Подготовка ткани мозга новорожденных крыс для ультраструктурного морфометрического анализа синаптической везикл распределения в нервных терминалах
Summary
Мы описываем процедуры обработки ткани мозга новорожденных крыс для получения электронов высокого разрешения для морфометрического анализа синаптической везиклраспределения распределения на нервных терминалах. Микрографы, полученные с помощью этих методов, также могут быть использованы для изучения морфологии ряда других клеточных компонентов и их размерных структурных связей.
Abstract
Наша лаборатория и многие другие использовали высокую разрешающую силу электронной микроскопии передачи для изучения морфологии и пространственной организации синапических пузырьков. Для получения высококачественных электронных микрографов, которые могут дать степень морфологических деталей, необходимых для количественного анализа досинаптической везикуловой дистрибутива, оптимальная подготовка образца имеет решающее значение. Химическая фиксация является первым шагом в процессе подготовки образца, и имеет первостепенное значение для сохранения тонкой ультраструктуры. Сосудистая фиксация раствором глутаральдегида-формальдегида, за которым следует обработка вибратообразных образцов с тетрокидом осмия, стабилизирует максимальное количество молекул, особенно белков и липидов, и приводит к превосходному сохранению ультраструктуры. Ткань затем обрабатывается с контрпятном, последовательным обезвоживанием и встраиванием мелины. En блок окрашивания с уранилом ацетата (т.е. окрашивание вибратообразной ткани до встраивания мелины) усиливает эндогенный контраст и стабилизирует компоненты клеток против добычи во время обработки образцов. Контраст может быть дополнительно увеличен путем применения уранила ацетата в качестве пост-пятна на ультратонких секциях. Двойное окрашивание ультратонких секций свинцом цитрата после лечения унанила ацетата также улучшает разрешение изображения, усиливая электронную непрозрачность нуклеиновой кислотно-содержащей структуры путем селективного связывания свинца с ацетатом уранил. Трансмиссия электронной микроскопии является мощным инструментом для характеристики морфологических деталей синаптической пузырьков и количественной оценки их размера и пространственной организации в терминале бутона. Однако, поскольку он использует фиксированную ткань, передача электронной микроскопии может предоставить только непрямую информацию о живых или эволюционных процессов. Поэтому следует учитывать другие методы, когда основной целью является изучение динамических или функциональных аспектов синаптической везикловой торговли и экзоцитоза.
Introduction
Описываем методы подготовки ткани мозга новорожденных крыс для получения высококачественных электронных микрографов для углубленного морфометрического анализа синаптической везикулной пространственного распределения на нервных терминалах1,2. Высококонтрастные микрографы, которые могут быть получены путем обработки образцов после этих методов, также могут быть использованы для изучения детальной морфологии ряда клеточных компонентов и их мерных структурных связей3,4.
Электронный микроскоп передачи (TEM) является мощным инструментом для изучения морфологии органелл и других клеточных структур количественно. По состоянию на это десятилетие, Есть никаких других методов исследования, которые могут обеспечить такую же степень разрешения липидных мембран и органелл без иммуно-метки, за исключением криофиксации высокого давления замораживания. Тем не менее, методы замораживания замены не широко используются, и, как правило, требуют дорогостоящего оборудования и длительного времени подготовки.
Для того, чтобы воспользоваться высокой мощностью TEM, оптимальная подготовка образца имеет первостепенное значение. Основными целями подготовки образца являются сохранение структуры тканей с минимальным изменением от живого состояния, повышение контрастности образца и стабилизация ткани от извлечения клеточных компонентов во время обработки и воздействия электрона луч. Многочисленные протоколы для подготовки ткани TEM были введены и усовершенствованы несколькими лабораториями на протяжении многих лет. Многие из них сосредоточились на методах оптимальной визуализациисинаптической пузырьков 5,6,7,8,9,10,11. Среди ряда устоявшихся, золотой стандарт методы в настоящее время используется, мы выбрали процедуры для химической фиксации, пост-фиксации, ан блок окрашивания, последовательное обезвоживание, встраивание мелины и после окрашивания, которые направлены на сохранение оптимальной структуры ткани и добиться превосходного контраста изображения. Следует отметить, сохранение тонкой ультраструктуры может быть особенно сложным при работе с новорожденной ткани мозга крысы. В самом деле, центральная нервная система очень молодых животных характеризуется более высоким содержанием воды, чем взрослый мозг, более заметное расширение внеклеточных пространств, и слабее связи между клетками12. Это делает новорожденную ткань мозга крысы глубоко чувствительныки к изменениям в осмоляритности, и изысканно склонны к артефактной усадки и / или отек при обработке через последовательные решения различной тона12. Таким образом, наши методы использовали решения для обработки образцов, которые имеют осмоляритность как можно ближе к крысиного новорожденного мозга. Нашей целью было получение высококачественных изображений электронной микроскопии с высоким разрешением для количественной оценки синаптической везикл пространственного распределения на нервных терминалах. В частности, мы стремились измерить количество пузырьков в нервном терминале, расстояние синаптической пузырьков от досинаптической плазменной мембраны, количество пузырьков, пристыкованных к досинаптической мембране, размер синаптических пузырьков и межвезикулные расстояния1.
Удовлетворительная химическая фиксация является необходимым условием для получения высококачественных электронных микрографов, которые могут обеспечить морфологическую деталь, необходимую для изучения синаптической везикальной морфологии и пространственной организации. Хотя существует несколько способов фиксации, фиксация тканей головного мозга с помощью сосудистой перфузии явно превосходит другие методы. Так как фиксация через сосудистую перфузию начинается сразу после ареста системного кровообращения, она сокращает интервал между дезоксигенацией ткани мозга и перекрестной связью белков с фиксаторами, что приводит к минимальным изменениям в клетках структуры. Кроме того, он достигает быстрого и равномерного проникновения, из-за быстрого потока фиксатора из сосудистого ложа в внеклеточные и клеточные отсеки12,13,14. Первичная фиксация с глютаральдегидом, за которой следует вторичная фиксация (послефиксация) с тетроком осмия, дает отличную консервацию тонкой структуры15,16,17. Смесь глютаральдегида и параформальдегида имеет дополнительное преимущество более быстрого проникновения в ткани12.
Поскольку биологические ткани не являются достаточно жесткими, чтобы быть разрезаны на тонкие секции без поддержки матрицы мелиссы, они должны быть встроены в среду перед тонким сечением. Водонепроницаемые эпоксидные смолы обычно используются в качестве встраивающей среды в TEM. При использовании этого типа матрицы, свободная вода образца должна быть заменена органическим растворителем до проникновения в мудрец. Вода удаляется путем передачи образца через ряд растворов восходящих концентраций этанола и/или ацетона12. В этом протоколе образцы сначала плоские, встроенные между гибкими акларными листами, затем встроены в капсулу. Конечным результатом является ткань, расположенная на кончике цилиндрического блока мелиссовой, которая имеет идеальную геометрию, которая меньше всего зависит от вибраций, возникающих во время микротомирования.
Еще одним важным аспектом подготовки образцов является окрашивание тяжелыми металлами для повышения контраста эндогенных тканей. Контраст изображения в TEM обусловлен рассеянием электронов атомами в тканях. Однако биологические материалы состоят в основном из молекул с низким атомным весом (т.е. углерода, водорода, кислорода и азота). Поэтому генерация достаточного рассеянного контраста требует включения атомов высокого атомного веса в клеточные компоненты ткани. Это достигается за счет окрашивания образца тяжелыми металлами12,18,19. Тетроксид осмия, урана и свинца, которые сильно связываются с липидами, являются наиболее распространенными тяжелыми металлами, используемыми в качестве электронных пятен.
Осмий (атомный номер 76) является одним из самых плотных металлов в существовании. Это и фиксатор и пятно, хотя его основная роль в TEM как надежный фиксатор12. Среди различных протоколов фиксации в использовании, метод двойной фиксации с глютаральдегидом следуют осмия является наиболее эффективным в снижении извлечения клеточных компонентов во время подготовки образца. Эти два фиксатора используются для стабилизации максимального количества различных типов молекул, особенно белков и липидов, и приводят к превосходному сохранению ткани ультраструктуры12,14,15, 16 Год , 17.
Уран (атомный номер 92) является самым тяжелым металлом, используемым в качестве электронного пятна, чаще всего в виде ацетата уранила. Подобно осмию, он действует как пятно и фиксатор, хотя его основная роль в TEM, как пятно20,21. Нуклеиновые кислотосодержащие и мембранные структуры сильно и преимущественно окрашены солью уранила в альдегидно-фиксированных тканях22,23. Лечение тканей ацетатом уранила после осмеяния и до обезвоживания приводит к стабилизации мембранных и нуклеиновых кислотосодержащих структур, а также усиленного контраста и позволяет выявить некоторые структурные детали, которые не будут быть легко обнаружены в образцах окрашенных осмия только12,24,25. Считается, что уранил ацетат может стабилизировать тонкую структуру, сочетая с уменьшенным осмия, который был отложен на липидных мембранах во время осмии24. Максимальная контрастность достигается, когда уранил ацетат применяется перед встраиванием и как после пятно в тонких разделах12.
Свинец (атомный номер 82) является наиболее распространенным пятном, используемым для TEM и в основном используется для пост-окрашивания тонких секций. Свинцовые соли имеют высокую непрозрачность электронов и проявляют сродство к широкому спектру клеточных структур, включая мембраны, ядерные и цитоплазматические белки, нуклеиновые кислоты и гликоген26,27. При приеме двойного метода окрашивания (т.е. окрашивания ацетатом уранила следует лечение свинцом), последний выступает в качестве разработчика окрашивающего уранил-ацетат. Например, свинец после окрашивания хроматина фиксированной с глютаральдегидом увеличивает поглощение уранила ацетата в три28,29,30,31,32. Свинец также усиливает окрашивание, привитое другими металлами, такими как осмий. Считается, что свинцовые соли окрашивают мембраны осмий-фиксированных тканей, прикрепляя к полярной группе фосфатидов в присутствии уменьшенного осмия33. Потенциальным недостатком окрашивания как уранил ацетата и свинца, особенно в течение длительного времени, является то, что многие различные структурные элементы окрашены одинаково и не конкретно, и, таким образом, не может быть легко отличить друг от друга12 .
Недавнее введение альтернативных источников света, таких как оптическое супер-разрешение фото-активированной локализации микроскопии, значительно улучшило разрешение световой микроскопии34. Однако, поскольку световая микроскопия опирается на гистохимические и иммуноцитохимические методы для визуализации индивидуально обозначенных белков или ферментов, сила TEM для отображения всех структурных элементов одновременно остается непревзойденной для углубленного изучения морфология и мерные отношения структур тканей. В частности, никакая другая методика не может обеспечить морфологические детали, необходимые для выполнения морфометрического анализа синаптической везикл распределения на досинаптических нервных бутонов. Тем не менее, важно отметить, что электронные микрографы фиксируют структуру ткани после смерти организма, и поэтому они не могут предоставить информацию о динамике досинаптической везикл торговли и экзоцитоза. Таким образом, другие инструменты, такие как FM краситель живой изображения и патч-зажим электрофизиологии, должны быть рассмотрены, когда основная цель заключается в изучении динамических и / или функциональных аспектов синаптической везикл торговли и экзоцитоза.
Protocol
Representative Results
Discussion
Обработка секций тканей во время подготовки образца к TEM требует значительной степени утонченности, концентрации и терпения. При использовании микропипетта для добавления и удаления растворов образцы могут быть всасывается в кончик пипетки поверхностным натяжением, поэтому следует ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Данная рукопись была поддержана NIH/NIGMS K08 123321 (в N.L.) и за счет средств кафедры анестезиологии Университета Вирджинии. Авторы хотели бы поблагодарить Алев Эрисир (департамент биологии, Университет Вирджинии, Шарлоттсвилл, Штат Вирджиния) за отличную подготовку и техническую помощь с TEM, и за ее бесценную критику рукописи. Авторы также благодарят Расширенный электрон микроскопии объекта в Университете Вирджинии за техническую помощь с образцом секции и после окрашивания.
Materials
| 4% Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19170 | acqueous |
| 50% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16310 | EM grade, acqueous |
| Aclar 33 C embedding film | Electron Microscopy Sciences | 50425-25 | 7.8 mil thickness, size 8"x10" |
| BEEM capsule holder | Electron Microscopy Sciences | 69916 | holds size "00" capsules |
| BEEM embedding capsules | Electron Microscopy Sciences | 70021 | size "00", flat |
| Butler block trimmer | Electron Microscopy Sciences | 69945-01 | |
| Camel hair paint brush | Electron Microscopy Sciences | 65576-01 | |
| Disc punch | Electron Microscopy Sciences | 77850-09 | |
| Embed 812 kit | Electron Microscopy Sciences | 14120 | |
| Lead acetate | Electron Microscopy Sciences | 17600 | |
| Lead citrate | Electron Microscopy Sciences | 17800 | |
| Lead nitrate | Electron microscopy Sciences | 17900 | |
| Leica UC7 ultracut microtome | Leica | ||
| Micro scale | Electron Microscopy Sciences | 62091-23 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19208 | EM grade, granular |
| Precision Thelco laboratory oven | Thelco | 51221159 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldricht | S2002 | |
| StatMark pen | Electron Microscopy Sciences | 72109-01 | |
| Tyrode solution | Electron Microscopy Sciences | 11760-05 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | powder |
Referências
- Lunardi, N., Oklopcic, A., Prillaman, M., Erisir, A., Jevtovic-Todorovic, V. Early exposure to general anesthesia disrupts spatial organization of presynaptic vesicles in nerve terminals of the developing subiculum. Molecular Neurobiology. 52 (2), 942-951 (2015).
- Lunardi, N., Ori, C., Erisir, A., Jevtovic-Todorovic, V. General anesthesia causes long-lasting disturbances in the ultrastructural properties of developing synapses in young rats. Neurotoxicity Research. 17 (2), 179-188 (2010).
- Sanchez, V., et al. General anesthesia causes long-term impairment of mitochondrial morphogenesis and synaptic transmission in developing rat brain. Anesthesiology. 115 (5), 992-1002 (2011).
- Boscolo, A., et al. The abolishment of anesthesia-induced cognitive impairment by timely protection of mitochondria in the developing rat brain: the importance of free oxygen radicals and mitochondria integrity. Neurobiology of Disease. 45 (3), 1031-1041 (2012).
- Aghajanian, G. K., Bloom, F. E. The formation of synaptic junctions in developing rat brain: a quantitative electron microscopy study. Brain Research. 6 (4), 716-727 (1967).
- Akert, K., Sandri, C., Santini, M. Significance of the Maillet method for cytochemical studies of synapses. Golgi centennial symposium; Perspectives in Neurobiology. , 387-399 (1975).
- Bloom, F. E., Aghajanian, G. K. Cytochemistry of synapses: selective staining for electron microscopy. Science. 154 (3756), 1575-1577 (1966).
- Bloom, F. E., Aghajanian, G. K. Fine structural and cytochemical analysis of the staining of synaptic junctions with phosphotungstic acid. Journal of Ultrastructure Research. 22 (5-6), 361-375 (1968).
- Burry, R. W., Lasher, R. S. A quantitative electron microscopy study of synapse formation in dispersed cell cultures of rat cerebellum stained either by O-UL or by E-PTA. Brain Research. 147 (1), 1-15 (1978).
- Pellegrino de Iraldi, A., Suburo, A. M. Electron staining of synaptic vesicles using the Champy-Maillet technique. Journal of Microscopy. 91 (2), 99-103 (1970).
- Pfenninger, K. H. The cytochemistry of synaptic densities. I. An analysis of the bismuth iodide impregnation method. Journal of Ultrastructural Research. 34 (1), 103-122 (1971).
- Hayat, M. A., Hayat, M. A. Chemical fixation. Principles and techniques of electron microscopy. Biological applications. , 4-84 (2000).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visual Experiments. (65), e3564 (2012).
- Hayat, M. A., Hayat, M. A. . Fixation for electron microscopy. , (1981).
- Behrman, E. J., et al., Revel, J. P., et al. The chemistry of osmium tetroxide fixation. The science of biological specimen preparation for microscopy and microanalysis. , 1-5 (1983).
- Nielson, A. J., Griffith, W. P. Reactions of osmium tetroxide with protein side chains and unsaturated lipids. Journal of the Chemical Society, Dalton Transactions. (6), 1084-1088 (1979).
- Nielson, A. J., Griffith, W. P. Tissue fixation by osmium tetroxide. A possible role for proteins. Journal of Hystochemistry & Cytochemistry. 27 (5), 997-999 (1979).
- Hanker, J. S., Deb, C., Wasserkrug, H. L., Seligman, A. M. Staining tissue for light and electron microscopy by bridging metals with multidentate ligands. Science. 152 (3729), 1631-1634 (1966).
- Zobel, C. R., Beer, M. The use of heavy metal salts as electron stains. International Review of Cytology. 18, 363-400 (1965).
- Silva, M. T., Guerra, F. C., Magalhaes, M. M. The fixative action of uranyl acetate in electron microscopy. Experientia. 24 (10), 1074 (1968).
- Terzakis, J. A. Uranyl acetate, a stain and a fixative. Journal of Ultrastructural Research. 22 (1-2), 168-184 (1968).
- Feldman, I., Jones, J., Cross, R. Chelation of uranyl ions by adenine nucleotides. Journal of the American Chemical Society. 89 (1), 49-53 (1967).
- Shah, D. O. Interaction of uranyl ions with phospholipid and cholesterol monolayer. Journal of Colloid and Interface Science. 29 (2), 210-215 (1969).
- Daems, W. T., Persijn, J. P. Section staining with heavy metals of osmium-fixed and formol-fixed mouse liver tissue. Journal. Royal Microscopical Society. 81 (pts 3&4), 199-201 (1963).
- Lombardi, L., Prenna, G., Okolicsanyi, L., Gautier, A. Electron staining with uranyl acetate: possible role of free amino groups. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 19 (3), 161-168 (1971).
- Cattini, P. A., Davies, H. G. Kinetics of lead citrate staining of thin sections for electron microscopy. Stain Technology. 58 (1), 29-40 (1983).
- Reynolds, E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron opaque stain in electron microscopy. Journal of Cell Biology. 17 (1), 208-212 (1963).
- Cattini, P. A., Davies, H. G. Observations on the kinetics of uranyl acetate and phosphotungstic acid staining of chromatin in thin sections for electron microscopy. Stain Technology. 59 (5), 291-304 (1984).
- Derksen, J. W., Meekes, H. Selective staining of nucleic acid containing structures by uranyl acetate-lead citrate. Micron and Microscopica Acta. 15 (1), 55-58 (1984).
- Frasca, J. M., Parks, V. R. A routine technique for double-staining ultrathin sections using uranyl and lead salts. Journal of Cell Biology. 25 (1), 157-161 (1965).
- Hanaichi, T., Sato, T., Iwamoto, T., Malavasi-Yamashiro, J., Hoshino, M., Mizuno, N. A stable lead by modification of Sato’s method. Journal of Electron Microscopy. 35 (3), 304-306 (1986).
- Sato, T. A modified method for lead staining of thin sections. Journal of Electron Microscopy. 17 (2), 158-159 (1968).
- Lever, J. D. A method of staining tissues with lead for electron microscopy. Nature. , 810-811 (1960).
- Derek, G., et al. Self organization of the Escherichia Coli chemotaxis network imaged with super-resolution light microscopy. Public Library of Science Biology. 7 (6), e1000137 (2009).
- Richards, J. G., Heyn, C., Forssmann, W. G. Ultrastructural histochemistry of nervous tissue. Techniques in Neuroanatomical Research. , 277-292 (1981).
- Wood, R. L., Luft, J. H. The influence of the buffer system on fixation with osmium tetroxide. Journal of Ultrastructural Research. 12 (1-2), 22-45 (1965).
- Louw, J., Williams, K., Harper, I. S., Walfe-Coote, S. A. Electron dense artifactual deposits in tissue sections: the role of ethanol, uranyl acetate and phosphate buffer. Stain Technology. 65 (5), 243-250 (1990).
