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Biology

Wirkung von fluoreszierenden Proteinen auf Fusion Partner mit Trinukleotiderkrankungen Toxizität Assays in Hefe

Published: November 28, 2018 doi: 10.3791/58748
Automatic Translation
1, 2, 1, 1,2, 1
1Department of Anatomy and Cell Biology, University of Western Ontario, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Western Ontario

Summary

Dieser Artikel beschreibt Protokolle, um die Wirkung von fluoreszierenden Proteinen auf die Aggregation und Toxizität von fehlgefaltete Trinukleotiderkrankungen Erweiterung für die schnelle Bewertung eines neu Fußgelenkes fluoreszierenden Proteins im Rahmen des fluoreszierenden Reporter zu bewerten.

Abstract

Für die Untersuchung von Protein-Lokalisierung und Menschenhandel mit live Cell Imaging setzen Forscher oft auf Absicherung ihrer Protein des Interesses zu einem fluoreszierenden Reporter. Die ständig weiterentwickelnde Liste der genetisch codierten fluoreszierende Proteine (FPs) präsentiert Benutzer mit mehreren Alternativen, wenn es um fluoreszierende Fusion Design kommt. Jedes FP hat bestimmte optische und Biophysikalische Eigenschaften, die die biochemischen, zellulären und funktionellen Eigenschaften der daraus resultierenden fluoreszierenden Fusionen beeinträchtigen können. Zum Beispiel mehrere FPs tendenziell unspezifische Oligomere bilden, die auf die Funktion der Fusion Partner behindern anfällig sind. Leider gibt es nur wenige Methoden, um die Auswirkungen der FPs auf das Verhalten des fluoreszierenden Reporters zu testen. Hier beschreiben wir eine einfache Methode, die es ermöglicht die schnelle Bewertung der Auswirkungen der FPs mit Trinukleotiderkrankungen (PolyQ) Toxizität Assays in der angehenden Hefe Saccharomyces Cerevisiae. PolyQ erweitert Huntingtin-Proteine sind verbunden mit dem Beginn der Huntington-Krankheit (HD), wo die erweiterten Huntingtin in toxischen Oligomeren und Einschlusskörperchen aggregiert. Die Aggregation und Toxizität von PolyQ Erweiterungen in der Hefe sind stark abhängig von der PolyQ-Region, einschließlich das Vorhandensein von fluoreszierenden Tags, wodurch eine ideale experimentelle Plattform zur Untersuchung der Auswirkungen von FPs auf das Verhalten der flankierenden Sequenzen ihre Fusion Partner.

Introduction

Da die ursprüngliche Charakterisierung der das grün fluoreszierende Protein (GFP) aus Aequorea Victoria1, eine breite Palette von genetisch codierte FPs sind entwickelt worden, so dass Zellbiologen, gleichzeitig zu lokalisieren und zu verfolgen mehrere zelluläre Ereignisse/Proteine in lebenden Zellen2,3. FPs stammen aus mehreren Organismen, von Quallen, Korallen, und daher spezielle biophysikalische Anzeigeeigenschaften, die ausführlich über ihre jeweiligen Fluoreszenzspektrum abzulenken. Zu diesen Eigenschaften gehören Helligkeit, Photostabilität und eine Tendenz, unter anderem2,4oligomerize. Auswahl der Monomere FPs ist ein wichtiger Aspekt bei der Auswahl eines geeigneten Tags beim Entwerfen einer fluoreszierenden Reporter, um unangemessene Interaktionen und Veränderungen von der Fusion Partnerrolle zu minimieren und maximieren die Effizienz der Reporter für eine zelluläre Fach4,5,6gegeben. Während GFP hat, im Laufe der Zeit entwickelt wurde, um Minimierung der Auswirkungen der Fusion Partner5,7,8, das fluoreszierende Tag hinzufügen wie neue FP-Varianten im Vergleich zu GFP bleibt schwer zu beurteilen.

Einige Methoden existieren, um das Verhalten der FPs charakterisieren. Die meisten von ihnen beinhalten Tests Biophysikalische Eigenschaften von FPs mit biochemischen Ansätzen, wie z. B. Ultrazentrifugation und gel Filtration Protokolle9,10,11,12. Solche Methoden haben die Einschränkung der Verwendung von gereinigten FPs in Lösung und bieten Einblick in ihr Verhalten in intakten Zellen. Die Entwicklung der organisierten glatte endoplasmatische Retikulum (OSER) Assay Angebote Zellen eine messbare Bewertung der FPs tendenziell in lebenden oligomerize13 von testen, ob der überexprimieren FPs endoplasmatische Retikulum Tubuli in reorganisieren OSER Quirlen14. Diese Technik kann erfolgreich Änderungen zwischen Monomeren und Oligomere Varianten der GLP und anderen FPs erkennen. Aber es stützt sich vor allem auf Überexpression in vorübergehend transfizierten Zellen, und die Quantifizierung und Bildanalyse können zeitaufwändig sein, es sei denn, die Technik als automatisierte Datenerfassung und Analyse Workflow angenommen wird.

Um diese Ansätze zu ergänzen, haben wir eine Probe, die die Wirkung von fluoreszierenden Tags zur Toxizität und Aggregation von PolyQ Erweiterungen in Hefe15,16nutzt. Der Ausbau der PolyQ Strecke mit mehr als 36 wiederholt innerhalb der ersten Exon Gene kodieren, das Huntingtin (Htt) mit Chorea Huntington17,18verbunden ist. Der Ausdruck des erweiterten Httex1 in Hefe führt zu einer starken Aggregation fehlgefaltete Htt-Protein gekoppelt mit einem starken Wachstum defekt. Interessanterweise sind diese Phänotypen flankieren die PolyQ Strecke, einschließlich FPs15,16Sequenzen stark beeinflusst. Es wurde rationalisiert, dass die verschiedenen Eigenschaften der FPs differentiell PolyQ Toxizität in der Hefe beeinflussen können. In der Tat haben im Vergleich zu GFP-wie FPs, rot fluoreszierende Proteine und ihre entwickelten Formen eine geringere Toxizität und Aggregation16gezeigt. Diese Handschrift enthält ein detailliertes Protokoll zur Beurteilung der Wirkung der nächsten Generation von FPs auf PolyQ Toxizität und Aggregation in der Hefe. Dieser Assay ermöglicht eine schnelle und potenziell hohen Inhalt Analyse von FP-Varianten, die parallel verwendet werden können, vorher gekennzeichnet Techniken für die optimale Charakterisierung von neuen FPs und kann beurteilen, wie sie im Vergleich zu GFP durchführen.

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Protocol

1. Generation des neuen Eindringmittel Tagged Httex1 Reporter für einen Ausdruck in der Hefe

Hinweis: In diesem Abschnitt wurde aus dem Protokoll von Jiang Et Al. modifiziert 16 und Albakri Et al. 19.

  1. Design-Primer an die Reihenfolge, die Codierung der fluoreszierenden Proteins oder Zinsen durch PCR verstärken. Der forward Primer gehören eine Leader-Sequenz um das Restriktionsenzym während der Verdauung (GATC), gefolgt von einer SpeI-Einschränkung-Website (ACTAGT) und 20 Basen flussabwärts von der ATG (mit Ausnahme von ATG) des Gens fluoreszierenden Proteins des Interesses zu unterstützen. Die rückwärts-Primer sollte die Leader-Sequenz (GATC), gefolgt von einer SalI Einschränkung Website (GTCGAC) und die umgekehrte Ergänzung 20 Basen stromaufwärts von Stopcodon der FP-Sequenz (einschließlich Stop) enthalten.
  2. Die Primer in Schritt 1.1, gestaltet mit die PCR-Reaktion mit einem Thermocycler mit den folgenden Einstellungen durchführen: Hitze bis 95 ° C für 1 min und Zyklus bei 95 ° C für 30 s, 60 ° C für 30 s und 72 ° C für 2 min pro kB des PCR-Produktes. Durchführung von 18 Zyklen ist ausreichend.
  3. Die PCR-Reaktion auf einem Agarosegel (0,5 % im Tris-Acetat-EDTA) ausgeführt. Es sollte ein einzelnes Band der erwarteten Größe entspricht. Das Fragment mit einem Gel-Reinigung-Kit zu isolieren.
  4. Das Protokoll beschäftigt einen Httex1 Vektor mit 25 (ungiftig) und 72 (HD-assoziiert, zeigt eine starke Aggregation) PolyQ wiederholt. Verdauen der PCR-Fragmente und der Vektor mit SpeI und SalI Restriktionsenzyme für 3 h bei 37 ° C.
  5. Reinigen des verdauten Vektors auf einem Agarosegel wie in Schritt 1.3 ausgeführt.
  6. Reinigen Sie die verdaute PCR-Fragment mit einem PCR-Reinigung-Kit.
  7. Die daraus resultierende verdaute PCR-Fragment verbinden und p415 -GAL1-Flagge-25/72QpolyQ Plasmide1 mithilfe von T4-Ligase (1 h bei Raumtemperatur). Verwenden Sie eine 10 µL-Reaktion (1 µL T4 Enzym, 1 µL 10 X Puffer 6 µL des PCR-Fragments und 2 µL Vektor).
  8. 2 µL der Ligatur Reaktion in 50 µL von Escherichia colizu verwandeln-kompetente Zellen und inkubieren sie für 30 min auf Eis. Dann Hitze-Schock die Zellen bei 42 ° C für 30 s. Add 1 mL SOC Auswuchs Medien und Inkubation bei 37 ° C für 1 h in einen Shaker geben. Platte 200 µL der Reaktion auf eine LB-Agar-Platte mit 100 µg/mL Ampicillin. Über Nacht inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C.
  9. Wählen Sie drei individuelle Bakterienkolonien, wachsen sie über Nacht in 3 mL LB-Bouillon mit 100 µg/mL Ampicillin bei 37 ° C in einen Shaker geben und extrahieren Sie das Plasmid DNA mit einem Plasmid-Reinigung-Kit zu.
  10. Das Plasmid überprüfen, indem Sie verdauen 500 ng DNA mit Restriktionsenzymen SpeI und SalI für 1 h bei 37 ° C und die Reaktion auf eine Agarosegel (0,5 % im Tris-Acetat-EDTA) ausführen. Auf die richtige Größe des Vektors (~ 7 kb) und der Einsatz werden zwei Bands (Größe variiert je nach das gen des Interesses). Überprüfen Sie anschließend, das Plasmid durch Sequenzierung.
  11. Die p415 -GAL1-Flagge- PolyQ-FP Plasmide in der Hefestamm W303 nach einem standard Hefe Umwandlung Protokoll Nr.2zu verwandeln.

(2) Schmierblutungen Assay

  1. Streifen die Hefe klont tragenden 25Q/72Q mit dem Stichwort der FP auf eine Agarplatte mit Hefe-Auswahl-Media (synthetische komplette-SC ohne Leucin) mit Glukose als die Kohlenstoffquelle. Zum gleichen Zeitpunkt auch Streifen Sie 25Q/72Q-YmsfGFP als Positivkontrolle dienen.
    Hinweis: 25Q/72Q Konstrukte, die keinen fluoreszierenden Tag enthalten sind nicht giftig und können als negative Kontrolle dienen.
  2. Inkubieren Sie die Platten bei 30 ° C für 2-3-d.
  3. Wählen Sie bis zu drei einzelnen Kolonien von der Platte.
  4. 5 mL SC ergänzt mit 2 % Glukose als die Kohlenstoffquelle zu impfen.
  5. Pellet-200 µL jeder Nacht Kultur und waschen Sie ihn 3 X mit sterilem destilliertem Wasser.
  6. Aufzuwirbeln Sie die Zellen in SC-Medien mit 2 % Galaktose als Kohlenstoffquelle induzieren die Expression von PolyQ Fusionen. Inkubieren Sie die Galaktose, die Medien über bei 30 ° C in ein Rohr Rotator Nacht. Als Kontrolle wiederholen Sie diesen Schritt mithilfe von Glukose-haltigen Medien.
  7. Am nächsten Morgen auszugleichen Zelldichten zu Extinktion bei 600 nm (OD600) von 0,2 in 100 µL SC Medien in einem sterilen 96-Well-Platte.
  8. Bereiten Sie vier Fünffache Verdünnungen von jeder Probe mit sterilem Wasser durch Pipettieren 20 µL der Probe aus dem vorherigen hinein 80 µL der Medien in den nächsten gut.
  9. Verwenden Sie eine Hefe anheften Werkzeug zu erkennen die Zellen auf selektive Teller (mit Glukose oder Galaktose) und inkubieren Sie bei 30 ° C für 2 d.
  10. Bild der Platten mit einem Bild-Dokumentation-Gerät.

3. Quantifizierung des Zellwachstums in Flüssigkultur

  1. Bereiten Sie die Zellkulturen, folgende Schritte 2.1-2.5 dieses Protokolls.
  2. Messen Sie die OD600 mit einem Spektralphotometer.
  3. Verdünnen Sie die Zellen, die eine OD600 von 0,1 in 300 µL der Medien in einer 96-Well-Platte.
  4. Führen Sie jede Probe in dreifacher Ausfertigung.
  5. Inkubieren Sie die Platte in eine Platte Leser/Inkubator mit schütteln Fähigkeiten. Legen Sie die Anzahl der Proben, die Temperatur auf 30 ° C, die Extinktion bei 600 nm, die Länge der die Experimente bis 24 h und die Messintervalle 15 min, und wählen Sie schütteln Dauerbetrieb.
  6. Erstellen Sie die Wachstumskurve und quantifizieren Sie die Fläche unter der Kurve mit wissenschaftlichen Grafik Software. GraphPad Prism 7 wird empfohlen. Fügen Sie die Daten in eine XY-Tisch mit drei wiederholte Werte. Die Wachstumskurve wird im Ordner " Diagramme " auf der linken Seite angezeigt. Die Fläche unter der Kurve zu quantifizieren, wählen Analyze oben links und klicken Sie auf die Fläche unter der Kurve in XY-Analysen.

(4) Fluoreszenz-Mikroskopie

  1. Bereiten Sie die Zellkulturen, folgende Schritte 2.1-2.5 dieses Protokolls.
  2. Verdünnen Sie die Zellen 10 X im Wachstum Medien und Transfer 200 µL jeder Probe 8-Brunnen bildgebenden Kammern.
  3. Bild der Zellen mit einem konfokalen Mikroskop, ausgestattet mit einem 63 X planen Aprochromoat Ziel (1,4 NA) bei Raumtemperatur.
    Hinweis: Die Verwendung eines konfokalen Mikroskops ist optional. Ein standard Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskop kann auch eingesetzt werden.
  4. Lochkamera und Laser Leistung für optimale Bildaufnahme einstellen. Da die 72Q Aggregate viel heller als das diffuse 25Q Signal sind, ist es oft erforderlich, eine andere Erwerb Einstellung zwischen den verschiedenen Plasmiden zur Vermeidung von Sättigung das Fluoreszenzsignal verwenden.
  5. Bearbeiten Sie die Bilder mit ImageJ20 oder einer anderen Bildverarbeitungs-Software. In diesem Schritt wird der Anteil der Zellen Display Aggregat kann manuell berechnet werden gewünscht.

(5) Dot-Blot

Hinweis: In diesem Protokoll Dot-Blot dient die Proteingehalte Ausdruck zu prüfen. Bereiten Sie die Zellkulturen, folgende Schritte 2.1-2.5 dieses Protokolls.

  1. Generieren Sie Protein Lysates mit Glasperlen in Lyse Puffer (100 mM Tris, pH 7,5, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5 % Glyzerin, 1 mM Dithiothreitol [DTT-]). Protease-Inhibitoren, 4 mM Phenylmethylsulfonyl Fluorid (PSMF) und Protease-Inhibitor cocktail, direkt vor der Verwendung hinzufügen. Pellet-5 mL der Übernacht-Kultur und in 200 µL von Glasperlen und 200 µL Puffer Lyse aufzuwirbeln. Vortex 30 s für 12 Runden. Bei 12.000 X g bei 4 ° C für 10 min Zentrifugieren und den Überstand zu sammeln.
  2. Erkennen einer gleichen Menge von insgesamt Proteine auf eine Nitrocellulose-Membran mit einer Mikrofiltration Apparatur. Prewet der Membran mit PBS und montieren Sie das Gerät. An eine Vakuumquelle schließen Sie an und sicherstellen Sie, dass die Schrauben angezogen werden. Schalten Sie das Vakuum und lassen Sie den Beispiel-Filter durch die Membran durch die Schwerkraft.
  3. Blockieren Sie die Membran in der PBS - 0,05 % Tween/5% fettfreie Milch.
  4. Inkubieren Sie die Membran mit Anti-FLAG Primärantikörper über Nacht bei 4 ° c Die monoklonalen Anti-FLAG-M1 wird empfohlen.
  5. Waschen Sie die Membran 3 X 10 min mit PSB - 0,05 % Tween.
  6. Inkubieren Sie die Membran mit einem Eindringmittel beschrifteten sekundäre Antikörper (Anti-Maus IgG) für 1 h bei Raumtemperatur in der PBS - 0,05 % Tween/5% fettfreie Milch.
  7. Membran 3 x 10 min mit PSB - 0,05 % Tween zu waschen.
  8. Bild-Blot mit einem Immunoblot-Dokumentations-System.

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Representative Results

FPs haben unterschiedliche Biophysikalische Eigenschaften, einschließlich ihrer Tendenz, oligomerize, die das Verhalten ihrer Fusion Partner im Zusammenhang mit fluoreszierenden Reporter beeinflussen können. Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Methode, wo mehrere FPs auf toxische PolyQ Erweiterungen verschmolzen werden kann. Da PolyQ Toxizität stark abhängig von den flankierenden PolyQ Stretch15Sequenzen ist, ermöglicht dieser Test einen schnellen und direkten Vergleich der fluoreszierenden PolyQ Fusion Reporter (Abbildung 1). Eine HD-assoziierte PolyQ Länge (25Q) dient als Negativkontrolle und zeigt keine signifikante Toxizität oder Aggregation15,16,21,22. 72Q wird eingesetzt, um die HD-ähnlichen Phänotypen, einschließlich starkes Wachstum Hemmung und PolyQ Aggregation zu erhalten. Wichtig ist, beschäftigt die Htt-ex1 Codierung Sequenz fehlen die Prolin-reiche Domäne, die die PolyQ-Strecke folgt. Im Beisein der Prolin-reiche Domäne ist Httex1 nicht giftig in Hefe15. In diesem Test wird eine Httex1 verschmolzen zu einer Hefe-optimierte Monomeren Variante Superfolder GFP12 (YmsfGFP)16 als Positivkontrolle als zuvor beschriebenen16verwendet. Die Konstrukte enthalten auch einen FLAG-Epitop-Tag am N-Terminus des Httex1. Dies ermöglicht die Erkennung der verschiedenen Fusionen mit dem gleichen Antikörper (Anti-FLAG) für die biochemische Analyse. Als Proof of Principle 72Q Httex1 mit Hefe-optimierte TagBFP2 verschmolzen (yomTagBFP2)23 führt nicht zu langsames Wachstum gemessen entweder vor Ort Assays auf Agarplatten oder Wachstum in flüssigen Medien (Abbildung 2), darauf hinweist, dass die Natur die fluoreszierende Tags können in der Tat PolyQ Ausdehnungsverhalten in Zellen behindern.

Aggregation der fluoreszierenden PolyQ Fusionen kann mit Fluoreszenz-Mikroskopie bewertet werden. 72Q-YmsfGFP zeigt deutliche Aggregation im Vergleich zu 25Q. Das Fluoreszenzsignal 72-YomTagBFP bleibt jedoch diffuses in das Zytoplasma (Abbildung 3). In den meisten Fällen, es wird nicht empfohlen, verwenden die gleichen Bildeinstellungen Erwerb (Laserleistung, Belichtungszeit), 25Q und 72Q Bilder zu erwerben. Die Aggregate in den 72Q exprimierenden Zellen sind wesentlich heller als das diffuse 25Q Signal. Bedingungen Bildgebung verwendet 72Q Bilder zu erwerben, kann daher das diffuse 25Q Signal erscheinen sehr schwach oder überhaupt nicht sichtbar sein. Entsprechenden Erwerb Einstellungen sollten auch angewendet werden, um die Sättigung der 72Q exprimierenden Zellen während der Bildgebung zu minimieren.

Ausdruck könnten der verschiedenen PolyQ Fusionen Toxizität beeinträchtigen. Waschmittel-unlöslichen amyloiden wie PolyQ Aggregate sind notorisch schwierig, biochemisch zu studieren und eignen sich nicht für eine Analyse von standartisierten SDS-PAGE. Daher können Dot-Blot durchgeführt werden, um Protein-Ebene zu bewerten. Die Einbeziehung des FLAG-Tags am amino-Terminus Ende des Httex1 kann alle fluoreszierenden Fusionen gleichzeitig, trotz der Anwesenheit von FPs (Abbildung 4). Alternativ kann Waschmittel semi-denaturierenden Agarose-Gelelektrophorese (SDD-Alter) durchgeführt werden, um die Bildung von PolyQ Oligomere16zu bewerten. Ein ausführliches Protokoll und Video sind in Halfmann und Lindquist24erhältlich.

Figure 1
Abbildung 1: Workflow-Diagramm für die Analyse der Wirkung von fluoreszierenden Protein-Tag auf die Aggregation und Toxizität von PolyQ Erweiterung Proteine in der Hefe. Erstens sind FPs in Hefe Expressionsvektoren Codierung eine Galaktose-induzierbaren Version der Flagge markiert Httex1 beherbergen entweder 25Q kloniert (ungiftig) oder 72Q (HD-assoziierten, aggregieren und giftige) wiederholt. Klone sind ausgewählt und durch Sequenzierung überprüft und anschließend in der Hefe verwandelt. Nach der Induktion der PolyQ Fusion Ausdruck durch Inkubation in Galaktose-haltigen Medien, entweder spotting Assays auf Agarplatten oder flüssigen Wachstumsmedien kann die PolyQ Toxizität bewerten. PolyQ Aggregation wird durch Fluoreszenz-Mikroskopie analysiert. Ein relativer Ausdruck der verschiedenen Konstrukte ist mittels Dot-Blot. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Repräsentative Wachstum Untersuchungsergebnisse nach der Ausdruck der Httex1 fluoreszierende Fusionen in der Hefe. Hefe mit dem Ausdruck entweder 25Q oder 72Q Httex1 verschmolzen, YmsfGFP oder YomTagBFP wurde in Glukose (Kontrolle) kultiviert oder Galaktose Medien (PolyQ-induzierten) über Nacht und entweder (A) auf Agarplatten oder (B) entdeckt inkubierten weiter in Flüssigkeit Medien zu Wachstum unter verschiedenen Bedingungen zu bewerten. Während 72Q-YmsfGFP einen deutliches Wachstum Mangel induziert, zeigt 72Q-YomTagBFP einen Wachstum Phänotyp ähnlich wie ungiftig 25Q Pendants. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Repräsentative fluoreszierende Bilder Httex1 fluoreszierende Fusionen in der Hefe. Hefe mit dem Ausdruck entweder 25Q oder 72Q Httex1 verschmolzen, YmsfGFP oder YomTagBFP wurde in Glukose (Kontrolle) kultiviert oder Galaktose Medien (PolyQ-induzierten) über Nacht und mit einem konfokalen Mikroskop abgebildet. Während die 72Q-YmsfGFP Ausdruck einer starken PolyQ Proteinaggregation ergibt, zeigt 72Q-YomTagBFP ein diffuses zytoplasmatischen Signal ähnlich wie ungiftig 25Q Pendants. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Repräsentative Dot blot Analyse Httex1 fluoreszierende Fusion Ausdrucksformen in der Hefe. Hefe mit dem Ausdruck ihrer 25Q, 46Q, 72Q oder 103Q Httex1 mit GFP verschmolzen war über Nacht in Galaktose Medien (PolyQ-induzierten) kultiviert und für Dot-Blot Analyse verarbeitet. Um das Fünffache Verdünnungen der Zelle Lysates werden angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

In diesem Artikel wurden verschiedene Tests zur Messung der Aggregation von Httex1 PolyQ Erweiterungen und deren Wirkung auf das Wachstum der Hefe als Modell eingesetzt, um studieren wie verschiedene fluoreszierende Proteine verändern ihre Fusion Partner im Zusammenhang mit fluoreszierenden Reporter . Eine GLP-Variante (YmsfGFP) zeigten als Positivkontrolle wir, dass dies erhebliche Veränderungen in der PolyQ Toxizität und Aggregation zwischen verschiedenen fluoreszierenden Tags erkennt und einen direkten und schnellen Vergleich der PolyQ-FP-Fusion-Leistung gegen ermöglicht GFP-Tags Konstrukte16,19.

Während dieses Protokolls konzentriert sich auf fluoreszierende Proteine, können verschiedene Teile des Protokolls testen Sie die Wirkung von anderen Protein-Tags leicht angepasst werden. Darüber hinaus beschäftigt dieses Protokolls Low-Kopie Hefe Zentromer Vektoren, die in Bezug auf die Kopienzahl (in der Regel ein bis zwei Kopien) der Anwesenden in Zellen25variieren können. Integrative Vektoren verwenden, um einen einheitlichen Ausdruck in experimentellen Bedingungen zu gewährleisten, könnte dieses Problem umgehen. Während dieses Protokolls für den Einsatz in den Hintergrund von W303 optimiert wurde, können andere S. Cerevisiae -Stämmen eingesetzt werden. Anfälligkeit für PolyQ Toxizität sollte jedoch mithilfe der YmsfGFP-Tags Vektoren vor entwerfen neue Konstrukte bestimmt werden. In bestimmten Fällen ist die hoch-Kopie (2µ) Vektoren erzeugen einen deutliches Wachstum defekt beschäftigen geeignet. Es wird auch vorgeschlagen, um mehrere Isolate nach der Hefe Umwandlung mit PolyQ Vektoren zu vermeiden, Auswahl von spontanen Entstörer zeigen eine reduzierte PolyQ Toxizität zu testen. Der Hinweis, die W303 Hefe-Stamm26 in der Regel verwendet wird, wie es der Toxizität von PolyQ empfindlicher als andere S288C-Derivate, wie BY4741/BY474227, so dass für ein breiteres Spektrum von Wachstum Phänotypen. Wichtiger ist, müssen die Stämme dieser Assay beschäftigt das Prion-Protein Rnq1 zu tragen, da rnq1Δ Zellen PolyQ Toxizität und Aggregation28nicht angezeigt werden. Es ist auch wichtig, Httex1 Konstrukte tragen die amino-terminalen Flagge Tag und fehlt der Prolin-reiche Domäne zu verwenden. Andere Varianten der Fusion Design können giftige Phänotypen15ändern. Zu guter Letzt die Induktion des PolyQ Fusion Ausdrucks in Galaktose-haltigen Medien ist ein entscheidender Schritt der Protokoll-21. Wenn Sie Zellen aus Glukose, Galaktose enthält Medien übertragen, ist es wichtig, waschen Sie die Zellen mindestens dreimal mit sterilem Wasser, alle Spuren von Glukose zu beseitigen, die dazu beitragen könnten, die Induktion der Gal1 Promotor29zu unterdrücken. Bei der Fleckenentfernung Assays kann Kultivierung der Zellen über Nacht in Galaktose Medien induzieren die Expression von der Fusion verschärfen die giftigen Phänotyp der 72Q Fusion und helfen, Veränderungen im Wachstum in verschiedenen Fusionen16unterscheiden.

Als Einschränkung frühere Studien differenzielle Effekte zwischen eine Nonmonomeric Version der Fischereipolitik (GFP-Derivat) und YmsfGFP16nicht beobachten. So zumindest für GFP-Varianten dieser Test möglicherweise nicht empfindlich genug, um zwischen Monomeren und Oligomere Varianten unterscheiden, Hervorhebung der Notwendigkeit, die PolyQ ergänzen Toxizität Tests mit anderen standard-Methoden, wie z. B. die OSER assay13 und biochemische Analyse9,10,11,12 , die Oligomerisierung direkt beurteilen können. Darüber hinaus ist darauf hinzuweisen, dass FPs in der Hefe im Vergleich zu in-vitro- Tests oder ihren Ausdruck in anderen Organismen23anders Verhalten kann.

Zusammen ermöglichen diese Methoden Forscher schnell neue FPs zu charakterisieren und ihre Wirkung auf ihre Fusion Partner zu messen. In Zukunft wird dieses Protokoll ermöglichen das schnelle Screening von neuen Derivate von bisher charakterisierten FPs Mutanten zu identifizieren, die sich ähnlich verhalten, GFP-Varianten, die nach wie vor den Goldstandard Maßnahme für FP-Reporter. Während dieses Protokoll auf fluoreszierende Proteine konzentriert, kann es leicht zum Bildschirm für die Wirkung der anderen genetisch codierte Tags wie SNAP-Tag30 und SunTag31angepasst werden.

Dieses Protokoll bietet abschließend einen schnelle und leicht skalierbaren Assay um weitere Charakterisierung der neuen Generation von FPs und andere genetisch codierte Tags Forschung in Fusion Protein-Design führen zu ermöglichen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Diese Studie stützt sich auf einen Betriebskostenzuschuss von der Canadian Institute for Health Research, M.L.D. und p.l. Die hier vorgestellte Arbeit stützt sich auf einen John R. Evans Leader Fund Award der kanadischen Stiftung für Innovation und ein passenden Fonds aus dem Ontario Forschungsfonds, p.l. Y.J. stützt sich auf einen Master of Science, Promotionsstipendium Transfer vom Dekan der Schulich Schule von M Edicine und Zahnmedizin an der Universität von Western Ontario. S.D.G wird unterstützt durch ein Promotionsstipendium aus ALS Kanada.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-alpha Competent E. coli (High efficiency) New Englanfd Biolab C2987
SpeI-HF New Englanfd Biolab R3133 High fidelity enzymes are preferred
SalI-HF New Englanfd Biolab R0138 High fidelity enzymes are preferred
Agarose Fisher Scientific BP160
LB-Agar Fisher Scientific BP1425
LB-Broth Fisher Scientific BP1426
Ampicilin Fisher Scientific BP1760
PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase Agilent Technologies 600382
EPOCH2 microplate spectrophotometer BioTek Instruments inc EPOCH2TC
Yeast Pin Replicator V&P Scientific inc. VP407AH
SPI imager S&P Robotics inc. spImager-M
Zeiss LSM 800 confocal with AryScan Carl Zeiss Microscopy LSM 800
8 well Lab-Tek imaging chambers Fisher Scientific 12565470
Bio-Dot apparatus Bio-Rad 1706545
Chemi Doc XRS+ Bio-Rad 1708265
anti-FLAG M1 antibody Sigma-Aldrich F3040
Goat anti-mouse IgG alexa 555 secondary antibody Thermo  A32727
Plasmid MiniPrep Kit Fisher Scientific K0503
Plasmid Gel extraction Kit Fisher Scientific K0831
PCR Purification Kit Fisher Scientific K0702
Prizm GraphPad N/A
TAE (Tris-Acetate-EDTA) Fisher Scientific BP13354

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Biologie Ausgabe 141 fluoreszierende Proteine Trinukleotiderkrankungen Toxizität Hefe Wachstum Assays Aggregation grün fluoreszierendes Protein Fluoreszenz-Mikroskopie
Wirkung von fluoreszierenden Proteinen auf Fusion Partner mit Trinukleotiderkrankungen Toxizität Assays in Hefe
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Jiang, Y., Di Gregorio, S., Albakri, … More

Jiang, Y., Di Gregorio, S., Albakri, M. B., Duennwald, M. L., Lajoie, P. Effect of Fluorescent Proteins on Fusion Partners Using Polyglutamine Toxicity Assays in Yeast. J. Vis. Exp. (141), e58748, doi:10.3791/58748 (2018).

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