Preparação do tecido cerebral de rato recém-nascido para Análise morfométrica ultraestrutural da distribuição de vesículas sinápticas em terminais nervosos

Summary

Nós descrevemos procedimentos para processar o tecido recém-nascido do cérebro do rato para obter micrografias de elétron high-resolution para a Análise morfométrica da distribuição sináptica do vesícula em terminais do nervo. As micrografias obtidas com esses métodos também podem ser utilizadas para estudar a morfologia de uma série de outros componentes celulares e suas relações estruturais dimensionais.

Abstract

Nosso laboratório e muitos outros exploraram o alto poder de resolução da microscopia eletrônica de transmissão para estudar a morfologia e a organização espacial das vesículas sinápticas. A fim de obter micrografias de elétrons de alta qualidade que podem produzir o grau de detalhe morfológico necessário para a análise quantitativa da distribuição de vesículas pré-sinápticas, a preparação ideal do espécime é crítica. A fixação química é o primeiro passo no processo de preparação de amostras, e de extrema importância para preservar a ultraestrutura fina. A fixação vascular com uma solução de glutaraldeído-formaldeído, seguida pelo tratamento de espécimes seccionados com vibratoma com tetroxida de ósmio, estabiliza o número máximo de moléculas, especialmente proteínas e lipídios, e resulta em conservação superior de ultrastructure. O tecido é então processado com a contrcoloração, desidratação sequencial e incorporação de resina. A coloração do bloco de en com acetato de uranilo (isto é, coloração do tecido vibratome-seccionado antes da incorporação da resina) realça o contraste endógeno e estabiliza componentes da pilha de encontro à extração durante o processamento do espécime. O contraste pode ser aumentado ainda mais aplicando o acetato do uranilo como uma borne-mancha em seções ultrafinos. A coloração dupla de secções ultrafinos com citrato de chumbo após o tratamento com acetato de uranilo também melhora a resolução da imagem, intensificando a opacidade de elétrons de estruturas contendo ácidos nucleicos através de ligação seletiva de chumbo ao acetato de uranilo. A microscopia eletrônica de transmissão é uma ferramenta poderosa para caracterização dos detalhes morfológicos das vesículas sinápticas e quantificação de seu tamanho e organização espacial no Bouton terminal. No entanto, por usar tecido fixo, a microscopia eletrônica de transmissão só pode fornecer informações indiretas sobre os processos de vida ou evolução. Portanto, outras técnicas devem ser consideradas quando o objetivo principal é estudar aspectos dinâmicos ou funcionais do tráfico de vesículas sinápticas e da exocitose.

Introduction

Nós descrevemos métodos para a preparação do tecido de cérebro recém-nascido do rato para obter micrografias de elétron de alta qualidade para a Análise morfométrica detalhada da distribuição espacial do vesícula sináptica em terminais do nervo^1,2. As micrografias de alto contraste que podem ser obtidas pelo processamento de espécimes seguindo esses métodos também podem ser utilizadas para estudar a morfologia detalhada de um número de componentes celulares e suas relações estruturais dimensionais^3,4.

O microscópio eletrônico de transmissão (TEM) é uma ferramenta poderosa para estudar a morfologia das organelas e outras estruturas celulares quantitativamente. A partir desta década, não existem outros métodos de investigação que podem fornecer o mesmo grau de resolução de membranas lipídicas e organelas sem imuno-tagging, com exceção da criofixação por congelamento de alta pressão. No entanto, as técnicas de substituição de congelamento não são amplamente utilizadas, e normalmente exigem equipamentos caros e longos tempos de preparação.

A fim de aproveitar o alto poder de resolução do TEM, a preparação ideal do espécime é de suma importância. Os principais objetivos da preparação de amostras são preservar a estrutura do tecido com alteração mínima do estado de vida, aumentar o contraste da amostra e estabilizar o tecido contra a extração de componentes celulares durante o processamento e a exposição ao elétron Feixe. Numerosos protocolos para a preparação do tecido tem foram introduzidos e aperfeiçoados por vários laboratórios ao longo dos anos. Muitos deles se concentraram em métodos para visualização ideal de vesículas sinápticas^5,6,^7,8,9,10,11. Entre um número de métodos bem estabelecidos, padrão do ouro atualmente em uso, nós escolhemos procedimentos para a fixação química, a fixação do borne, a mancha do en Bloc, a desidratação seqüencial, a incorporação da resina e a mancha do borne que visam preservar a estrutura óptima do tecido e alcançar excelente contraste de imagem. Da nota, a preservação do ultraestrutura fino pode ser particularmente desafiante ao trabalhar com tecido recém-nascido do cérebro do rato. De fato, o sistema nervoso central de animais muito jovens caracteriza-se por um maior teor de água do que o cérebro adulto, ampliação mais proeminente dos espaços extracelulares e conexões mais soltas entre as células¹². Isto faz o tecido de cérebro recém-nascido do rato profundamente sensível às mudanças na osmolaridade, e requintadamente propenso ao encolhimento vesícula e/ou ao inchamento quando processado com as soluções seqüenciais da tonicidade diferente¹². Conseqüentemente, nossos métodos empregaram soluções para o processamento do espécime que são da osmolaridade tão perto como possível àquele do cérebro recém-nascido do rato. Nosso objetivo foi obter imagens de alta qualidade de microscopia eletrônica de alta resolução para avaliação quantitativa da distribuição espacial das vesículas sinápticas nos terminais nervosos. Especificamente, procurou-se medir o número de vesículas dentro do terminal nervoso, a distância das vesículas sinápticas da membrana plasmática pré-sináptica, o número de vesículas ancoradas na membrana pré-sináptica, o tamanho das vesículas sinápticas e a distâncias inter-vesicle¹.

A fixação química satisfatória é um pré-requisito para a obtenção de micrografias de elétrons de alta qualidade que podem fornecer os detalhes morfológicos necessários para estudar a morfologia da vesícula sináptica e a organização espacial. Embora vários modos de fixação existam, a fixação do tecido cerebral por perfusão vascular é decididamente superior a outros métodos. Uma vez que a fixação via perfusão vascular começa imediatamente após a detenção da circulação sistêmica, encurta o intervalo entre a Desoxigenação do tecido cerebral e a reticulação de proteínas com fixadores, resultando em alterações mínimas na célula Estrutura. Além disso, realiza penetração rápida e uniforme, por causa do rápido fluxo do fixador do leito vascular para os compartimentos extracelulares e celulares^12,13,14. A fixação primária com glutaraldeído, seguida de fixação secundária (pós-fixação) com tetroxida de ósmio, produz excelente preservação da estrutura fina^15,16,17. Uma mistura de glutaraldeído e paraformaldeído tem a vantagem adicional de uma penetração mais rápida no tecido¹².

Uma vez que os tecidos biológicos não são suficientemente rígidos para serem cortados em secções finas sem o apoio de uma matriz de resina, precisam de ser incorporados num meio antes de seccionamento fino. Resinas epóxi immiscible de água são comumente usadas como um meio de incorporação em TEM. Quando este tipo de matriz é usado, toda a água livre do espécime deve ser substituída com um solvente orgânico antes da infiltração da resina. A água é removida passando a amostra através de uma série de soluções de concentrações ascendentes de etanol e/ou acetona¹². Neste protocolo, os espécimes são primeiro plano incorporado entre folhas ACLAR flexíveis, em seguida, incorporado em uma cápsula. O resultado final é o tecido situado na ponta de um bloco de resina cilíndrica, que tem a geometria ideal para ser menos afetada por vibrações que surgem durante o corte de micrótomo.

Manchar com metais pesados para realçar o contraste endógeno do tecido é um outro aspecto importante da preparação do espécime. O contraste da imagem em TEM é devido à dispersão do elétron pelos átomos no tecido. No entanto, materiais biológicos consistem em grande parte de moléculas de baixo peso atômico (i.e., carbono, hidrogênio, oxigênio e nitrogênio). Portanto, a geração de contraste de espalhamento suficiente requer a incorporação de átomos de alto peso atômico nos componentes celulares do tecido. Isso é conseguido através da coloração do espécime com metais pesados^12,18,19. O tetroxide do ósmio, o urânio e a ligação, que ligam fortemente aos lipídios, são os metais pesados os mais comuns usados como manchas do elétron.

Ósmio (número atômico 76) é um dos metais os mais mais densas na existência. É um fixador e uma mancha, embora seu papel preliminar em tem seja como um fixador de confiança¹². Entre os vários protocolos de fixação em uso, o método de dupla fixação com glutaraldeído seguido de ósmio é o mais efetivo na redução da extração de constituintes celulares durante a preparação do espécime. Estes dois fixadores são usados para estabilizar o número máximo de tipos diferentes de moléculas, especial proteínas e lipídios, e resultam na preservação superior do ultraestrutura¹²,¹⁴,¹⁵do tecido^{, 16 anos} de ^, a ¹⁷.

O urânio (número atômico 92) é o metal o mais pesado usado como a mancha do elétron, o mais tipicamente no formulário do acetato do uranilo. Similarmente ao ósmio, atua como uma mancha e fixative, embora seu papel preliminar no tem seja como uma mancha^20,21. As estruturas contendo ácidos nucleicos e membranosos são fortemente e preferencialmente coradas com sais de uranilo em tecidos fixos de aldeído^22,23. O tratamento de tecidos com acetato de uranilo após osmicação e antes da desidratação resulta em estabilização de estruturas contendo ácido membranoso e nucleico, bem como contraste melhorado, e permite a identificação de alguns detalhes estruturais que não ser facilmente detectado em espécimes corados com ósmio sozinho^12,24,25. Pensa-se que o acetato de uranilo pode estabilizar a estrutura fina combinando com o ósmio reduzido que foi depositado em membranas do lipido durante o osmication²⁴. O contraste máximo é conseguido quando o acetato do uranilo é aplicado antes de incorporar e como uma borne-mancha em seções finas¹².

A ligação (número atômico 82) é a mancha a mais comum usada para o TEM e é empregada principalmente para a borne-mancha de seções finas. Os sais de chumbo têm alta opacidade de elétrons e mostram afinidade para uma ampla gama de estruturas celulares, incluindo membranas, proteínas nucleares e citoplasmáticas, ácidos nucleicos e glicogénio^26,27. Quando o método de coloração dupla é empregado (ou seja, a coloração com acetato de uranilo é seguida pelo tratamento com chumbo), este último atua como um desenvolvedor de coloração acetato de uranilo. Por exemplo, o chumbo pós-coloração da cromatina fixada com glutaraldeído aumenta a captação de acetato de uranilo por um fator de três^{28,29,30,31,32}. A ligação igualmente realça a mancha transmitida por outros metais tais como o ósmio. Pensa-se que os sais de chumbo mancham as membranas de tecidos fixos de ósmio, anexando ao grupo polar de fosfatides na presença de ósmio reduzido³³. Uma desvantagem potencial da mancha com o acetato e a ligação do uranilo, especial para durações prolongadas, é que muitos elementos estruturais diferentes são manchados ingualmente e não-especificamente, e assim não podem fàcilmente ser distinguidos de um outro¹² .

A introdução recente de fontes luminosas alternativas, tais como na microscopia foto-ativada óptica da localização da super-definição, melhorou significativamente a definição³⁴da microscopia de luz. No entanto, como a microscopia de luz depende de métodos histoquímicos e imuno-citoquímicos para visualizar proteínas ou enzimas rotuladas individualmente, o poder do TEM para exibir todos os elementos estruturais ao mesmo tempo permanece insuperável para estudo aprofundado do morfologia e relações dimensionais de estruturas teciduais. Em particular, nenhuma outra técnica pode fornecer o detalhe morfológico necessário para executar a Análise morfométrica da distribuição de vesículas sinápticas em boutons pré-sinápticos do nervo. No entanto, é importante notar que as micrografias de elétrons capturam a estrutura do tecido após a morte do organismo e, portanto, não podem fornecer informações sobre a dinâmica do tráfico de vesículas pré-sinápticas e da exocitose. Assim, outras ferramentas, como a imagem de FM corante-Live e a eletrofisiologia de remendo-braçadeira, devem ser consideradas quando o objetivo principal é estudar aspectos dinâmicos e/ou funcionais do tráfico de vesículas sinápticas e da exocitose.

Protocol

Todos os estudos foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais da Universidade de Virginia (Charlottesville, VA) e conduzidos de acordo com as diretrizes dos institutos nacionais de saúde. 1. fixação por perfusão vascular Nota: Uma descrição geral do método de perfusão vascular cerebral de ratos já foi detalhada nesta revista13 e está além do escopo deste protocolo. No entanto, as etapas a s…

Representative Results

Os critérios gerais que são aceitados na maior parte como indicativos da preservação satisfatória ou defeituosa do espécime para o tem foram estabelecidos. Estes critérios são exemplificados em quatro micrografias de elétron selecionados (dois exemplos da preparação óptima, dois exemplos da preparação defeituosa) que foram obtidos tratando o tecido de cérebro novo do rato que segue os métodos descritos neste protocolo. Em geral, uma micrografia eletrônica de boa qualidade apar…

Discussion

A manipulação de seções do tecido durante a preparação do espécime para o TEM exige um grau considerável de finesse, de concentração e de paciência. Ao usar uma micropipeta para adicionar e remover soluções, os espécimes podem ser sugados na ponta da pipeta pela tensão de superfície, tão grande cuidado deve ser tomado para evitar dano de tecido pela pipeta. Também, determinadas etapas da seqüência da desidratação podem ser tão rápidas quanto 1 minuto, daqui o operador precisa de trabalhar rapidame…

Materials

4% Osmium tetroxide	Electron Microscopy Sciences	19170	acqueous
50% Glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16310	EM grade, acqueous
Aclar 33 C embedding film	Electron Microscopy Sciences	50425-25	7.8 mil thickness, size 8"x10"
BEEM capsule holder	Electron Microscopy Sciences	69916	holds size "00" capsules
BEEM embedding capsules	Electron Microscopy Sciences	70021	size "00", flat
Butler block trimmer	Electron Microscopy Sciences	69945-01
Camel hair paint brush	Electron Microscopy Sciences	65576-01
Disc punch	Electron Microscopy Sciences	77850-09
Embed 812 kit	Electron Microscopy Sciences	14120
Lead acetate	Electron Microscopy Sciences	17600
Lead citrate	Electron Microscopy Sciences	17800
Lead nitrate	Electron microscopy Sciences	17900
Leica UC7 ultracut microtome	Leica
Micro scale	Electron Microscopy Sciences	62091-23
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	19208	EM grade, granular
Precision Thelco laboratory oven	Thelco	51221159
Sodium azide	Sigma-Aldricht	S2002
StatMark pen	Electron Microscopy Sciences	72109-01
Tyrode solution	Electron Microscopy Sciences	11760-05
Uranyl acetate	Electron Microscopy Sciences	22400	powder