina. La malattia fornisce un ambiente ideale in cui sperimentare tecniche di terapia genica, come riuscita correzione di anche un piccolo numero di epatociti alla fine si tradurrà nel ripopolamento del fegato intero con cellule corrette nei modelli animali piccoli e grandi 7 , 8. ciò si verifica perché rettificato le cellule hanno un vantaggio di sopravvivenza profonda sopra cellule non corrette a causa dell’accumulo di metaboliti tossici in quest’ultimo. La perdita degli epatociti non corretti consente l’espansione selettiva degli epatociti corretti coerenza con la capacità rigenerativa del fegato. Il trattamento può essere seguito facilmente misurando la diminuzione nei livelli di tirosina ed eritrocitaria dopo trapianto di circolazione.
Al fine di giustificare la natura invasiva della procedura, che comprende un’epatectomia parziale, l’obiettivo di questo approccio deve essere una cura durevole. Pertanto, vettori lentivirali incompetente replica vengono utilizzati perché saranno integrati stabilmente nel genoma dell’epatocita9. garantire la consegna del gene corretto per tutte le cellule della figlia come il fegato cresce e si espande per sostituire la perdita rapida di cellule non rivedute. Questo è vantaggioso su vettori virali adeno associato (AAV), che esiste principalmente come episomi che possono essere passati solo a una singola cella della figlia durante la mitosi10 perdendo così qualsiasi effetto della terapia in poche settimane.
Anche se un corpo crescente di letteratura supporta la sicurezza di lentivirus11, preoccupazioni su eventi genotossici sono mitigati limitando la trasduzione di cellule dell’ospite in un ambiente controllato in vitro . Vettore libero mai sistemica è introdotto all’host quando questo metodo viene eseguito, limitando l’esposizione agli epatociti che sarà reintrodotto con trapianto autologo tramite la vena portale.
Questo rapporto descrive il metodo di chirurgica ed ex vivo le procedure utilizzate per isolare gli epatociti per terapia genica ex vivo e il conseguente trapianto autologo12 per il trattamento del maiale HT-18. Il processo completo include 1) un’epatectomia parziale che serve come fonte di epatociti e un stimolo di crescita per fegato dell’host, 2) isolamento degli epatociti dal fegato asportato seguita da ex vivo correzione genica e infine 3) reintroduzione della epatociti corretti nuovamente dentro l’host. Il metodo descritto è applicabile a tutti i grandi modelli animali con alcune modifiche, ma solo il maiale di FAH-carenti13 avrà il vantaggio dell’ambiente selettivo per gli epatociti corretti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo rapporto descrive un ex vivo autologo approccio di terapia genica per curare un modello porcino di HT-1. Si tratta di un’epatectomia parziale, seguita da ex vivo dell’epatocita isolamento e trasduzione di epatociti isolati con lenti virus che trasportano il transgene correttivo. Corretti gli epatociti autologhi sono poi trapiantati torna all’animale carente di FAH attraverso la vena porta8. Anche se il metodo descritto è applicabile a tutti i grandi modelli animali con al…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Duane Meixner per competenza nell’eseguire l’iniezione della vena portale, Steve Krage, Joanne Pederson e Lori Hillin per assistenza durante le procedure chirurgiche. Questo lavoro è stato supportato dalla Fondazione dell’ospedale del Minnesota Minnesota di medicina rigenerativa e dei bambini. R.D.H. è stato finanziato attraverso un premio NIH K01 DK106056 e un Mayo Clinic Center per medicina rigenerativa Career Development Award.
Materials
| 2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC) | Yecuris | 20-0027 | |
| 12 mm Trocar | Covidien | B12STS | |
| 5 mm Trocar | Covidien | B5SHF | |
| Endo Surgical Stapler 60 | Covidien | EGIA60AMT | |
| Endo Surgical Stapler 45 | Covidien | EGIA45AVM | |
| Endo Surgical Stapler 30 | Covidien | SIG30AVM | |
| Endo catch bag | Covidien | 173050G | |
| 0 PDS | Ethicon | Z340H | |
| 2-0 Vicryl | Ethicon | J459H | |
| 4-0 Vicryl | Ethicon | J426H | |
| Dermabond | Ethicon | DNX12 | Sterile Dressing |
| Williams’-E Powder | Gibco | ME16060P1 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S8875-1KG | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-011-CV | |
| NaCl (g/L) | Sigma Aldrich | S1679-1KG | |
| KCl (g/L) | Sigma Aldrich | P3911-500G | |
| EGTA (g/L) | Oakwood Chemical | 45172 | |
| N-acetyl-L-cysteine | Oakwood Chemical | 3631 | |
| (N-A-C, g/L) | Sigma Aldrich | A9165-100G | |
| CaCl2 2H2O (g/L) | Sigma Aldrich | 223506-500G | |
| Collagenase D (mg/mL) | Crescent Chemical | 17456.2 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Corning | 15-013-CV | |
| Dexamethasone | Fresenius Kabi | NDC6337 | |
| Epidermal Growth Factor | Gibco | PHG0314 |
Referências
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