Vorbereitung des Neugeborenen Ratsprofels für die ultrastrukturelle Morphometrische Analyse der Verbreitung synaptischer Bläschen an Nerven-Terminals

Summary

Wir beschreiben Verfahren zur Verarbeitung von Neugeborenen-Ratten-Hirngewebe, um hochauflösende Elektronenmikrogramme für die morphometrische Analyse der synaptischen Vesikelverteilung an Nerventerminals zu erhalten. Die mit diesen Methoden gewonnenen Mikrographen können auch verwendet werden, um die Morphologie einer Reihe anderer zellulärer Komponenten und deren dimensionale strukturelle Zusammenhänge zu untersuchen.

Abstract

Unser Labor und viele andere haben die hohe Auflösungskraft der Transmissionselektronenmikroskopie genutzt, um die Morphologie und räumliche Organisation synaptischer Bläschen zu untersuchen. Um qualitativ hochwertige Elektronenmikrographen zu erhalten, die den für die quantitative Analyse der präsynaptischen Vesikelverteilung notwendigen morphologischen Grad ergeben können, ist eine optimale Probenvorbereitung entscheidend. Die chemische Fixierung ist der erste Schritt im Prozess der Probenvorbereitung und von größter Bedeutung für die Erhaltung der feinen Ultrastruktur. Gefäßfixierung mit einer Glutaraldehyd-Formaldehyd-Lösung, gefolgt von der Behandlung von vibratom-setionierten Proben mit Osmium-Tetroxid, stabilisiert die maximale Anzahl von Molekülen, insbesondere Proteinen und Lipiden, und führt zu einer überlegenen Konservierung Der Ultrastruktur. Die Gewebe werden dann mit Gegenfärbung, sequenzieller Dehydrierung und Harzeinbettung verarbeitet. En bloc Färbung mit Uranyl-Acetat (d.h. Färbung von Vibratom-seztem Gewebe vor der Harzeinbettung) verbessert den endogenen Kontrast und stabilisiert Zellkomponenten gegen die Extraktion während der Probenverarbeitung. Der Kontrast kann durch den Einsatz von Uranyl-Acetat als Post-Fleck auf ultradünnen Abschnitten noch verstärkt werden. Die Doppelfärbung von ultradünnen Abschnitten mit Bleicitrat nach der Urangel-Acetat-Behandlung verbessert auch die Bildauflösung, indem die Elektronenundurchlässigkeit der nukleinsäurehaltigen Strukturen durch selektive Bindung von Blei zu Uranyl-Acetat verstärkt wird. Die Transmissionselektronenmikroskopie ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Charakterisierung der morphologischen Details synaptischer Bläschen und zur Quantifizierung ihrer Größe und räumlichen Organisation im Terminal Bouton. Da sie jedoch festes Gewebe verwendet, kann die Transmissionselektronenmikroskopie nur indirekte Informationen über lebendige oder sich entwickelnde Prozesse liefern. Daher sollten andere Techniken in Betracht gezogen werden, wenn das Hauptziel darin besteht, dynamische oder funktionale Aspekte des synaptischen Vesikelhandels und der Exozytose zu untersuchen.

Introduction

Wir beschreiben Methoden zur Herstellung von Neugeborenen-Ratten-Hirngewebe, um hochwertige Elektronenmikrogramme für eine vertiefte morphometrische Analyse der synaptischen Vesikelverteilung an Nerventerminals 1^,2zu erhalten. Die kontrastreichen Mikrographen, die durch die Verarbeitung von Proben nach diesen Methoden gewonnen werden können, können auch verwendet werden, um die detaillierte Morphologie einer Reihe von zellulären Komponenten^undihre dimensionalen Strukturverhältnisse 3, 4 zu untersuchen.

Das Transmissionselektronenmikroskop (TEM) ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Morphologie von Organellen und anderen zellulären Strukturen quantitativ zu untersuchen. Ab diesem Jahrzehnt gibt es keine anderen Untersuchungsmethoden mehr, die ohne Immunmarkierung den gleichen Auflösungsgrad von Lipidmembranen und Organellen ohne Immunmarkierung bieten können, mit Ausnahme der Kryofixierung durch Hochdruck-Einfrieren. Gefriersubstitutionstechniken sind jedoch nicht weit verbreitet und erfordern in der Regel teure Geräte und lange Vorbereitungszeiten.

Um die hohe Auflösungskraft von TEM nutzen zu können, ist die optimale Probenvorbereitung von größter Bedeutung. Die Hauptziele der Probenvorbereitung sind die Erhaltung der Gewebestruktur mit minimaler Veränderung vom Lebenszustand, die Verbesserung des Probenkontralats und die Stabilisierung des Gewebes gegen die Extraktion von Zellkomponenten während der Verarbeitung und Exposition gegenüber dem Elektron. Strahl. Zahlreiche Protokolle zur TEM-Gewebeaufbereitung wurden im Laufe der Jahre von mehreren Labors eingeführt und perfektioniert. Viele von ihnen haben sich auf Methoden zur optimalen Visualisierung von synaptischen Bläschen 5^,6,7^{, 8,}9,¹⁰,^{11konzentriert.} Unter einer Reihe von etablierten, goldenen Standardmethoden, die derzeit im Einsatz sind, wählten wir Verfahren für chemische Fixierung, Nachfixierung, en bloc Färbung, sequentielle Dehydrierung, Harzeinbettung und Post-Färbung, die darauf abzielen, optimale Gewebestruktur zu erhalten und Einen hervorragenden Bildkontrast erzielen. Die Erhaltung der feinen Ultrastruktur kann besonders herausfordernd sein, wenn man mit dem neugeborenen Ratten-Hirngewebe arbeitet. Tatsächlich zeichnet sich das zentrale Nervensystem von sehr jungen Tieren durch einen höheren Wassergehalt aus als das erwachsene Gehirn, eine prominentere Vergrößerung der extrazellulären Räume und lockereVerbindungen zwischen den Zellen 12. Dies macht das neugeborene Ratten-Hirngewebe zutiefst empfindlich gegenüber Veränderungen in der Osmolarität und ist äußerst anfällig für handwerkliche Schrumpfung and/oder Schwellungen, wenn sie durch sequenzielle Lösungen unterschiedlicherTonizität 12 verarbeitet werden. Deshalb haben unsere Methoden Lösungen für die Probenverarbeitung eingesetzt, die so nah wie möglich an die Ratte neugeborenen Gehirns heranreichen. Unser Ziel war es, qualitativ hochwertige, hochauflösende Elektronenmikroskopie-Bilder für die quantitative Beurteilung der synaptischen Vesikelräumung an Nerventerminals zu erhalten. Insbesondere haben wir versucht, die Anzahl der Bläschen innerhalb des Nerventerminals, den Abstand von synaptischen Bläschen von der präsynaptischen Plasmamembran, die Anzahl der Vesikel, die an der vorsynaptischen Membran angedockt sind, die Größe der synaptischen Bläschen und die Intervesikelabstände¹.

Eine befriedigende chemische Fixierung ist eine Voraussetzung für die Erlangung hochwertiger Elektronenmikrographen, die die morphologischen Details liefern können, die für die Untersuchung der synaptischen Bläschen Morphologie und räumliche Organisation notwendig sind. Obwohl es mehrere Arten der Fixierung gibt, ist die Fixierung des Hirngewebes durch Gefäßdurchblutung deutlich überlegen gegenüber anderen Methoden. Da die Fixierung durch Gefäßperfusion unmittelbar nach der Verhaftung der systemischen Zirkulation beginnt, verkürzt sie das Intervall zwischen der Entsaugung des Hirngewebes und der Vernetzung von Proteinen mit Fixierungen, was zu minimalen Veränderungen in der Zelle führt. struktur. Darüber hinaus erreicht es eine schnelle und gleichmäßige Durchdringung, da das Fixierungsmittel schnell vom Gefäßbett in die extrazellulären und zellulären Fächer 12^{, 13,14fließen}. Die primäre Fixierung mit Glutaraldehyd, gefolgt von der sekundären Fixierung (Nachfixierung) mit Osmium-Tetroxid,^führtzu einer hervorragenden Erhaltung der feinen Struktur^{15, 16,17.} Eine Mischung aus Glutaraldehyd und Paraformaldehyd^hatden zusätzlichen Vorteil einer schnelleren Eindringung in das Gewebe 12.

Da biologische Gewebe nicht starr genug sind, um ohne die Unterstützung einer Harzmatrix in dünne Abschnitte geschnitten zu werden, müssen sie vor dünner Abtrennung in ein Medium eingebettet werden. Wasservermischte Epoxidharze werden häufig als Einbettungsmedium in TEM verwendet. Wenn diese Art der Matrix verwendet wird, muss das freie Wasser der Probe vor der Infiltration des Harzes durch ein organisches Lösungsmittel ersetzt werden. Das Wasser wird entfernt, indem das Exemplar durch eine Reihe von Lösungen aufsteigender Konzentrationen von Ethanol und/oder Aceton¹²geleitet wird. In diesem Protokoll werden die Proben zunächst flach zwischen flexiblen Aklarplatten eingebettet und dann in eine Kapsel eingebettet. Das Endergebnis ist das Gewebe, das an der Spitze eines zylindrischen Harzblocks liegt, der die ideale Geometrie hat, um am wenigsten von Vibrationen beeinflusst zu werden, die während der Mikrotome Sektionierung entstehen.

Die Färbung mit Schwermetallen zur Verbesserung des endogenen Gewebekontrakts ist ein weiterer wichtiger Aspekt der Probenvorbereitung. Der Bildkontrast in TEM ist auf die Elektronenstreuung durch die Atome im Gewebe zurückzuführen. Biologische Materialien bestehen jedoch zum großen Teil aus Molekülen mit geringem atomarem Gewicht (z.B. Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff und Stickstoff). Die Erzeugung eines ausreichenden Streukontrabens erfordert daher die Aufnahme von hochatomaren Akomen in die zellulären Bestandteile des Gewebes. Dies wird durch die Färbung des Exemplars mit Schwermetallen 12^,18,19erreicht. Osmium-Tetroxid, Uran und Blei, die stark an Lipide binden, sind die häufigsten Schwermetalle, die als Elektronenflecken verwendet werden.

Osmium (Atomzahl 76) ist eines der dichtesten Metalle, die es gibt. Es ist sowohl ein Fixativ als auch ein Fleck, obwohl seine primäre Rolle in TEM als zuverlässiges^Fixativ12 ist. Unter den verschiedenen Fixierungsprotokollen, die verwendet werden, ist die Methode der doppelten Fixierung mit Glutaraldehyd, gefolgt von Osmium, die am effektivsten bei der Reduzierung der Extraktion von Zellbestandteilen während der Probenvorbereitung. Diese beiden Fixate werden verwendet, um die maximale Anzahl der verschiedenen Arten von Molekülen, insbesondere Proteine und Lipide, zu stabilisieren und zu einer überlegenen Erhaltung des Gewebes ultrastruktur^12,14,15 , ^{16 , 17}. August

Uran (Atomzahl 92) ist das schwerste Metall, das als Elektronenfleck verwendet wird, in der Regel in Form von Uranyl-Acetat. Ähnlich wie Osmium wirkt es als Fleck und Fixiermittel, obwohl seine Hauptrolle bei TEM als Fleck 20^{, 21.} Nukleische säurehaltige und Membranstrukturen werden stark und vorzugsweise mit Uranyl-Salzen in AldehydfestenGeweben 22^,23befleckt. Die Behandlung von Geweben mit Uranyl-Acetat nach Osmication und vor Austrocknung führt zu einer Stabilisierung von Membran-und Nukleinsäurehaltigen Strukturen sowie einem verbesserten Kontrast und ermöglicht die Identifizierung einiger struktureller Details, die nicht In Exemplaren, die allein^12,24,25mit Osmium befleckt sind, kann man leicht erkennen. Es wird vermutet, dass Uranyl-Acetat die feine Struktur stabilisieren kann, indem man mit reduziertem Osmium kombiniert wird, das während der Osmication^aufFettmembranen abgelagert wurde. Ein maximaler Kontrast wird erreicht, wenn Uranyl-Acetat vor der Einbettung und als Post-Fleck indünnen Abschnitten 12 aufgetragen wird.

Blei (Atomzahl 82) ist der häufigste Fleck, der für TEM verwendet wird und vor allem für die Nachfärbung dünner Abschnitte verwendet wird. Bleisalze haben eine hohe Elektronenundurchlässigkeit und zeigen eine Affinität zu einer Vielzahl von Zellstrukturen, darunter Membranen, nukleare und zytoplasmische Proteine, Nukleinsäuren undGlykogen 26,^27. Bei der Doppelfärbung (d.h. die Färbung mit Uranyl-Acetat folgt eine Behandlung mit Blei), fungiert diese als Entwickler der Urankl-Acetat-Färbung. Zum Beispiel erhöht die Blei-Post-Färbung von Chromatin, die mit Glutaraldehyd fixiert ist,^dieUranyl-Acetat-Aufnahme um den Faktor drei^{28,29,30, 31,32}. Blei verstärkt auch die Färbung, die durch andere Metalle wie Osmium vermittelt wird. Es wird vermutet, dass Bausalze die Membranen von Osmium-Festgeweben beflecken, indem sie sich in Anwesenheit von reduziertem Osmium 33 andie polare Gruppe von Phosphatiden anhängen. Ein potenzieller Nachteil der Färbung sowohl mit Uranyl-Acetat als auch mit Blei, insbesondere bei längeren Längen, ist, dass viele verschiedene Strukturelemente gleich und nicht spezifisch gefärbt werden und daher nicht leicht voneinander zu unterscheiden sind 12 12 .

Die jüngste Einführung alternativer Lichtquellen, wie etwa in der optischen, photoaktivierten fotoaktivierten Lokalisierungsmikroskopie, hat die Lichtmikroskopie³⁴deutlich verbessert. Da die Lichtmikroskopie jedoch auf histochemische und immunzytochemische Methoden zur Visualisierung von individuell gekennzeichneten Proteinen oder Enzymen beruht, bleibt die Kraft von TEM, alle Strukturelemente auf einmal darzustellen, für eine eingehende Untersuchung der Morphologie und Maßverhältnisse von Gewebestrukturen. Insbesondere kann keine andere Technik die morphologischen Details liefern, die notwendig sind, um die morphometrische Analyse der synaptischen Vesikelverteilung an vorsynaptischen Nervenbausstrichen durchzuführen. Dennoch ist es wichtig zu beachten, dass Elektronenmikrogramme die Struktur des Gewebes nach dem Tod des Organismus erfassen und daher keine Informationen über die Dynamik des vorsynaptischen Vesikelhandels und der Exozytose liefern können. Daher sollten andere Werkzeuge, wie FM-Farbstoff-Live-Bildgebung und Patch-Clamp Elektrophysiologie, in Betracht gezogen werden, wenn das Hauptziel ist, dynamische und funktionale Aspekte des synaptischen Bläschellehandels und der Exozytose zu untersuchen.

Protocol

Alle Studien wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Virginia (Charlottesville, VA) genehmigt und in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Richtlinien durchgeführt. 1. Fixierung durch Gefäßperfusion NOTE: Eine allgemeine Beschreibung der Methode der Ratten-Hirndurchblutung wurde bereits in dieser Zeitschrift13 detailliert beschrieben und ist außerhalb des Rahmens dieses Prot…

Representative Results

Allgemeine Kriterien, die meist als Indikator für eine zufriedenstellende oder fehlerhafte Konservierung von Proben für TEM akzeptiert werden, wurden festgelegt. Diese Kriterien werden in vier ausgewählten Elektronenmikrographen (zwei Beispiele für optimale Präparate, zwei Beispiele für mangelhafte Präparate) veranschaulicht, die durch die Behandlung des jungen Rattenhirngewebes nach den in diesem Protokoll beschriebenen Methoden gewonnen wurden. In der Regel erscheint ein hochwertiges …

Discussion

Der Umgang mit Gewebeabschnitten während der Probenvorbereitung für TEM erfordert ein hohes Maß an Finesse, Konzentration und Geduld. Bei der Verwendung einer Mikropipette können durch Oberflächenspannung Proben in die Pipette-Spitze gesaugt werden, daher sollte man sehr darauf achten, dass die Pipette durch Gewebeschäden vermieden wird. Außerdem können bestimmte Schritte der Dehydratationssequenz so schnell wie 1 min sein, daher muss der Bediener schnell arbeiten, um sicherzustellen, dass der nächste Dehydrieru…

Materials

4% Osmium tetroxide	Electron Microscopy Sciences	19170	acqueous
50% Glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16310	EM grade, acqueous
Aclar 33 C embedding film	Electron Microscopy Sciences	50425-25	7.8 mil thickness, size 8"x10"
BEEM capsule holder	Electron Microscopy Sciences	69916	holds size "00" capsules
BEEM embedding capsules	Electron Microscopy Sciences	70021	size "00", flat
Butler block trimmer	Electron Microscopy Sciences	69945-01
Camel hair paint brush	Electron Microscopy Sciences	65576-01
Disc punch	Electron Microscopy Sciences	77850-09
Embed 812 kit	Electron Microscopy Sciences	14120
Lead acetate	Electron Microscopy Sciences	17600
Lead citrate	Electron Microscopy Sciences	17800
Lead nitrate	Electron microscopy Sciences	17900
Leica UC7 ultracut microtome	Leica
Micro scale	Electron Microscopy Sciences	62091-23
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	19208	EM grade, granular
Precision Thelco laboratory oven	Thelco	51221159
Sodium azide	Sigma-Aldricht	S2002
StatMark pen	Electron Microscopy Sciences	72109-01
Tyrode solution	Electron Microscopy Sciences	11760-05
Uranyl acetate	Electron Microscopy Sciences	22400	powder