新生大鼠脑组织在神经端子突形圆锥花序分布超微结构形态分析中的制备

Summary

我们描述了处理新生大鼠脑组织以获得高分辨率的电子显微镜的程序, 以进行神经末端突触囊分布的形态分析。用这些方法获得的显微图像也可用于研究许多其他细胞成分的形态及其尺寸结构关系。

Abstract

我们的实验室和其他许多实验室利用透射电子显微镜的高分辨能力来研究突触囊泡的形态和空间组织。为了获得高质量的电子显微镜, 从而获得对突触前囊泡分布进行定量分析所需的形态学细节程度, 最佳样品制备至关重要。化学固定是标本制备过程中的第一步, 对保持精细的超微结构至关重要。采用戊二醛-甲醛溶液固定血管, 然后用四氧化铬处理振动原子切片标本, 稳定分子的最大数量, 特别是蛋白质和脂类, 并取得优异的保护效果超微结构。然后用反染色、连续脱水和树脂包埋法对组织进行处理。在样品加工过程中, 用醋酸铀进行整体染色 (即在树脂包埋前对振荡器切片组织进行染色) 增强了内源性对比, 并稳定细胞成分的提取。通过将醋酸铀作为超薄切片上的染色后, 可以进一步增加对比度。醋酸铀处理后, 用柠檬酸铅双染色超薄切片, 通过选择性结合醋酸铀增强含核酸结构的电子不透明度, 提高图像分辨率。透射电子显微镜是一个强大的工具, 用于表征突触囊的形态细节, 并量化其大小和空间组织在终端 bouton。然而, 由于它使用固定组织, 透射电子显微镜只能提供有关生命或进化过程的间接信息。因此, 当主要目的是研究突触囊泡贩运和外分泌的动态或功能方面时, 应考虑其他技术。

Introduction

我们描述了制备新生大鼠脑组织以获得高质量电子显微镜的方法, 以便深入分析神经末端^1,2的突触囊空间分布。通过这些方法处理样品可以获得的高对比度显微图也可以用来研究一些细胞成分的详细形态及其尺寸结构^{关系 3,4}。

透射电子显微镜 (TEM) 是定量研究细胞器和其他细胞结构形态的有力工具。截至本十年, 除了高压冷冻冷冻冷冻固定外, 没有其他研究方法能够在没有免疫标记的情况下提供相同程度的脂质膜和细胞器的分辨率。然而, 冷冻替代技术并没有得到广泛使用, 通常需要昂贵的设备和较长的准备时间。

为了利用 TEM 的高分辨能力, 优化样品制备至关重要。标本制备的主要目标是保持组织结构, 使其与活状态发生最小的变化, 增强标本对比度, 并在加工和接触电子的过程中稳定组织对提取细胞成分的影响梁。多年来, 多个实验室推出并完善了许多 TEM 组织制备方案。他们中的许多人都专注于突触囊^{5、6、7、8、9}、^{10、11的最佳}可视化方法。在目前使用的一些成熟的金标准方法中, 我们选择了化学固定、固定后、整体染色、顺序脱水、树脂包埋和染色后的程序, 目的是保持最佳的组织结构和实现出色的图像对比度。值得注意的是, 在处理新生大鼠脑组织时, 保持良好的超微结构尤其具有挑战性。事实上, 非常幼小的动物的中枢神经系统的特点是含水量高于成人大脑, 细胞外空间的扩大更加突出, 细胞¹²细胞之间的连接更加松散。这使得新生大鼠脑组织对渗透率的变化非常敏感, 在通过不同色调的连续溶液处理时, 更容易发生人工收缩和肿胀.因此, 我们的方法采用了尽可能接近大鼠新生大脑的渗透性的标本处理解决方案。我们的目标是获得高质量的高分辨率电子显微镜图像, 用于神经末端突触囊泡空间分布的定量评估。具体而言, 我们试图测量神经末端的囊泡的数量、突触囊与突触前质膜的距离、固定在突触前膜上的囊泡的数量、突触泡的大小以及囊间距离 1。

满意的化学内固定是获得高质量电子显微镜的先决条件, 这些显微图像可以为研究突触囊形态和空间组织提供必要的形态学细节。虽然存在多种固定方式, 但血管灌注固定脑组织明显优于其他方法。由于通过血管灌注固定在全身循环停止后立即开始, 它缩短了脑组织脱氧和蛋白质与固定物交联之间的间隔, 导致细胞的最小改变结构。此外, 它完成快速和均匀的渗透, 因为固定剂从血管床快速流动到细胞外和细胞隔^间12^,13,14。初级戊二醛固定, 其次是四氧化铬的二次固定 (后固定), 使细结构^保存良好 15^,16,¹⁷。戊二醛和甲醛的混合物具有更快速渗透到组织^中的额外优势12。

由于生物组织不够刚性, 无法在没有树脂基体支撑的情况下切割成薄片, 因此在薄片之前, 需要将其嵌入介质中。水不混溶环氧树脂在透射电镜中常用作嵌入介质。当使用这种类型的基质时, 在树脂渗透之前, 必须用有机溶剂代替所有样品的游离水。通过一系列乙醇和/或丙酮浓度上升的溶液将水通过一系列溶液将样品取出.在这个协议中, 标本首先是平面嵌入之间灵活的丙烯酸片, 然后嵌入在胶囊。最终的结果是组织位于圆柱形树脂块的尖端, 它具有理想的几何形状, 受微细胞切片过程中产生的振动的影响最小。

用重金属染色以增强内源性组织对比度是标本制备的另一个重要方面。透射电镜中的图像对比度是由于组织中的原子的电子散射造成的。然而, 生物材料主要由低原子量分子 (即碳、氢、氧和氮) 组成。因此, 产生足够的散射对比度需要将高原子量原子加入到组织的细胞成分中。这是通过用重金属染色^12,18,19来实现的。四氧化二铵、铀和铅与脂质结合强烈, 是最常见的用作电子污渍的重金属。

( 原子序数 76 ) 是现存密度最高的金属之一。它既是固剂, 也是污渍, 尽管它在 TEM 中的主要作用是可靠的固定剂¹²。在使用的各种固定方案中, 戊二醛后的双固定方法是减少标本制备过程中细胞成分提取的最有效方法。这两种固定剂用于稳定不同类型分子的最大数量, 特别是蛋白质和脂质, 并导致组织超微结构的高级保存^{12,14, 15,16,17岁}

铀 (原子序数 92) 是用作电子染色的最重的金属, 最典型的形式是醋酸铀。与铬类似, 它起到染色和固定剂的作用, 尽管它在 tem 中的主要作用是^{作为染色 20,21}。含核酸和膜结构在醛固定组织 22^,23 中被铀醇盐强烈和优先染色。在渗透后和脱水前使用醋酸铀对组织进行治疗, 可以稳定膜质和含核酸结构, 并增强对比度, 从而能够识别一些不需要识别的结构细节。仅在^{12、24、25染色的}标本中就能很容易地检测到。据认为, 醋酸铀可以稳定精细结构, 结合减少铬已沉积在脂质膜在渗透²⁴。当在嵌入前应用醋酸铀时, 并作为薄部分12中的染色后, 可实现最大对比度。

铅 (原子序数 82) 是透射电镜中最常见的染色, 主要用于薄片染色后。铅盐具有较高的电子不透明度, 并显示出广泛的细胞结构亲和力, 包括细胞膜, 核和细胞质^{蛋白,核酸}和糖原 26, 27。当采用双重染色方法 (即用醋酸铀染色后, 用铅处理), 后者作为醋酸铀染色的显影剂。例如, 用戊二醛固定的染色质染色后, 醋酸铀的吸收增加了 3倍 28^,29,³⁰,^{31, 32.}铅还能增强其他金属 (如铬) 的染色能力。据认为, 铅盐染色膜的渗透银固定组织通过附加到极性组的磷脂在减少的铬33存在.使用醋酸铀和铅染色的一个潜在缺点, 特别是在长时间内, 是许多不同的结构元素被均匀和非具体地染色, 因此可能不容易与彼此区分 12.

最近引入的替代光源, 如光学超分辨率光激活定位显微镜, 显著提高了光学显微镜^{分辨率 34}。然而, 由于光学显微镜依靠组织化学和免疫细胞化学方法来可视化单个标记的蛋白质或酶, TEM 同时显示所有结构元素的能力仍然是无与伦比的, 无法深入研究组织结构的形态和维度关系。特别是, 没有其他技术可以提供必要的形态学细节, 以执行形态分析突触囊分布在突触前神经布腾。然而, 重要的是要注意的是, 电子显微镜捕捉组织的结构后, 生物体死亡, 因此, 他们不能提供有关的动态突触前囊泡贩运和细胞增多的信息。因此, 当主要目的是研究突触囊泡贩运和外分泌的动态和功能方面时, 应考虑其他工具, 如 FM 染料活成像和膜片钳电生理学。

Protocol

所有研究都得到了弗吉尼亚大学 (弗吉尼亚州夏洛特斯维尔) 动物护理和使用机构委员会的批准, 并按照国家卫生研究院的准则进行。 1. 血管灌注固定 请注意:本杂志13已详细介绍了大鼠脑血管灌注的方法, 超出了本方案的范围。然而, 以下步骤是专门为准备新生大鼠脑组织, 以获得高质量的电子显微镜定量分析突触前端子突触囊…

Representative Results

已确定了主要被接受为表示 TEM 样品保存令人满意或有缺陷的一般标准。这些标准在四个选定的电子显微镜 (两个最佳制备例子, 两个有缺陷的制备例子) 中得到了通过按照本协议所述的方法治疗年轻的大鼠脑组织。 一般来说, 高质量的电子显微镜显示为有序、清晰和整体的灰度图像。在令人满意的样品中, 膜之间的空间应充满颗粒状材料, 并且不应该是空的。同样, 在细胞质地?…

Discussion

在 TEM 标本制备过程中处理组织切片需要相当程度的技巧、注意力和耐心。当使用微移液器添加和去除溶液时, 可以通过表面张力将样品吸进移液器尖端, 因此应非常小心, 以避免移液器对组织造成损伤。此外, 脱水顺序的某些步骤可以快速达 1分钟, 因此操作人员需要快速工作, 以确保下一个脱水步骤按时开始, 并且样品不会干燥或起皱。需要特别注意的一个程序是与的固定后。经过处理后, 截面变?…

Materials

4% Osmium tetroxide	Electron Microscopy Sciences	19170	acqueous
50% Glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16310	EM grade, acqueous
Aclar 33 C embedding film	Electron Microscopy Sciences	50425-25	7.8 mil thickness, size 8"x10"
BEEM capsule holder	Electron Microscopy Sciences	69916	holds size "00" capsules
BEEM embedding capsules	Electron Microscopy Sciences	70021	size "00", flat
Butler block trimmer	Electron Microscopy Sciences	69945-01
Camel hair paint brush	Electron Microscopy Sciences	65576-01
Disc punch	Electron Microscopy Sciences	77850-09
Embed 812 kit	Electron Microscopy Sciences	14120
Lead acetate	Electron Microscopy Sciences	17600
Lead citrate	Electron Microscopy Sciences	17800
Lead nitrate	Electron microscopy Sciences	17900
Leica UC7 ultracut microtome	Leica
Micro scale	Electron Microscopy Sciences	62091-23
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	19208	EM grade, granular
Precision Thelco laboratory oven	Thelco	51221159
Sodium azide	Sigma-Aldricht	S2002
StatMark pen	Electron Microscopy Sciences	72109-01
Tyrode solution	Electron Microscopy Sciences	11760-05
Uranyl acetate	Electron Microscopy Sciences	22400	powder