Lentivirale Vektor-vermittelte Gentherapie von Hepatozyten Ex Vivo für autologe Transplantation bei Schweinen
Summary
Dieses Protokoll soll porcinen Hepatozyten Isolierung und ex-Vivo gen Lieferung um Modelle der metabolischen Krankheiten durch autologe Stammzelltransplantation heilen zu beschreiben. Obwohl dieses Modell einzigartige Vorteile, die erfolgreichen Therapie bevorzugen genießt, ist die Anwendung eine relevante Grundlage um weitere Krankheiten und Indikationen.
Abstract
Gentherapie ist eine ideale Wahl um viele angeborene Fehler des Stoffwechsels der Leber zu heilen. Ex-Vivo, Lentivirale Vektoren haben erfolgreich eingesetzt bei der Behandlung vieler hämatopoetischer Erkrankungen beim Menschen, da ihre Verwendung bietet stabile Transgene Ausdruck durch den Vektor Fähigkeit in das Wirtsgenom integrieren. Diese Methode demonstriert die Anwendung der ex Vivo Gentherapie von Hepatozyten, ein großes Tier Modell des erblichen Tyrosinemia Typ ich. Dieser Prozess besteht aus 1) Isolierung der primäre Hepatozyten von autologen Empfängerin/Tier, 2) ex Vivo gen Lieferung per Hepatozyten Transduktion Lentivirale Vektor mit 3) autologe Transplantation von korrigierten Hepatozyten-Portal Vene Injektion. Erfolg der Methode im allgemeinen stützt sich auf effiziente und sterile Entfernung der Leber Resektion, sorgfältiger Umgang mit der ausgeschnittenen Probe zur Isolierung von lebensfähigen Hepatozyten für wieder anwachsen, hochprozentigen Transduktion der isolierten Zellen ausreichend und aseptische Eingriffe durchweg um Infektionen zu vermeiden. Technisches Versagen bei jedem dieser Schritte führt zu niedrigen Ertrag von lebensfähigen ausgestrahlt Hepatozyten für autologe Transplantation oder Infektion des Tieres Spender/Empfänger. Das Schwein-Modell des menschlichen Typ 1 erbliche Tyrosinemia (HT-1) für diese Vorgehensweise gewählt ist eindeutig eine solche Methode, zugänglicher, wie auch ein kleiner Prozentsatz der Engraftment korrigierten Zellen zur Wiederbesiedlung der Leber mit gesunden Zellen basierend auf einem leistungsstarken führt selektiven Vorteil gegenüber Native-Kranke Hepatozyten. Obwohl dieses Wachstum-Auswahl nicht wahr für alle Indikationen werden, dieser Ansatz ist eine Grundlage für die Expansion in andere Indikationen und ermöglicht die Manipulation dieser Umgebung zu Adresse zusätzliche Krankheiten, sowohl in der Leber und darüber hinaus, während Steuerung für die Exposition gegenüber viralen Vektoren und Gelegenheit für Ziel-Toxizität und Tumorigenität.
Introduction
Angeborene Fehler der Stoffwechsel der Leber sind eine Familie von Erbkrankheiten, die gemeinsam so viele wie 1 in 800 Lebendgeburten1betreffen. Viele dieser Krankheiten sind einzelne gen Mängel2 und funktional durch die Einführung einer einzigen korrigierten Kopie des betroffenen Gens in einer ausreichenden Anzahl von Hepatozyten3geheilt werden können. Der tatsächliche Prozentsatz der Hepatozyten, die korrigiert werden muss hängt von der Krankheit4 und ist weitgehend abhängig von der Art des Proteins, die es kodiert, zum Beispiel ausgeschiedenen Proteine gegen cytoplasmatische. In den meisten Fällen ist Wirksamkeit einer Behandlung für metabolische Krankheit leicht durch das Vorhandensein von Biomarkern, die oftmals auch in der Zirkulation untersucht.
HT-1 ist eine angeborene Fehler der Stoffwechsel der Leber, die durch einen Defekt im Fumarylacetoacetate Hydrolase (FAH)5, der letzte enzymatische Schritt in Tyrosin Stoffwechsel6entsteht. FAH-Mangel führt zum Build von toxischen Metaboliten in der Leber, die akutes Leberversagen und Tod verursachen können oder bei der chronischen Form der Erkrankung kann dazu führen, dass Zirrhose und hepatozellulären Karzinom. Die Krankheit wird klinisch durch Gabe von 2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC), ein niedermolekularer Inhibitor eines Enzyms stromaufwärts der FAH in Tyrosin-Stoffwechsel verwaltet. Die Krankheit bietet ein ideales Umfeld, um Gen-Therapie-Methoden zu testen, wie erfolgreiche Korrektur der auch eine kleine Anzahl von Hepatozyten schließlich die Wiederbevölkerung der gesamten Leber mit korrigierten Zellen in kleinen und großen Tiermodellen führt 7 , 8. Dies geschieht, weil korrigiert Zellen haben einen tiefgreifenden Überlebensvorteil gegenüber unkorrigierte Zellen durch die Anhäufung von toxischen Metaboliten in der letzteren. Der Verlust der unkorrigierte Hepatozyten ermöglicht eine selektive Erweiterung korrigierte Hepatozyten entsprechen die Regenerationsfähigkeit der Leber. Behandlung kann leicht verfolgt werden, durch die Messung des Rückgangs der zirkulierenden Tyrosin und Urinspiegel Ebenen nach Transplantation.
Um die invasive Art des Verfahrens, zu rechtfertigen, die eine partielle Hepatektomie enthält, muss das Ziel dieses Ansatzes eine dauerhafte Heilung. Daher werden Replikation inkompetenten Lentivirale Vektoren verwendet, da sie stabil in den Hepatozyten Genom9zu integrieren. Bereitstellung des korrigierten Gens an alle Tochterzellen als die Leber wächst und erweitert um den schnellen Verlust der unkorrigierte Zellen zu ersetzen. Dies ist vorteilhaft über Adeno-verbundene Viren (AAV) Vektoren, bestehen in erster Linie als Episomes, die nur auf eine einzelne Zelle Tochter während der Mitose10 dadurch verlieren jede Wirkung der Therapie in einer Angelegenheit von Wochen übergeben werden können.
Obwohl eine wachsende Zahl von Literatur über die Sicherheit von Lentivirus11, Anliegen unterstützt genotoxische Veranstaltungen gemildert durch die Begrenzung der Transduktion von Wirtszellen zu einer kontrollierten in-vitro- Umgebung. Kostenlose Vektor wird nie systemisch an den Host eingeführt, wenn diese Methode durchgeführt wird, Begrenzung der Exposition gegenüber der Hepatozyten, die mit autologen Transplantation über die Pfortader wieder eingeführt werden.
Dieser Bericht beschreibt die Methode der chirurgischen und ex Vivo Verfahren zum Isolieren von Hepatozyten für Gen-Therapie ex Vivo und anschließende autologe Transplantation12 für die Behandlung des HT-1 Schwein8. Der vollständige Prozess umfasst (1) eine partielle Hepatektomie, das als eine Quelle von Hepatozyten und ein Wachstumsimpulse für die Host Leber, 2) Isolierung der Hepatozyten aus der ausgeschnittenen Leber, gefolgt von ex-Vivo gen Korrektur, und schließlich (3) die Wiedereinführung der dient der korrigierte Hepatozyten zurück in den Host. Das beschriebene Verfahren gilt für alle großen Tiermodellen mit einigen Änderungen, sondern nur die FAH-defizienten Schwein13 haben den Vorteil der selektiven Umweltgutachten korrigierte Hepatozyten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieser Bericht beschreibt eine ex Vivo autologe gen Therapieansatz um ein porcinen Modell HT-1 zu heilen. Es geht um eine partielle Hepatektomie, gefolgt von ex-Vivo Hepatozyten Isolation und Transduktion von isolierten Hepatozyten mit Lenti Virus tragen das korrigierende Transgen. Korrigierte autologe Hepatozyten sind dann zurück zum FAH mangelhaft Tier durch die Pfortader8transplantiert. Obwohl die beschriebenen Verfahren auf alle großen Tiermodellen mit einigen Änderungen a…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Duane Meixner für Kompetenz bei der Durchführung der Pfortader Einspritzung, Steve Krage, Joanne Pederson und Lori Hillin für Unterstützung bei chirurgischen Eingriffen. Diese Arbeit wurde durch die Kinder Krankenhaus von Minnesota-Stiftung und Regenerationsmedizin Minnesota unterstützt. R.D.H. wurde durch eine NIH K01 DK106056 Award und eine Mayo-Klinik-Zentrum für Regenerative Medizin Career Development Award finanziert.
Materials
| 2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC) | Yecuris | 20-0027 | |
| 12 mm Trocar | Covidien | B12STS | |
| 5 mm Trocar | Covidien | B5SHF | |
| Endo Surgical Stapler 60 | Covidien | EGIA60AMT | |
| Endo Surgical Stapler 45 | Covidien | EGIA45AVM | |
| Endo Surgical Stapler 30 | Covidien | SIG30AVM | |
| Endo catch bag | Covidien | 173050G | |
| 0 PDS | Ethicon | Z340H | |
| 2-0 Vicryl | Ethicon | J459H | |
| 4-0 Vicryl | Ethicon | J426H | |
| Dermabond | Ethicon | DNX12 | Sterile Dressing |
| Williams’-E Powder | Gibco | ME16060P1 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S8875-1KG | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-011-CV | |
| NaCl (g/L) | Sigma Aldrich | S1679-1KG | |
| KCl (g/L) | Sigma Aldrich | P3911-500G | |
| EGTA (g/L) | Oakwood Chemical | 45172 | |
| N-acetyl-L-cysteine | Oakwood Chemical | 3631 | |
| (N-A-C, g/L) | Sigma Aldrich | A9165-100G | |
| CaCl2 2H2O (g/L) | Sigma Aldrich | 223506-500G | |
| Collagenase D (mg/mL) | Crescent Chemical | 17456.2 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Corning | 15-013-CV | |
| Dexamethasone | Fresenius Kabi | NDC6337 | |
| Epidermal Growth Factor | Gibco | PHG0314 |
Referências
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