Preparación del tejido cerebral de rata recién nacida para el análisis Morfolométrico ultraestructural de la distribución de vesículas sinápticas en los terminales nerviosos
Summary
Describimos procedimientos para el procesamiento de tejido cerebral de rata recién nacida para obtener micrografías electrónicas de alta resolución para el análisis morfolométrico de la distribución de vesículas sinápticas en los terminales nerviosos. Los micrográficos obtenidos con estos métodos también se pueden utilizar para estudiar la morfología de un número de otros componentes celulares y sus relaciones estructurales dimensionales.
Abstract
Nuestro laboratorio y muchos otros han explotado el alto poder resolutivo de la microscopía electrónica de transmisión para estudiar la morfología y la organización espacial de las vesículas sinápticas. Con el fin de obtener micrografías electrónicas de alta calidad que pueden producir el grado de detalle morfológico necesario para el análisis cuantitativo de la distribución de las vesículas presinápticas, la preparación óptima de la muestra es fundamental. La fijación química es el primer paso en el proceso de preparación de la muestra, y de máxima importancia para preservar la ultraestructura fina. La fijación vascular con una solución de glutaraldehído-formaldehído, seguida por el tratamiento de las muestras seccionadas por vibratome con tetroóxido de osmio, estabiliza el número máximo de moléculas, especialmente las proteínas y los lípidos, y resulta en una conservación superior de ultrestructure. A continuación, el tejido se procesa con antimanchas, deshidratación secuencial e incrustación de resina. La tinción en bloque con acetato de uranil (es decir, tinción de tejido seccionado con vibratome antes de la incrustación de resina) mejora el contraste endógeno y estabiliza los componentes celulares contra la extracción durante el procesamiento de muestras. El contraste se puede aumentar aún más aplicando el acetato de uranil como un post-mancha en las secciones ultrafinas. La doble tinción de secciones ultrafinas con citrato de plomo después del tratamiento con acetato de uranil también mejora la resolución de la imagen, intensificando la opacidad del electrón de las estructuras que contienen ácido nucleico mediante la Unión selectiva del plomo al acetato de uranil. La microscopía electrónica de transmisión es una poderosa herramienta para la caracterización de los detalles morfológicos de las vesículas sinápticas y la cuantificación de su tamaño y organización espacial en el Bouton terminal. Sin embargo, debido a que utiliza tejido fijo, la microscopía electrónica de transmisión solo puede proporcionar información indirecta con respecto a los procesos vivos o en evolución. Por lo tanto, deben tenerse en cuenta otras técnicas cuando el objetivo principal es estudiar aspectos dinámicos o funcionales del tráfico de vesículas sinápticas y la exocitosis.
Introduction
Describimos métodos para la preparación del tejido cerebral de rata recién nacida para obtener micrografías electrónicas de alta calidad para el análisis morfolométrico en profundidad de la distribución espacial de las vesículas sinápticas en las terminales nerviosas1,2. Los micrográficos de alto contraste que se pueden obtener mediante el procesamiento de especímenes siguiendo estos métodos también se pueden utilizar para estudiar la morfología detallada de una serie de componentes celulares y sus relaciones estructurales dimensionales3,4.
El microscopio electrónico de transmisión (TEM) es una poderosa herramienta para estudiar cuantitativamente la morfología de los organelos y otras estructuras celulares. A partir de esta década, no hay otros métodos de investigación que pueden proporcionar el mismo grado de resolución de las membranas lipídicas y organelos sin el etiquetado inmunológico, con la excepción de la criofixación por congelación a alta presión. Sin embargo, las técnicas de sustitución de congelación no se utilizan ampliamente, y normalmente requieren equipo costoso y largos tiempos de preparación.
Con el fin de aprovechar el alto poder de resolución de TEM, la preparación óptima de la muestra es de suma importancia. Los objetivos principales de la preparación de muestras son preservar la estructura del tejido con una alteración mínima del estado vivo, mejorar el contraste de la muestra y estabilizar el tejido contra la extracción de componentes celulares durante el procesamiento y la exposición al electrón rayo. Varios laboratorios han introducido y perfeccionado numerosos protocolos para la preparación de tejidos TEM a lo largo de los años. Muchos de ellos se han centrado en métodos para la visualización óptima de vesículas sinápticas5,6,7,8,9,10,11. Entre una serie de métodos estándar de oro bien establecidos actualmente en uso, elegimos procedimientos para la fijación de productos químicos, fijación posterior, tinción en bloque, deshidratación secuencial, incrustación de resina y tinción post que tienen como objetivo preservar la estructura del tejido óptimo y lograr un excelente contraste de imagen. Cabe destacar que la preservación de la ultraestructura fina puede ser particularmente difícil cuando se trabaja con tejido cerebral de rata recién nacida. De hecho, el sistema nervioso central de animales muy jóvenes se caracteriza por un mayor contenido de agua que el cerebro adulto, una ampliación más prominente de los espacios extracelulares y conexiones más sueltas entre las células12. Esto hace que el tejido cerebral de rata recién nacido profundamente sensible a los cambios en la osmolaridad, y exquisitamente propenso a la contracción artística y/o hinchazón cuando se procesa a través de soluciones secuenciales de diferentes tonicidad12. Por lo tanto, nuestros métodos emplearon soluciones para el procesamiento de muestras que son de osmolaridad lo más cerca posible a la del cerebro de rata recién nacido. Nuestro objetivo era obtener imágenes de microscopía electrónica de alta calidad y alta resolución para la evaluación cuantitativa de la distribución espacial de las vesículas sinápticas en los terminales nerviosos. Concretamente, procuramos medir el número de vesículas dentro del terminal nervioso, la distancia de las vesículas sinápticas de la membrana plasmática presináptica, el número de vesículas acopladas a la membrana presináptica, el tamaño de las vesículas sinápticas y el distancias entre las vesículas1.
La fijación química satisfactoria es un prerrequisito para la obtención de micrografías electrónicas de alta calidad que pueden proporcionar el detalle morfológico necesario para estudiar la morfología de las vesículas sinápticas y la organización espacial. Aunque existen varios modos de fijación, la fijación del tejido cerebral por perfusión vascular es decididamente superior a otros métodos. Dado que la fijación a través de la perfusión vascular comienza inmediatamente después de la detención de la circulación sistémica, acorta el intervalo entre la desoxigenación del tejido cerebral y el reticulamiento de proteínas con fijadores, resultando en alteraciones mínimas en la célula Estructura. Además, logra una penetración rápida y uniforme, debido al rápido flujo del fijador desde el lecho vascular hasta los compartimentos extracelulares y celulares12,13,14. La fijación primaria con glutaraldehído, seguida de una fijación secundaria (post-fijación) con tetroóxido de osmio, produce una excelente preservación de la estructura fina15,16,17. Una mezcla de glutaraldehído y paraformaldehído tiene la ventaja adicional de una penetración más rápida en el tejido12.
Dado que los tejidos biológicos no son lo suficientemente rígidos para ser cortados en secciones delgadas sin el apoyo de una matriz de resina, necesitan ser incrustados en un medio antes de seccionar delgadas. Las resinas epoxi inmiscibles en agua se utilizan comúnmente como medio de incrustación en TEM. Cuando se utiliza este tipo de matriz, el agua libre de todas las muestras debe sustituirse por un disolvente orgánico antes de la infiltración de resina. El agua se retira pasando la muestra a través de una serie de soluciones de concentraciones ascendentes de etanol y/o acetona12. En este protocolo, los especímenes son primero planos incrustados entre láminas flexibles de Aclar, y luego se incrustan en una cápsula. El resultado final es el tejido situado en la punta de un bloque de resina cilíndrica, que tiene la geometría ideal para ser menos afectada por las vibraciones que surgen durante la seccionamiento del microtomo.
La tinción con metales pesados para mejorar el contraste de tejido endógeno es otro aspecto importante de la preparación de muestras. El contraste de la imagen en TEM se debe a la dispersión de electrones por los átomos en el tejido. Sin embargo, los materiales biológicos consisten en gran parte de moléculas de bajo peso atómico (es decir, carbono, hidrógeno, oxígeno y nitrógeno). Por lo tanto, la generación de suficiente contraste de dispersión requiere la incorporación de átomos de alto peso atómico en los componentes celulares del tejido. Esto se logra a través de la tinción de la muestra con metales pesados12,18,19. El tetroóxido de osmio, el uranio y el plomo, que se unen fuertemente a los lípidos, son los metales pesados más comunes utilizados como manchas de electrones.
El osmio (número atómico 76) es uno de los metales más densos que existen. Es un fijador y una mancha, aunque su papel principal en TEM es como un fijador confiable12. Entre los diversos protocolos de fijación en uso, el método de doble fijación con glutaraldehído seguido de osmio es el más eficaz en la reducción de la extracción de componentes celulares durante la preparación de la muestra. Estos dos fijadores se utilizan para estabilizar el número máximo de diferentes tipos de moléculas, especialmente proteínas y lípidos, y resultan en una preservación superior de la ultraestructura de los tejidos12,14,15, 16 , 17.
El uranio (número atómico 92) es el metal más pesado utilizado como mancha de electrones, más típicamente en forma de acetato de uranil. Al igual que el osmio, actúa como una mancha y fijador, aunque su papel principal en TEM es como una mancha20,21. Las estructuras membranosas y que contienen ácido nucleico están fuertemente y preferentemente manchadas con sales de uranil en los tejidos de aldehído fijo22,23. El tratamiento de los tejidos con acetato de uranil después de la osmicación y antes de la deshidratación da como resultado la estabilización de estructuras que contienen ácido membranoso y nucleico, así como un mayor contraste, y permite la identificación de algunos detalles estructurales que no ser detectado fácilmente en especímenes manchados con osmio solo12,24,25. Se cree que el acetato de uranil puede estabilizar la estructura fina combinando con el osmio reducido que se ha depositado en las membranas lipídicas durante la osmication24. El contraste máximo se logra cuando el acetato de uranil se aplica antes de la incrustación y como una mancha posterior en las secciones delgadas12.
El plomo (número atómico 82) es la mancha más común utilizada para TEM y se emplea principalmente para la posttinción de secciones delgadas. Las sales de plomo tienen una alta opacidad de electrones y muestran afinidad por una amplia gama de estructuras celulares, incluyendo membranas, proteínas nucleares y citoplasmáticas, ácidos nucleicos y glucógeno26,27. Cuando se emplea el método de tinción doble (es decir, la tinción con acetato de uranil es seguida por el tratamiento con plomo), este último actúa como un desarrollador de tinción de acetato de uranil. Por ejemplo, el plomo después de la coloración de la cromatina fijada con glutaraldehído incrementa la captación de acetato de uranil por un factor de tres28,29,30,31,32. El plomo también mejora la coloración que imparten otros metales como el osmio. Se cree que las sales de plomo mancha las membranas de los tejidos fijos de osmio al unirse al grupo polar de fosfatos en presencia de un reducido osmio33. Una posible desventaja de la tinción con el acetato de uranil y el plomo, especialmente para las duraciones prolongadas, es que muchos elementos estructurales diferentes se tiñen por igual y no específicamente, y por lo tanto no pueden distinguirse fácilmente unos de otros12 .
La reciente introducción de fuentes de luz alternativas, como la microscopía óptica de localización fotográfica de superresolución, ha mejorado significativamente la resolución34de microscopía de luz. Sin embargo, debido a que la microscopía ligera se basa en métodos histoquímicos e inmunes-citoquímicos para visualizar proteínas o enzimas etiquetadas individualmente, la potencia de TEM para mostrar todos los elementos estructurales a la vez sigue siendo insuperable para el estudio en profundidad de la morfología y las relaciones dimensionales de las estructuras tisulares. En particular, ninguna otra técnica puede proporcionar el detalle morfológico necesario para realizar análisis morfológicos de la distribución de las vesículas sinápticas en los Boutons del nervio presináptico. Sin embargo, es importante señalar que los micrográficos electrónicos capturan la estructura del tejido después de que el organismo muere, y por lo tanto no pueden proporcionar información sobre la dinámica del tráfico de vesículas pre-sináptica y la exocitosis. Por lo tanto, otras herramientas, tales como el tinte FM-imágenes en vivo y electrofisiología patch-Clamp, deben tenerse en cuenta cuando el objetivo principal es estudiar los aspectos dinámicos y/o funcionales del tráfico de vesículas sinápticas y la exocitosis.
Protocol
Representative Results
Discussion
El manejo de las secciones de tejido durante la preparación de la muestra para TEM requiere un grado considerable de delicadeza, concentración y paciencia. Cuando se utiliza una micropipeta para añadir y eliminar soluciones, las muestras se pueden succionar en la punta de la Piera por tensión superficial, por lo que se debe tener un gran cuidado para evitar daños tisulares por la picuta. Además, ciertos pasos de la secuencia de deshidratación pueden ser tan rápidos como 1 minuto, por lo tanto, el operador debe tr…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este manuscrito fue apoyado por NIH/NIGMS K08 123321 (a N.L.) y por fondos del Departamento de Anestesiología de la Universidad de Virginia. Los autores desean agradecer a Alev Erisir (Departamento de biología, Universidad de Virginia, Charlottesville, VA) por su excelente formación y asistencia técnica con TEM, y por su inestimable crítica manuscrita. Los autores también agradecen la instalación de microscopía electrónica avanzada en la Universidad de Virginia para obtener asistencia técnica con la sección de muestras y post-tinción.
Materials
| 4% Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19170 | acqueous |
| 50% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16310 | EM grade, acqueous |
| Aclar 33 C embedding film | Electron Microscopy Sciences | 50425-25 | 7.8 mil thickness, size 8"x10" |
| BEEM capsule holder | Electron Microscopy Sciences | 69916 | holds size "00" capsules |
| BEEM embedding capsules | Electron Microscopy Sciences | 70021 | size "00", flat |
| Butler block trimmer | Electron Microscopy Sciences | 69945-01 | |
| Camel hair paint brush | Electron Microscopy Sciences | 65576-01 | |
| Disc punch | Electron Microscopy Sciences | 77850-09 | |
| Embed 812 kit | Electron Microscopy Sciences | 14120 | |
| Lead acetate | Electron Microscopy Sciences | 17600 | |
| Lead citrate | Electron Microscopy Sciences | 17800 | |
| Lead nitrate | Electron microscopy Sciences | 17900 | |
| Leica UC7 ultracut microtome | Leica | ||
| Micro scale | Electron Microscopy Sciences | 62091-23 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19208 | EM grade, granular |
| Precision Thelco laboratory oven | Thelco | 51221159 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldricht | S2002 | |
| StatMark pen | Electron Microscopy Sciences | 72109-01 | |
| Tyrode solution | Electron Microscopy Sciences | 11760-05 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | powder |
Referências
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