Préparation du tissu cérébral nouveau-né du rat pour l’analyse morphométrique ultrastructurale de la distribution synaptique des vésicules aux terminaux nerveux
Summary
Nous décrivons les procédures de traitement du tissu cérébral du rat nouveau-né afin d’obtenir des micrographies électroniques à haute résolution pour l’analyse morphométrique de la distribution des vésicules synaptiques aux terminaux nerveux. Les micrographies obtenues avec ces méthodes peuvent également être utilisées pour étudier la morphologie d’un certain nombre d’autres composants cellulaires et leurs relations structurelles dimensionnelles.
Abstract
Notre laboratoire et beaucoup d’autres ont exploité la haute puissance de résolution de la microscopie électronique à transmission pour étudier la morphologie et l’organisation spatiale des vésicules synaptiques. Afin d’obtenir des micrographies électroniques de haute qualité qui peuvent produire le degré de détail morphologique nécessaire à l’analyse quantitative de la distribution de vésicules présynaptiques, la préparation optimale des spécimens est essentielle. La fixation chimique est la première étape dans le processus de préparation des spécimens, et de la plus haute importance pour préserver l’ultrastructure fine. La fixation vasculaire avec une solution de glutaraldéhyde-formaldéhyde, suivie d’un traitement de spécimens coupés en vibratome avec du tétroxyde d’osmium, stabilise le nombre maximal de molécules, en particulier les protéines et les lipides, et entraîne une conservation supérieure de l’ultrastructure. Le tissu est ensuite traité avec une contre-coloration, une déshydratation séquentielle et une incorporation de résine. La coloration en bloc avec l’acétate d’uranyle (c.-à-d., coloration des tissus sectionnés par vibratome avant l’incorporation de résine) renforce le contraste endogène et stabilise les composants cellulaires contre l’extraction pendant le traitement des spécimens. Le contraste peut être augmenté davantage en appliquant l’acétate d’uranyle comme post-tache sur des sections ultrafines. La double coloration des coupes ultrafines avec le citrate de plomb après le traitement par l’acétate d’uranyle améliore également la résolution de l’image, en intensifiant l’opacité électronique des structures contenant de l’acide nucléique par liaison sélective du plomb à l’acétate d’uranyle. La microscopie électronique à transmission est un outil puissant pour caractériser les détails morphologiques des vésicules synaptiques et la quantification de leur taille et de leur organisation spatiale dans le bouton terminal. Cependant, parce qu’il utilise des tissus fixes, la microscopie électronique par transmission ne peut fournir que des informations indirectes sur les processus vivants ou en évolution. Par conséquent, d’autres techniques devraient être envisagées lorsque l’objectif principal est d’étudier les aspects dynamiques ou fonctionnels du trafic de vésicules synaptiques et de l’exocytose.
Introduction
Nous décrivons des méthodes pour la préparation du tissu cérébral nouveau-né de rat pour obtenir des micrographies électroniques de haute qualité pour l’analyse morphométrique en profondeur de la distribution spatiale des vésicules synaptiques aux bornes nerveuses1,2. Les micrographes à contraste élevé qui peuvent être obtenus en traitant des spécimens suivant ces méthodes peuvent également être utilisés pour étudier la morphologie détaillée d’un certain nombre de composants cellulaires et leurs relations structurelles dimensionnelles3,4.
Le microscope électronique à transmission (TEM) est un outil puissant pour étudier quantitativement la morphologie des organites et d’autres structures cellulaires. À partir de cette décennie, il n’y a pas d’autres méthodes d’investigation qui peuvent fournir le même degré de résolution des membranes lipidiques et des organites sans immuno-marquage, à l’exception de la cryofixation par congélation à haute pression. Cependant, les techniques de substitution de gel ne sont pas largement utilisées, et exigent normalement des équipements coûteux et des temps de préparation longs.
Afin de tirer parti de la haute puissance de résolution de TEM, la préparation optimale des spécimens est d’une importance primordiale. Les principaux objectifs de la préparation des spécimens sont de préserver la structure tissulaire avec une altération minimale de l’état vivant, d’améliorer le contraste des spécimens et de stabiliser le tissu contre l’extraction des composants cellulaires pendant la transformation et l’exposition à l’électron faisceau. De nombreux protocoles pour la préparation des tissus TEM ont été introduits et perfectionnés par plusieurs laboratoires au fil des ans. Beaucoup d’entre eux se sont concentrés sur des méthodes pour une visualisation optimale des vésicules synaptiques5,6,7,8,9,10,11. Parmi un certain nombre de méthodes bien établies d’étalon-or actuellement utilisées, nous avons choisi des procédures de fixation chimique, de post-fixation, de coloration en bloc, de déshydratation séquentielle, d’incorporation de résine et de post-coloration qui visent à préserver la structure tissulaire optimale et obtenir un excellent contraste d’image. Il est à noter que la préservation de l’ultrastructure fine peut être particulièrement difficile lorsque l’on travaille avec le tissu cérébral nouveau-né du rat. En fait, le système nerveux central des très jeunes animaux est caractérisé par une teneur en eau plus élevée que le cerveau adulte, un élargissement plus important des espaces extracellulaires et des connexions plus lâches entre les cellules12. Ceci rend le tissu nouveau-né de cerveau de rat profondément sensible aux changements dans l’osmolarité, et délicieusement sujettes au rétrécissement artifactuel et/ou au gonflement lorsqu’il est traité par des solutions séquentielles de différentes tonicité12. Par conséquent, nos méthodes employaient des solutions pour le traitement des spécimens qui sont d’osmolarité aussi proche que possible de celle du cerveau nouveau-né de rat. Notre objectif était d’obtenir des images de haute qualité en microscopie électronique à haute résolution pour l’évaluation quantitative de la distribution spatiale des vésicules synaptiques aux terminaux nerveux. Plus précisément, nous avons cherché à mesurer le nombre de vésicules dans la borne nerveuse, la distance des vésicules synaptiques de la membrane plasmatique présynaptique, le nombre de vésicules ancrées à la membrane pré-synaptique, la taille des vésicules synaptiques et la distances inter-vésicules1.
Une fixation chimique satisfaisante est une condition préalable à l’obtention de micrographies électroniques de haute qualité qui peuvent fournir le détail morphologique nécessaire à l’étude de la morphologie et de l’organisation spatiale des vésicules synaptiques. Bien que plusieurs modes de fixation existent, la fixation du tissu cérébral par perfusion vasculaire est décidément supérieure à d’autres méthodes. Depuis la fixation par perfusion vasculaire commence immédiatement après l’arrestation de la circulation systémique, il raccourcit l’intervalle entre la désoxygénation du tissu cérébral et la réticulation des protéines avec des fixatifs, entraînant des altérations minimales dans les cellules structure. En outre, il accomplit une pénétration rapide et uniforme, en raison du débit rapide du fixatif du lit vasculaire aux compartiments extracellulaires et cellulaires12,13,14. La fixation primaire avec le glutaraldéhyde, suivie d’une fixation secondaire (post-fixation) avec le tétroxyde d’osmium, donne une excellente préservation de la structure fine15,16,17. Un mélange de glutaraldéhyde et de paraformaldéhyde a l’avantage supplémentaire d’une pénétration plus rapide dans le tissu12.
Étant donné que les tissus biologiques ne sont pas suffisamment rigides pour être coupés en sections minces sans le soutien d’une matrice de résine, ils doivent être incorporés dans un milieu avant une coupe mince. Les résines époxy immiscibles à l’eau sont couramment utilisées comme milieu d’incorporation dans TEM. Lorsque ce type de matrice est utilisé, l’eau libre de tous les spécimens doit être remplacée par un solvant organique avant l’infiltration de résine. L’eau est enlevée en passant l’échantillon à travers une série de solutions de concentrations ascendantes d’éthanol et/ou d’acétone12. Dans ce protocole, les spécimens sont d’abord encastrés à plat entre les feuilles Aclar flexibles, puis incorporés dans une capsule. Le résultat final est le tissu situé à l’extrémité d’un bloc de résine cylindrique, qui a la géométrie idéale pour être le moins affecté par les vibrations survenant lors de la sectionnement du microtome.
La coloration avec des métaux lourds pour améliorer le contraste des tissus endogènes est un autre aspect important de la préparation des spécimens. Le contraste d’image dans le TEM est dû à la diffusion d’électrons par les atomes dans le tissu. Cependant, les matériaux biologiques consistent en grande partie en de faibles molécules de poids atomique (c.-à-d. le carbone, l’hydrogène, l’oxygène et l’azote). Par conséquent, la génération d’un contraste de diffusion suffisant nécessite l’incorporation d’atomes de poids atomique élevés dans les composants cellulaires du tissu. Ceci est obtenu par coloration de l’échantillon avec des métaux lourds12,18,19. Le tétroxyde d’osmium, l’uranium et le plomb, qui se lient fortement aux lipides, sont les métaux lourds les plus couramment utilisés comme taches d’électrons.
L’osmium (numéro atomique 76) est l’un des métaux les plus denses de l’existence. Il est à la fois un fixatif et une tache, bien que son rôle principal dans TEM est comme un fixatif fiable12. Parmi les différents protocoles de fixation utilisés, la méthode de double fixation avec le glutaraldéhyde suivie de l’osmium est la plus efficace pour réduire l’extraction des constituants cellulaires lors de la préparation des spécimens. Ces deux fixatifs sont utilisés pour stabiliser le nombre maximal de différents types de molécules, en particulier les protéines et les lipides, et entraîner une préservation supérieure de l’ultrastructure tissulaire12,14,15, le 16 , le 17.
L’uranium (numéro atomique 92) est le métal le plus lourd utilisé comme tache d’électrons, le plus souvent sous la forme d’acétate d’uranyle. De même que l’osmium, il agit comme une tache et fixatif, bien que son rôle principal dans TEM est comme une tache20,21. Les structures contenant des acides nucléiques et membraneuses sont fortement et préférentiellement colorées avec des sels d’uranyle dans des tissus d’aldéhyde-fixes22,23. Le traitement des tissus avec l’acétate d’uranyle après osmication et avant la déshydratation entraîne la stabilisation des structures membraneuses et acides nucléiques, ainsi qu’un contraste accru, et permet l’identification de certains détails structurels qui ne seraient pas être facilement décelés dans des spécimens colorés avec de l’osmium seul12,24,25. On pense que l’acétate d’uranyle peut stabiliser la structure fine en combinant avec l’osmium réduit qui a été déposé sur les membranes lipidiques pendant l’osmication24. Le contraste maximal est atteint lorsque l’acétate d’uranyle est appliqué avant l’incorporation et comme un post-tache dans les sections minces12.
Le plomb (numéro atomique 82) est la tache la plus courante utilisée pour le TEM et est principalement employée pour la post-coloration des coupes minces. Les sels de plomb ont une opacité élevée des électrons et montrent une affinité pour un large éventail de structures cellulaires, y compris les membranes, les protéines nucléaires et cytoplasmiques, les acides nucléiques et le glycogène26,27. Lorsque la méthode de coloration double est employée (c.-à-d., la coloration avec l’acétate d’uranyle est suivie par le traitement avec le plomb), ce dernier agit comme un révélateur de coloration de l’acétate d’uranyle. Par exemple, le plomb post-coloration de la chromatine fixée avec le glutaraldéhyde augmente l’absorption de l’acétate d’uranyle par un facteur de trois28,29,30,31,32. Le plomb améliore également la coloration transmise par d’autres métaux tels que l’osmium. On pense que les sels de plomb tachent les membranes des tissus osmium-fixés par attachement au groupe polaire des phosphatures en présence de l’osmium33réduit. Un inconvénient potentiel de coloration avec l’acétate d’uranyle et le plomb, en particulier pour les durées prolongées, est que de nombreux éléments structuraux différents sont colorés de manière égale et non-spécifique, et ne peuvent donc pas être facilement distingués les uns des autres12 .
L’introduction récente de sources lumineuses alternatives, telles que la microscopie optique de localisation photo-activée à Super résolution, a considérablement amélioré la résolution34de la microscopie photonique. Cependant, parce que la microscopie photonique repose sur des méthodes histochimiques et immuno-cytochimiques pour visualiser des protéines ou des enzymes marquées individuellement, la puissance de TEM pour afficher tous les éléments structurels à la fois reste inégalée pour une étude approfondie de la morphologiques et les relations dimensionnelles des structures tissulaires. En particulier, aucune autre technique ne peut fournir le détail morphologique nécessaire pour effectuer une analyse morphométrique de la distribution de vésicules synaptiques à des boutons nerveuses pré-synaptiques. Néanmoins, il est important de noter que les micrographies électroniques capturent la structure du tissu après la mort de l’organisme, et qu’ils ne peuvent donc pas fournir d’informations sur la dynamique du trafic de vésicules présynaptiques et de l’exocytose. Par conséquent, d’autres outils, tels que l’imagerie en direct de la teinture FM et l’électrophysiologie à pinces, doivent être pris en considération lorsque l’objectif principal est d’étudier les aspects dynamiques et/ou fonctionnels du trafic de vésicules synaptiques et de l’exocytose.
Protocol
Representative Results
Discussion
La manipulation des sections tissulaires pendant la préparation des échantillons pour TEM nécessite un degré considérable de finesse, de concentration et de patience. Lors de l’utilisation d’une micropipette pour ajouter et enlever des solutions, les spécimens peuvent être aspirés dans l’embout de la pipette par tension de surface, il faut donc prendre soin d’éviter les lésions tissulaires par la pipette. En outre, certaines étapes de la séquence de déshydratation peuvent être aussi rapides que 1 mi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce manuscrit a été appuyé par NIH/NIGMS K08 123321 (à N.L.) et par des fonds du département d’anesthésiologie de l’Université de Virginie. Les auteurs souhaitent remercier alev Erisir (département de biologie, Université de Virginie, Charlottesville, VA) pour l’excellente formation et l’assistance technique avec TEM, et pour sa critique inestimable de manuscrit. Les auteurs remercient également l’installation de microscopie électronique avancée à l’Université de Virginie pour l’assistance technique avec les échantillons de coupe et de post-coloration.
Materials
| 4% Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19170 | acqueous |
| 50% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16310 | EM grade, acqueous |
| Aclar 33 C embedding film | Electron Microscopy Sciences | 50425-25 | 7.8 mil thickness, size 8"x10" |
| BEEM capsule holder | Electron Microscopy Sciences | 69916 | holds size "00" capsules |
| BEEM embedding capsules | Electron Microscopy Sciences | 70021 | size "00", flat |
| Butler block trimmer | Electron Microscopy Sciences | 69945-01 | |
| Camel hair paint brush | Electron Microscopy Sciences | 65576-01 | |
| Disc punch | Electron Microscopy Sciences | 77850-09 | |
| Embed 812 kit | Electron Microscopy Sciences | 14120 | |
| Lead acetate | Electron Microscopy Sciences | 17600 | |
| Lead citrate | Electron Microscopy Sciences | 17800 | |
| Lead nitrate | Electron microscopy Sciences | 17900 | |
| Leica UC7 ultracut microtome | Leica | ||
| Micro scale | Electron Microscopy Sciences | 62091-23 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19208 | EM grade, granular |
| Precision Thelco laboratory oven | Thelco | 51221159 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldricht | S2002 | |
| StatMark pen | Electron Microscopy Sciences | 72109-01 | |
| Tyrode solution | Electron Microscopy Sciences | 11760-05 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | powder |
Referências
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