Lentiviral Vector-mediert genterapi av hepatocytter Ex Vivo for autolog transplantasjon i svin
Summary
Denne protokollen er ment å beskrive svin hepatocyte isolasjon og ex vivo gen levering å kurere modeller av metabolske sykdommer via autologous cellen transplantasjon. Selv om denne modellen har unike fordeler som favoriserer vellykket behandling, er programmet et relevant grunnlag for å ta flere sykdommer og indikasjoner.
Abstract
Genterapi er et ideelt valg å kurere mange medfødte feil av metabolism i leveren. Ex-vivo, lentiviral vektorer har blitt brukt med hell i behandlingen av mange blodkreft sykdommer hos mennesker, som deres bruk tilbyr stabile transgene uttrykket på grunn av vektoren evne til å integrere i vert genomet. Denne metoden viser bruk av ex vivo genterapi hepatocytes til en stor dyr modell av arvelige tyrosinemia type jeg. Denne prosessen består av 1) isolasjon primære hepatocytes fra autologous donor/mottaker dyret, 2) ex vivo gen levering via hepatocyte signaltransduksjon med lentiviral vektor og 3) autolog transplantasjon korrigert hepatocytes via portalen vene injeksjon. Suksessen til metoden generelt avhengig av effektiv og sterile fjerning av leveren resection, forsiktig håndtering av forbrukeravgift prøven for isolering av levedyktig hepatocytter tilstrekkelig for nytt engrafting, høy andel signaltransduksjon isolert cellene, og aseptiske kirurgiske prosedyrer gjennom å hindre infeksjon. Teknisk svikt på noen av disse trinnene vil føre lav yield hepatocytes levedyktig transduced for autolog transplantasjon eller infeksjon av donor/mottaker dyret. Gris modell av menneskelig type 1 arvelig tyrosinemia (HT-1) valgt for denne tilnærmingen er unikt mottakelig for slik metode, som selv en liten prosentandel av engraftment korrigert celler vil føre til repopulation i leveren sunn cellene basert på en kraftig selektiv fordel over native-syke hepatocytter. Selv om dette vekst valget ikke vil være sant for alle indikasjoner, denne tilnærmingen er et grunnlag for ekspansjon i andre indikasjoner og gir mulighet for manipulasjon av dette miljøet å ta flere sykdommer, både i leveren og utover, mens kontrollere for eksponering for viral vektor og mulighet for off-målet giftighet og tumorigenicity.
Introduction
Medfødte feil av metabolism av leveren er en familie av genetiske sykdommer som kollektivt påvirker så mange som 1 i 800 levendefødte1. Mange av disse sykdommene er ett gen mangler2 og funksjonelt kan kureres ved å introdusere én korrigert kopi av berørte genet til et tilstrekkelig antall hepatocytter3. Den faktiske prosenten av hepatocytter som må rettes varierer fra sykdom4 , og er svært avhengig av typen protein det koder, for eksempel utskilles proteiner versus cytoplasmatiske. I de fleste tilfeller er effekten av behandling for metabolsk sykdom lett assayed gjennom tilstedeværelse av biomarkers ofte tilgjengelig i sirkulasjon.
HT-1 er en medfødt feil av metabolismen av leveren som skyldes en feil i fumarylacetoacetate hydrolase (FAH)5, siste enzymatisk trinn i tyrosin metabolisme6. FAH mangel fører til bygge av giftige metabolitter i leveren som kan forårsake akutt leversvikt og død eller i kronisk form av sykdommen kan føre til skrumplever og hepatocellulært karsinom. Sykdommen er klinisk styrt av administrasjonen av 2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC), et lite molekyl inhibitor av et enzym oppstrøms av FAH i tyrosin metabolisme. Sykdommen gir et ideelt miljø å teste gene terapi metoder, som vellykket korrigering av selv en liten antallet av hepatocytter vil resultere i repopulation i hele leveren med korrigert celler i både små og store dyr modeller 7 , 8. Dette skjer fordi korrigert celler har en dyp overlevelse fordel over uncorrected celler på grunn av opphopning av giftige metabolitter i sistnevnte. Tap av uncorrected hepatocytter tillater selektiv ekspansjon korrigert hepatocytes samsvar med regenerativ kapasiteten til leveren. Behandling kan lett følges ved å måle nedgangen i sirkulerende tyrosin og succinylacetone nivåer etter transplantasjon.
For å rettferdiggjøre invasiv art på prosedyren, som inneholder en delvis hepatectomy, må målet av denne tilnærmingen være en holdbar kur. Derfor brukes replikering inkompetente lentiviral vektorer fordi de vil stabilt integrere i hepatocyte genomet9. sikre levering av korrigert genet til alle datter celler som leveren vokser og utvides for å erstatte rask tap uncorrected celler. Dette er en fordel over adeno assosiert virus (AAV) vektorer, som hovedsakelig finnes som episomes bare kan bli sendt til en enkeltcelle datter under mitose10 og dermed miste noen effekt av terapi i løpet av uker.
Selv om en økende mengde litteratur støtter sikkerheten til lentivirus11, bekymringer over kontrollere gentoksisk hendelser ved å begrense Albin på verten cellene til et kontrollert i vitro miljø. Gratis vector er aldri systemisk introdusert til verten når denne metoden utføres, begrense eksponering for hepatocytter som vil bli re-introdusert med autolog transplantasjon via portalen blodåre.
Denne rapporten beskriver metoden for den kirurgiske og ex vivo prosedyrer brukes til å isolere hepatocytter for gene terapi ex vivo og påfølgende autolog transplantasjon12 for behandling av HT-1 gris8. Den fullstendige prosessen inkluderer 1) en delvis hepatectomy som fungerer som en kilde til hepatocytter og vekst stimulans for vertens leveren, 2) isolering av hepatocytter fra forbrukeravgift leveren etterfulgt av ex vivo genet korreksjon, og til slutt 3) gjeninnføring av den korrigert hepatocytter tilbake til verten. Metoden beskrevet gjelder alle store dyr modeller med noen endring, men bare FAH dårlig gris13 vil ha fordelen av selektiv miljøet for korrigert hepatocytter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne rapporten beskriver en ex vivo autologous gene terapi tilnærming for å kurere en porcine modell av HT-1. Det innebærer en delvis hepatectomy, etterfulgt av ex vivo hepatocyte isolasjon og signaltransduksjon isolert hepatocytes med lenti virus bærer den korrigerende transgene. Korrigert autologous hepatocytter er deretter transplanted til FAH mangelfull dyret til portalen blodåre8. Selv om metoden beskrevet gjelder alle store dyr modeller med noe modifisering, har FAH d…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Duane Meixner for kompetanse i å utføre i portalen blodåre injeksjon, Steve Krage, Joanne Pederson og Lori Hillin for støtte under de kirurgiske prosedyrene. Dette arbeidet ble støttet av barnas Hospital of Minnesota Foundation og regenerativ medisin Minnesota. R.D.H. ble finansiert gjennom en NIH K01 DK106056 pris og et Mayo Clinic for regenerativ medisin karriere Development Award.
Materials
| 2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC) | Yecuris | 20-0027 | |
| 12 mm Trocar | Covidien | B12STS | |
| 5 mm Trocar | Covidien | B5SHF | |
| Endo Surgical Stapler 60 | Covidien | EGIA60AMT | |
| Endo Surgical Stapler 45 | Covidien | EGIA45AVM | |
| Endo Surgical Stapler 30 | Covidien | SIG30AVM | |
| Endo catch bag | Covidien | 173050G | |
| 0 PDS | Ethicon | Z340H | |
| 2-0 Vicryl | Ethicon | J459H | |
| 4-0 Vicryl | Ethicon | J426H | |
| Dermabond | Ethicon | DNX12 | Sterile Dressing |
| Williams’-E Powder | Gibco | ME16060P1 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S8875-1KG | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-011-CV | |
| NaCl (g/L) | Sigma Aldrich | S1679-1KG | |
| KCl (g/L) | Sigma Aldrich | P3911-500G | |
| EGTA (g/L) | Oakwood Chemical | 45172 | |
| N-acetyl-L-cysteine | Oakwood Chemical | 3631 | |
| (N-A-C, g/L) | Sigma Aldrich | A9165-100G | |
| CaCl2 2H2O (g/L) | Sigma Aldrich | 223506-500G | |
| Collagenase D (mg/mL) | Crescent Chemical | 17456.2 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Corning | 15-013-CV | |
| Dexamethasone | Fresenius Kabi | NDC6337 | |
| Epidermal Growth Factor | Gibco | PHG0314 |
Referências
- Mak, C. M., Lee, H. C., Chan, A. Y., Lam, C. W. Inborn errors of metabolism and expanded newborn screening: review and update. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 50 (6), 142-162 (2013).
- Hansen, K., Horslen, S. Metabolic liver disease in children. Liver Transplantation. 14 (5), 713-733 (2008).
- Schneller, J. L., Lee, C. M., Bao, G., Venditti, C. P. Genome editing for inborn errors of metabolism: advancing towards the clinic. BMC Medicine. 15 (1), 43 (2017).
- Brunetti-Pierri, N. Gene therapy for inborn errors of liver metabolism: progress towards clinical applications. Italian Journal of Pediatrics. 34 (1), 2 (2008).
- Carlson, D. F., et al. Efficient TALEN-mediated gene knockout in livestock. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (43), 17382-17387 (2012).
- Lindblad, B., Lindstedt, S., Steen, G. On the enzymic defects in hereditary tyrosinemia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (10), 4641-4645 (1977).
- Hickey, R. D., et al. Noninvasive 3-dimensional imaging of liver regeneration in a mouse model of hereditary tyrosinemia type 1 using the sodium iodide symporter gene. Liver Transplantation. 21 (4), 442-453 (2015).
- Hickey, R. D., et al. Curative ex vivo liver-directed gene therapy in a pig model of hereditary tyrosinemia type 1. Science Translational Medicine. 8 (349), (2016).
- Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272 (5259), 263-267 (1996).
- Bouard, D., Alazard-Dany, D., Cosset, F. L. Viral vectors: from virology to transgene expression. British Journal of Pharmacology. 157 (2), 153-165 (2009).
- Sakuma, T., Barry, M. A., Ikeda, Y. Lentiviral vectors: basic to translational. Biochemical Journal. 443 (3), 603-618 (2012).
- Chowdhury, J. R., et al. Long-term improvement of hypercholesterolemia after ex vivo gene therapy in LDLR-deficient rabbits. Science. 254 (5039), 1802-1805 (1991).
- Elgilani, F., et al. Chronic Phenotype Characterization of a Large-Animal Model of Hereditary Tyrosinemia Type 1. The American Journal of Pathology. 187 (1), 33-41 (2017).
- Patyshakuliyeva, A., et al. Carbohydrate utilization and metabolism is highly differentiated in Agaricus bisporus. BMC Genomics. 14, 663 (2013).
- Hickey, R. D., et al. Fumarylacetoacetate hydrolase deficient pigs are a novel large animal model of metabolic liver disease. Stem Cell Research. 13 (1), 144-153 (2014).
