Визуализация эндогенных митофагных комплексов на месте в бета-клетках поджелудочной железы человека, используя асссы Лигации близости
Summary
Этот протокол излагает метод количественного анализа образования митофагии протеинового комплекса, специально в бета-клетках из первичных образцов человека- иаклетов. Этот метод, таким образом, позволяет анализ митофагии из ограниченного биологического материала, которые имеют решающее значение в драгоценных человеческих образцов бета-клеток поджелудочной железы.
Abstract
Митофагия является важным митохондриальным пути контроля качества, который имеет решающее значение для поджелудочной железы газа бета-клеток биоэнергетики для топлива глюкозы стимулировали высвобождение инсулина. Оценка митофагии является сложной задачей и часто требует генетических репортеров или несколько дополнительных методов не легко использовать в образцах тканей, таких как первичные островки поджелудочной железы человека. Здесь мы демонстрируем надежный подход к визуализации и количественной оценке формирования ключевых эндогенных митофагических комплексов в первичных островках поджелудочной железы. Используя чувствительный метод перевязки близости для обнаружения взаимодействия регуляторов митофагии NRDP1 и USP8, мы можем специально количественно определить формирование основных митофагных комплексов на месте. Соединяя этот подход к противодействию транскрипции факторPDX1, мы можем количественно митофагических комплексов, и факторы, которые могут ухудшить митофагии, в частности, в бета-клетки. Методология, которая мы описываем, преодолевает потребность в больших количествах клеточных экстрактов, необходимых для других исследований взаимодействия белково-белкового взаимодействия, таких как иммунопреципиция (ИС) или масс-спектрометрия, и идеально подходит для драгоценных образцов человека, как правило, не в достаточном количестве для этих подходов. Кроме того, эта методология устраняет необходимость в методах сортировки потоков для очистки бета-клеток от неоднородной популяции островков для применения белка ниже по течению. Таким образом, мы описываем ценный протокол для визуализации митофагии, хорошо совместимых для использования в разнородных и ограниченных популяциях клеток.
Introduction
Бета-клетки поджелудочной железы производят инсулин, необходимый для поддержания нормального гомеостаза глюкозы, и их неудача приводит к развитию всех форм диабета. Бета-клетки сохраняют надежную митохондриальную способность генерировать энергию, необходимую для сочетания метаболизма глюкозы с высвобождением инсулина. В последнее время стало очевидно, что поддержание функциональной митохондриальноймассы имеет ключевое значение для оптимальной функции бета-клеток 1,2,3. Для поддержания функциональной митохондриальной массы бета-клетки полагаются на механизмы контроля качествадля удаления дисфункциональных, поврежденных или стареющих митохондрий 4. Мы и другие ранее показали, что бета-клетки полагаются на специализированную форму митохондриального оборота, называемую митохондриальной аутофагией (или митофагией), для поддержания контроля качества митохондрии как у грызунов, так и у человека островков1, 2,5. К сожалению, однако, не было простого способа обнаружения митофагии, или эндогенно выраженных митофагических компонентов, в бета-клетках поджелудочной железы человека.
Недавно мы показали, что регулирование вверх по течению митофагии в бета-клетках опирается на формирование белкового комплекса, включающего E3 лигазаclees CLEC16A и NRDP1 и deubiquitinase USP81. NRDP1 и USP8 были показаны независимо, чтобы повлиять на митофагию через действие на ключевой митофаг иинициатор PARKIN6,7. NRDP1 цели PARKIN для повсеместности и деградации, чтобы выключить митофагии6, и USP8 специально deubiquitinates K6 связанных PARKIN содействовать его транслокации в митохондрии7. Близость перевязки анализ (PLA) технология была недавний прогресс в области белкового взаимодействия биологии8, что позволяет визуализации эндогенных белковых взаимодействий на месте в одиночных клетках, и не ограничивается дефицитным материалом образца. Эта методология особенно заманчиво для человека островк / бета-клеточной биологии, в связи с редкостью наличия образцов, в сочетании с необходимостью понимания физиологически значимых белковых комплексов в неоднородных типов клеток.
Используя подход PLA, мы можем наблюдать ключевые комплексы эндофагии в первичных бета-клеток поджелудочной железы человека и нейрональных клеточных линий, и продемонстрировать влияние диабетогенной среды на митофагическом пути1. Таким образом, главной целью этого протокола является анализ конкретных митофагных белковых комплексов в тканях, не хватает обильного материала, или где обычные исследования взаимодействия белка невозможны.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы описываем простой и эффективный подход к использованию NRDP1:USP8 PLA в тканях/клетках, представляющих интерес для количественной оценки формирования высокопотечения митофагических комплексов. Ранее мы подтвердили формирование CLEC16A-NRDP1-USP8 митофагии комплекса в бета-клеток поджелу…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы признают финансовую поддержку со стороны JDRF (CDA-2016-189 и SRA-2018-539), Национального института диабета и болезней пищеварения и почек, Национальных институтов здравоохранения (R01-DK-108921), семьи Брем и семьи Энтони. Премия JDRF по развитию карьеры s.A.S. частично поддерживается Датской академией диабета, которая поддерживается Фондом Ново Нордиска.
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA 1X | Life Technologies | 25200-056 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Block solution | Homemade | Use 1X PBS, add 10 % donkey serum, and 0.3% Triton X-100 detergent. | |
| Buffer A | Homemade | To make 1L: Mix 8.8g NaCl, 1.2g Tris base, 500ul Tween-20, with 750mL ddH20. pH to 7.5 with HCl, and fill to 1L. Filter solution and store at 4C. Bring to RT before experimental use | |
| Buffer B | Homemade | To make 1L: Mix 5.84g NaCl, 4.24g Tris base, 26g Tris-HCl with 500mL ddH20. pH to 7.5, and fill to 1L. Filter solution and store a 4C. Bring to RT before experimental use | |
| Cy5-conjugated AffiniPure donkey anti-goat | Jackson Labs | 705-175-147 | |
| Detection Reagents Red | Sigma- Aldrich | DU092008-100RXN | Kit containing: ligation solution stock (5X), ligase, amplification solution stock (5X) and polymerase. |
| DuoLink PLA probe anti-mouse MINUS | Sigma- Aldrich | DU092004-100RXN | |
| DuoLink PLA probe anti-rabbit PLUS | Sigma- Aldrich | DU092002-100RXN | |
| Fetal bovine serum | |||
| Goat polyclonal anti-PDX1 (clone A17) | Santa Cruz | SC-14664 | RRID: AB_2162373 |
| HEPES (1M) | Life Technologies | 15630-080 | |
| MIN6 pancreatic cell line | Gift from D. Stoffers | Mouse insulinoma cell line, utilized for cell-based assays. | |
| Mouse monoclonal anti-USP8 antibody (clone US872) | Sigma- Aldrich | SAB200527 | |
| Pap-pen | Research Products International | 195505 | |
| Parafilm | Use to seal antibody and probe solutions on your cells to prevent evaporation when using small solution volumes. | ||
| PBT (phosphate buffered saline with triton) | Homemade | To make 50mL: 43.5mLddH2O, 5mL 10X PBS, 0.5mL 10X BSA(100mg/mL solution), 1mL 10% triton X-100 solution in ddH20) | |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline, 10X | Fisher Scientific | BP399-20 | |
| PIM(ABS) Human AB serum | Prodo Labs | PIM-ABS001GMP | |
| PIM(G) (glutamine) | Prodo Labs | PIM-G001GMP | |
| PIM(S) media | Prodo Labs | PIM-S001GMP | |
| PR619 | Apex Bio | A812 | |
| Prolong Gold antifade reagent with DAPI | Life Technologies (Molecular Probes) | P36935 | |
| Rabbit polyclonal anti-FLRF/RNF41 (Nrdp1) | Bethyl Laboratories | A300-049A | RRID: AB_2181251 |
| SH-SY5Y cells | Gift from L. Satin | Human neuroblastoma cell line, utilized for cell-based assays. | |
| Sodium Pyruvate (100X) | Life Technologies | 11360-070 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| Water for RNA work (DEPC water) | Fisher Scientific | BP361-1L |
Referências
- Pearson, G., et al. Clec16a, Nrdp1, and USP8 Form a Ubiquitin-Dependent Tripartite Complex That Regulates beta-Cell Mitophagy. Diabetes. 67 (2), 265-277 (2018).
- Soleimanpour, S. A., et al. The diabetes susceptibility gene Clec16a regulates mitophagy. Cell. 157 (7), 1577-1590 (2014).
- Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. Mitochondrial regulation of β-cell function: Maintaining the momentum for insulin release. Molecular Aspects of Medicine. , (2015).
- Hattori, N., Saiki, S., Imai, Y. Regulation by mitophagy. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 53, 147-150 (2014).
- Soleimanpour, S. A., et al. Diabetes Susceptibility Genes Pdx1 and Clec16a Function in a Pathway Regulating Mitophagy in beta-Cells. Diabetes. 64 (10), 3475-3484 (2015).
- Zhong, L., Tan, Y., Zhou, A., Yu, Q., Zhou, J. RING Finger Ubiquitin-Protein Isopeptide Ligase Nrdp1/FLRF Regulates Parkin Stability and Activity. Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9425-9430 (2005).
- Durcan, T. M., et al. USP8 regulates mitophagy by removing K6-linked ubiquitin conjugates from parkin. The EMBO Journal. 33 (21), 2473-2491 (2014).
- Gauthier, T., Claude-Taupin, A., Delage-Mourroux, R., Boyer-Guittaut, M., Hervouet, E. Proximity Ligation In situ Assay is a Powerful Tool to Monitor Specific ATG Protein Interactions following Autophagy Induction. PLoS ONE. 10 (6), e0128701 (2015).
- Silva Xavier, D. a., G, The Cells of the Islets of Langerhans. Journal of Clinical Medicine. 7 (3), 54 (2018).
- Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. Pancreatic islet plasticity: Interspecies comparison of islet architecture and composition. Islets. 2 (3), 135-145 (2010).
- Cabrera, O., et al. The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (7), 2334 (2006).
- Brissova, M., et al. Assessment of Human Pancreatic Islet Architecture and Composition by Laser Scanning Confocal Microscopy. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (9), 1087-1097 (2005).
- Babu, D. A., Deering, T. G., Mirmira, R. G. A feat of metabolic proportions: Pdx1 orchestrates islet development and function in the maintenance of glucose homeostasis. Molecular Genetics and Metabolism. 92 (1), 43-55 (2007).
- Poitout, V., et al. Glucolipotoxicity of the pancreatic beta cell. Biochimica Biophysica Acta. 1801 (3), 289-298 (2010).
- Pearson, G., Soleimanpour, S. A. A ubiquitin-dependent mitophagy complex maintains mitochondrial function and insulin secretion in beta cells. Autophagy. 14 (7), 1160-1161 (2018).
- Li, J., et al. Single-cell transcriptomes reveal characteristic features of human pancreatic islet cell types. EMBO Reports. 17 (2), 178-187 (2016).
- DiGruccio, M. R., et al. Comprehensive alpha, beta and delta cell transcriptomes reveal that ghrelin selectively activates delta cells and promotes somatostatin release from pancreatic islets. Molecular Metabolism. 5 (7), 449-458 (2016).
- Lawlor, N., et al. Single-cell transcriptomes identify human islet cell signatures and reveal cell-type–specific expression changes in type 2 diabetes. Genome Research. 27 (2), 208-222 (2017).
- Dorrell, C., et al. Human islets contain four distinct subtypes of β cells. Nature Communications. 7, 11756 (2016).
- Dorrell, C., et al. Isolation of major pancreatic cell types and long-term culture-initiating cells using novel human surface markers. Stem Cell Research. 1 (3), 183-194 (2008).
- Jayaraman, S. A novel method for the detection of viable human pancreatic beta cells by flow cytometry using fluorophores that selectively detect labile zinc, mitochondrial membrane potential and protein thiols. Cytometry Part A. 73 (7), 615-625 (2008).
- Arda, H. E., et al. Age-Dependent Pancreatic Gene Regulation Reveals Mechanisms Governing Human ß-Cell Function. Cell Metabolism. 23 (5), 909-920 (2016).
- Allen, G. F. G., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).
- Villa, E., Marchetti, S., Ricci, J. -. E. No Parkin Zone: Mitophagy without Parkin. Trends in Cell Biology. , (2018).
