Visualisierung von endogenen Mitophagie-Komplexen in Situ in menschlichen Pankreas-Betazellen unter Verwendung von Proximity Ligation Assay
Summary
Dieses Protokoll skizziert eine Methode zur quantitativen Analyse der Mitophagie-Protein-Komplexbildung speziell in Beta-Zellen aus primären menschlichen Ischenproben. Diese Technik ermöglicht somit die Analyse der Mitophagie aus begrenztem biologischem Material, die in wertvollen menschlichen Betazellproben der Bauchspeicheldrüse entscheidend sind.
Abstract
Mitophagie ist ein wesentlicher mitochondrialer Qualitätskontrollweg, der für die Betazell-Bioenergetik der Pankreas-Islet entscheidend ist, um die Glukose-stimulierte Insulinfreisetzung zu fördern. Die Bewertung der Mitophagie ist eine Herausforderung und erfordert oft genetische Reporter oder mehrere komplementäre Techniken, die nicht leicht in Gewebeproben verwendet werden können, wie z. B. primäre menschliche Pankreasinseln. Hier zeigen wir einen robusten Ansatz zur Visualisierung und Quantifizierung der Bildung von wichtigen endogenen Mitophagiekomplexen in primären menschlichen Pankreasinseln. Mit der empfindlichen Näherungsligations-Assay-Technik zur Erkennung der Wechselwirkung der Mitophagieregler NRDP1 und USP8 sind wir in der Lage, die Bildung wesentlicher Mitophagiekomplexe vor Ort gezielt zu quantifizieren. Durch die Kopplung dieses Ansatzes zur Gegenfärbung des Transkriptionsfaktors PDX1 können wir Mitophagiekomplexe und die Faktoren quantifizieren, die die Mitophagie beeinträchtigen können, insbesondere innerhalb von Betazellen. Die von uns beschriebene Methodik überwindet den Bedarf an großen Mengen zellulärer Extrakte, die für andere Protein-Protein-Interaktionsstudien wie Immunpräzipitation (IP) oder Massenspektrometrie erforderlich sind, und ist ideal für wertvolle menschliche Isletproben, die in der Regel nicht in ausreichenden Mengen für diese Ansätze zur Verfügung. Darüber hinaus entfällt diese Methode die Notwendigkeit von Strömungsssierungstechniken, um Betazellen aus einer heterogenen Isletpopulation für nachgelagerte Proteinanwendungen zu reinigen. So beschreiben wir ein wertvolles Protokoll zur Visualisierung von Mitophagie, die für den Einsatz in heterogenen und begrenzten Zellpopulationen hochkompatibel ist.
Introduction
Pankreas-Betazellen produzieren das Insulin, das erforderlich ist, um eine normale Glukosehomöostase aufrechtzuerhalten, und ihr Versagen führt zur Entwicklung aller Formen von Diabetes. Beta-Zellen behalten eine robuste mitochondriale Fähigkeit, die Energie zu erzeugen, die erforderlich ist, um den Glukosestoffwechsel mit der Insulinfreisetzung zu koppeln. Kürzlich hat sich gezeigt, dass die Aufrechterhaltung der funktionellen mitochondrialen Masse von zentraler Bedeutung für die optimale Beta-Zellfunktion1,2,3ist. Um die funktionelle mitochondriale Masse aufrechtzuerhalten, verlassen sich Betazellen auf Qualitätskontrollmechanismen, um dysfunktionale, beschädigte oder alternde Mitochondrien zu entfernen4. Wir und andere haben zuvor gezeigt, dass Betazellen auf einer spezialisierten Form des mitochondrialen Umsatzes, genannt mitochondriale Autophagie (oder Mitophagie), beruhen, um die mitochondriale Qualitätskontrolle sowohl bei Nagetieren als auch bei menschlichen Inseln aufrecht zu erhalten1, 2,5. Leider gab es jedoch keine einfache Methode, um Mitophagie oder endogen exprimierte Mitophagiekomponenten in menschlichen Pankreas-Betazellen zu erkennen.
Wir haben vor kurzem gezeigt, dass die vorgelagerte Regulierung der Mitophagie in Betazellen auf der Bildung eines Proteinkomplexes beruht, der die E3-Ligase CLEC16A und NRDP1 und die Deubiquitinase USP81umfasst. NRDP1 und USP8 haben unabhängig gezeigt, mitophagie durch Maßnahmen auf den wichtigsten Mitophagie-Initiator PARKIN6,7beeinflussen. NRDP1 zielt auf PARKIN für Ubiquitination und Abbau, um Mitophagie6abzuschalten, und USP8 deubiquitiniert speziell K6-verknüpfte PARKIN, um seine Translokation zu Mitochondrien zu fördern7. Die Proximity Ligation Assay (PLA)-Technologie ist seit kurzem ein Fortschritt auf dem Gebiet der Proteininteraktionsbiologie8, die die Visualisierung endogener Proteininteraktionen in situ in einzelnen Zellen ermöglicht und nicht durch knappes Probenmaterial begrenzt wird. Diese Methode ist besonders verlockend für die menschliche Islet/Beta-Zellbiologie, aufgrund der geringen Verfügbarkeit von Proben, gekoppelt an die Notwendigkeit, physiologisch relevante Proteinkomplexe innerhalb heterogener Zelltypen zu verstehen.
Mit Dem PLA-Ansatz sind wir in der Lage, wichtige endogene Mitophagie-Komplexe in primären menschlichen Pankreas-Beta-Zellen und neuronalen Zelllinien zu beobachten und die Auswirkungen einer diabetogenen Umgebung auf den Mitophagieweg1zu demonstrieren. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das übergeordnete Ziel dieses Protokolls darin besteht, spezifische Mitophagie-Proteinkomplexe in Geweben zu analysieren, die kein reichlichvorhandenes Material haben oder bei denen herkömmliche Protein-Interaktionsstudien nicht möglich sind.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschreiben wir einen einfachen und effizienten Ansatz zur Verwendung von NRDP1:USP8 PLA in Geweben/Zellen von Interesse, um die Bildung von vorgelagerten Mitophagie-Komplexen zu quantifizieren. Zuvor haben wir die Bildung des Mitophagiekomplexes CLEC16A-NRDP1-USP8 in pankreatischen Betazellen durch verschiedene Methoden bestätigt, darunter Co-Immunpräzipitationsexperimente, zellfreie Interaktionsstudien und in vitro sowie zellbasierte Ubiquitinationstests und demonstrierte, wie dieser Komplex regulierten mitophag…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren würdigen die finanzielle Unterstützung von JDRF (CDA-2016-189 und SRA-2018-539), dem National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, National Institutes of Health (R01-DK-108921), der Familie Brehm und der Familie Anthony. Der JDRF Career Development Award an S.A.S. wird teilweise von der Danish Diabetes Academy unterstützt, die von der Novo Nordisk Foundation unterstützt wird.
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA 1X | Life Technologies | 25200-056 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Block solution | Homemade | Use 1X PBS, add 10 % donkey serum, and 0.3% Triton X-100 detergent. | |
| Buffer A | Homemade | To make 1L: Mix 8.8g NaCl, 1.2g Tris base, 500ul Tween-20, with 750mL ddH20. pH to 7.5 with HCl, and fill to 1L. Filter solution and store at 4C. Bring to RT before experimental use | |
| Buffer B | Homemade | To make 1L: Mix 5.84g NaCl, 4.24g Tris base, 26g Tris-HCl with 500mL ddH20. pH to 7.5, and fill to 1L. Filter solution and store a 4C. Bring to RT before experimental use | |
| Cy5-conjugated AffiniPure donkey anti-goat | Jackson Labs | 705-175-147 | |
| Detection Reagents Red | Sigma- Aldrich | DU092008-100RXN | Kit containing: ligation solution stock (5X), ligase, amplification solution stock (5X) and polymerase. |
| DuoLink PLA probe anti-mouse MINUS | Sigma- Aldrich | DU092004-100RXN | |
| DuoLink PLA probe anti-rabbit PLUS | Sigma- Aldrich | DU092002-100RXN | |
| Fetal bovine serum | |||
| Goat polyclonal anti-PDX1 (clone A17) | Santa Cruz | SC-14664 | RRID: AB_2162373 |
| HEPES (1M) | Life Technologies | 15630-080 | |
| MIN6 pancreatic cell line | Gift from D. Stoffers | Mouse insulinoma cell line, utilized for cell-based assays. | |
| Mouse monoclonal anti-USP8 antibody (clone US872) | Sigma- Aldrich | SAB200527 | |
| Pap-pen | Research Products International | 195505 | |
| Parafilm | Use to seal antibody and probe solutions on your cells to prevent evaporation when using small solution volumes. | ||
| PBT (phosphate buffered saline with triton) | Homemade | To make 50mL: 43.5mLddH2O, 5mL 10X PBS, 0.5mL 10X BSA(100mg/mL solution), 1mL 10% triton X-100 solution in ddH20) | |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline, 10X | Fisher Scientific | BP399-20 | |
| PIM(ABS) Human AB serum | Prodo Labs | PIM-ABS001GMP | |
| PIM(G) (glutamine) | Prodo Labs | PIM-G001GMP | |
| PIM(S) media | Prodo Labs | PIM-S001GMP | |
| PR619 | Apex Bio | A812 | |
| Prolong Gold antifade reagent with DAPI | Life Technologies (Molecular Probes) | P36935 | |
| Rabbit polyclonal anti-FLRF/RNF41 (Nrdp1) | Bethyl Laboratories | A300-049A | RRID: AB_2181251 |
| SH-SY5Y cells | Gift from L. Satin | Human neuroblastoma cell line, utilized for cell-based assays. | |
| Sodium Pyruvate (100X) | Life Technologies | 11360-070 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| Water for RNA work (DEPC water) | Fisher Scientific | BP361-1L |
Referências
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