신경 말단에서 시 냅 스 소포 분포의 미세 구조 형태학 적 분석을 위한 신생아 쥐 뇌 조직의 제조

Summary

우리는 신경 터미널에서 시 냅 스 소포 분포의 형태학 적 분석을 위한 고해상도 전자 현미경을 얻기 위해 신생아 쥐 뇌 조직을 처리 하는 절차를 설명 합니다. 이러한 방법으로 얻은 마이크로 그래프는 다양 한 세포 구성 요소와 그 차원 구조적 관계의 형태를 연구 하는 데에도 사용 될 수 있습니다.

Abstract

우리의 실험실 및 많은 다른 사람 시 냅 스 소포의 형태와 공간 조직을 연구 하는 전송 전자 현미경의 높은 해결 능력을 착취 했다. 시 냅 스 소포 분포의 정량적 분석에 필요한 형태학 적 디테일의 정도를 얻을 수 있는 고품질 전자 현미경을 얻기 위해서는 최적의 시 편 준비가 중요 하다. 화학 고정은 표본 준비 과정의 첫 번째 단계 이며 미세한 미세 구조를 유지 하는 데 가장 중요 합니다. 알데하이드 포 름 알 데히드 용액을 사용한 혈관 고정, 오 스미 눔과 함께 구조 단면 시 편을 처리 한 후, 분자의 최대 수, 특히 단백질과 지질을 안정화 하 고 우수한 보존 효과를 냅니다. 구조입니다. 조직은 반대 염색, 순차 탈수 및 수 지 임베딩으로 처리 됩니다. Uranyl 아세테이트를 사용한 En 블록 염색 (즉, 수 지 매 립 전에 진동-절편 된 조직의 염색)은 내 인 성 대비를 강화 하 고 표본 처리 시 추출에 대 한 세포 성분을 안정화 시킵니다. 우 라 아세테이트를 초박형 단면에 후 얼룩으로 적용 하 여 콘트라스트를 더욱 높일 수 있습니다. 우 라 닐 아세테이트 처리 후에 리드 구 연산 염을 가진 극 박 단면의 이중 염색은 또한 이미지 해상도를 향상 시키며, 우 라 닐 아세테이트에 대 한 리드의 선택적 결합을 통해 핵 산 함유 구조의 전자 불투명도를 심화 시킨다. 투과 전자 현미경은 시 냅 스 소포의 형태학 적 세부 분석 및 터미널 bouton의 크기 및 공간 조직의 정량화를 위한 강력한 도구입니다. 그러나, 그것은 고정 조직을 사용 하기 때문에, 전송 전자 현미경은 살아있는 또는 발전 프로세스에 관하여 간접적인 정보를 제공할 수 있습니다. 따라서, 주요 목적이 시 냅 스 소포 매매 및 해충 증의 동적인 또는 기능적인 양상을 공부 하는 때 그밖 기술은 고려 되어야 합니다.

Introduction

우리는 신경 말단^1,2에서 시 냅 스 소포 공간 분포의 심층 형태학 적 분석을 위한 고품질 전자 현미경을 얻기 위해 신생 쥐 뇌 조직의 준비를 위한 방법을 설명 합니다. 이러한 방법에 따라 시 편을 처리 하 여 얻을 수 있는 고 콘트라스트 마이크로 그래프는 또한 다 수의 세포 성분 및 그들의 치수 구조 관계^3,4의 상세한 형태학을 연구 하는데 사용 될 수 있다.

투과 전자 현미경 (TEM)은 세포 소기관 및 다른 세포 구조의 형태를 정량적으로 연구 하는 강력한 도구입니다. 이 10 년의 기준으로, 고압 동결에의 한 저온 고정을 제외 하 고는 면역 태그 추가 없이 지질 막과 소기관의 동일한 분해능을 제공할 수 있는 다른 조사 방법이 없습니다. 그러나, 동결 대체 기술은 널리 사용 되지 않고, 일반적으로 고가의 장비 및 긴 준비 시간을 필요로 한다.

TEM의 높은 분해 력을 이용 하기 위해서는 최적의 시 편 준비가 가장 중요 합니다. 표본 준비의 주요 목표는 살아있는 상태에서 최소한의 변경을 가진 조직 구조를 보전 하 고, 표본 대조를 강화 하 고, 처리 도중 세포 성분의 추출에 대하여 조직을 안정 시키고 전자에 노출 하기 위한 것입니다 빔. TEM 조직 준비를 위한 수많은 프로토콜이 수년간 여러 실험실에 의해 도입 되 고 완성 되었습니다. 그들 중 상당수는 시 냅 스 소포^5,6,⁷,⁸,¹¹의 최적의 시각화를 위한 방법에 초점을 맞추고 있다. 현재 사용 중인 여러 가지 잘 확립 된 금 표준 방법 중에서, 우리는 최적의 조직 구조를 보존 하는 것을 목표로 화학 고정, 사후 고정, en 블록 염색, 순차적 탈수, 수 지 매 립 및 사후 염색을 위한 절차를 선택 했습니다. 뛰어난 이미지 콘트라스트를 실현 합니다. 주의, 미세 울트라 구조의 보존 신생아 쥐 뇌 조직으로 작업 할 때 특히 어려울 수 있습니다. 사실, 매우 젊은 동물의 중추 신 경계는 성인 뇌 보다 더 높은 수 분 함량, 세포 외 공간의 눈에 띄는 확대, 셀 간 패자 연결을 특징으로 합니다¹². 이것은 신생 쥐 두뇌 조직은 오 스몰 농도에 있는 변화에 깊이 과민 하 게 하 고, 다른 탄력성¹²의 순차 해결책을 통해 처리 될 때 정교 하 게 아 티의 수축 및/또는 팽 윤에 경향이 있습니다. 따라서, 우리의 방법은 쥐 신생 두뇌의 그것에 가능한 가까운 오 스몰 농도의 표본 처리를 위한 해결책을 채택 했습니다. 우리의 목표는 신경 말단에서 시 냅 스 소포 공간 분포의 정량적 평가를 위한 고품질, 고 분해능 전자 현미경 이미지를 얻는 것 이었습니다. 구체적으로, 우리는 신경 말단 내 소포 수, 시 냅 스 전 혈장 막 으로부터의 시 냅 스 소포의 거리를 측정 하기 위해 모색 하 고 시 냅 스 전 막에 도킹 된 소 낭의 수 및 간 소포 거리¹.

만족 스러운 화학 고정은 시 냅 스 소포 형태학과 공간 조직을 연구 하는 데 필요한 형태학 적 세부 사항을 제공 할 수 있는 고품질 전자 현미경을 얻기 위한 전제 조건입니다. 고정의 여러 모드가 존재 하지만, 혈관 관류에의 한 뇌 조직의 고정은 다른 방법 보다 확실히 우수 하다. 혈관 관류를 통한 고정은 전신 순환의 체포 직후에 시작 되기 때문에 뇌 조직의 탈 산소 및 고정과 단백질의 가교 사이의 간격을 단축 하 여 세포에서 최소 변형을 초래 합니다. 구조. 더욱이, 세포 외 및 세포 구획¹²,¹⁴에 대 한 혈관 내에서의 급속 한 고착의 흐름 때문에 빠르고 균일 한 침투를 수행 한다. 알데하이드로 1 차 고정 후 2 차 고정 (사후 고정)을 사용 하 여 미세 구조^15,16,¹⁷의 우수한 보존을 산출 합니다. 알데하이드 및 파라 포름알데히드의 혼합물은 조직 (¹²) 내로의 보다 빠른 침투의 추가적인 이점을 가진다.

생물학적 조직은 수 지 매트릭스의 지지 없이 얇은 부분으로 절단 될 정도로 강성이 충분 하지 않기 때문에, 얇은 절편 전에 매 질에 포함 시켜야 합니다. 물-비 혼 화성 에폭시 수 지는 TEM에 있는 매 립 매체로 일반적으로 사용 됩니다. 이 유형의 매트릭스를 사용 하는 경우, 모든 시 편의 무료 물은 수 지 침투 전에 유기 용 매로 교체 해야 합니다. 물은 상승 된 농도의 에탄올 및/또는 아세톤 (¹²)의 일련의 용액을 통해 시 편을 통과 시 킴으로써 제거 된다. 이 프로토콜에서 표본은 플 렉 시 블 한 aclar 시트 사이에 먼저 평평 하 게 삽입 된 다음 캡슐에 포함 됩니다. 최종 결과는 원통형 수 지 블록의 끝에 위치한 조직으로, 마이크로 톰 절편 중에 발생 하는 진동의 영향을 최소한으로 받는 이상적인 형상을가지고 있습니다.

내 인 성 조직 대비를 향상 시키기 위해 중 금속으로 염색 하는 것은 표본 준비의 또 다른 중요 한 측면입니다. TEM에서의 이미지 콘트라스트는 조직의 원자에의 한 전자 산란에 기인한 것 이다. 그러나, 생물학적 물질은 주로 낮은 원자 무게 분자 (즉, 탄소, 수소, 산소 및 질소)로 구성 됩니다. 따라서, 충분 한 산란 대비의 생성은 조직의 세포 성분에 높은 원자 무게 원자의 혼 입이 필요 하다. 이는 중 금속^12,18,19로 시 편의 얼룩을 통해 달성 된다. 오 스미 늄은 지질에 강하게 결합 하는 우라늄 및 납, 전자 얼룩으로 사용 되는 가장 일반적인 중 금속입니다.

오 스미 (원자 번호 76)는 현존 하는 가장 흔한 금속 중 하나 이다. TEM에서 주요 역할은 신뢰할 수 있는 픽스 쳐¹²이지만, 그것은 모두 고착과 얼룩입니다. 사용 중인 다양 한 고정 프로토콜 중에서 알데하이드가 뒤 따른 이중 고정 방법은 표본 준비 중에 세포 성분의 추출을 줄이는 데 가장 효과적입니다. 이러한 두 개의 고정 제가 분자의 상이한 종류의 최대 수를 안정화 시키는데 사용 되 고, 특히 단백질과 지질은, 조직 초고 구조 ^12,14,¹⁵의 우수한 보존 결과 ^{16 , 17}.

우라늄 (원자 번호 92)은 전자 얼룩으로 사용 되는 가장 무거운 금속으로, 가장 전형적으로는 우르 닐 아세테이트의 형태 이다. 오 스미와 마찬가지로, 그것은 얼룩과 고정의 역할을 하지만 TEM에서의 주된 역할은 얼룩^20,21입니다. 핵 산-함유 및 막 모양 궁 구조는 명백 하 게 알데하이드-고정 조직^22,23의 우르 라 염으로 우선적으로 염색 된다. 우 라 닐 아세테이트를 사용한 조직의 치료 및 탈수 전에 막 모양 궁 및 핵 산 함유 구조물의 안정화를 초래 하 고, 콘트라스트를 향상 시키고, 일부 구조적 세부 사항을 식별 하 여 만^12,24,25의 오 스미로 얼룩진 표본에서 쉽게 검출할 수 있습니다. 요로 닐 아세테이트는 오 스 설 하²⁴시 지질 막에 증 착 되어 있는 환 원 질과 결합 하 여 미세 구조를 안정화 시킬 수 있다고 생각 된다. Uranyl 아세테이트를 포함 하기 전에 적용 하 고 얇은 섹션¹²에서 얼룩을 발생 시키면 최대 콘트라스트가 달성 됩니다.

납 (원자 번호 82)은 TEM에 사용 되는 가장 흔한 얼룩 이며 주로 얇은 단면의 후 염색에 채택 됩니다. 납 염은 높은 전자 불투명도를 가지 며 멤브레인, 핵 및 세포질 단백질, 핵 산 및 글 리 코겐^26,27을 포함 한 광범위 한 세포 구조에 대 한 친화도를 보여줍니다. 이중 염색 방법이 채용 되는 경우 (즉, 우르 라 아세테이트로 염색 하 여 납으로 처리 한 후), 후자는 우르 라 아세테이트 염색의 현상 액으로 작용 한다. 예를 들면, 알데하이드로 결정 된 염색 질의 납 후 염색 질은 3 개의^28,29,30,³¹의 인자에 의해 우 라 닐 아세테이트 흡수를 증가³². 납은 또한 오 스미 움과 같은 그밖 금속에 의해 부여 된 얼룩을 강화 합니다. 인지질의 존재 하에의 극성 기에 부착 하 여 고정 된 조직-오 스미 움의 막으로의 납 염의 얼룩을 감소 시키는 것으로 생각 된다³³. Uranyl 아세테이트와 납 모두로 염색의 잠재적인 단점은 특히 장기간 지속 되는 경우, 많은 다른 구조적 요소가 동등 하 게 그리고 비 특이 적으로 염색 되 고, 따라서 서로 쉽게 구별 되지 않을 수 있다는 것입니다¹² .

최근의 광학 슈퍼 해상도 사진 활성화 국 소화 현미경과 같은 대체 광원의 도입은 현저 하 게 개선 된 광 현미경 해상도³⁴을 갖는다. 그러나, 가벼운 현미경 검사 법은 개별적인 라벨링 한 단백질 또는 효소를 구상 하기 위하여 조직학 및 면역 세포 화학 방법에 의존 하기 때문에, 한 번에 모든 구조상 요소를 표시 하는 TEM의 힘은의 깊이 있는 연구를 위해 타의 추종을 불허 남아 있습니다 조직 구조의 형태학 및 차원 관계. 특히 시 냅 시스 신경 boutons 시 냅 스 소포 분포의 형태학 적 분석을 수행 하는 데 필요한 형태학 적 세부 사항을 제공할 수 있는 다른 기술은 없습니다. 그럼에도 불구 하 고, 전자 현미경은 유기 체가 죽으면 조직의 구조를 포착 하는 것이 중요 합니다, 따라서 그들은 전 시 냅 스 소포 매매 및 exocytosis의 역학에 관하여 정보를 제공할 수 없습니다. 따라서, FM 염료-라이브 이미징 및 패치 클램프 전기 생리학 등의 다른 도구는 주요 목적이 시 냅 스 소포 매매 및 배설의 동적 및/또는 기능적 측면을 연구 하는 것입니다 때 고려해 야 합니다.

Protocol

모든 연구는 버지니아 대학에서 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 (샬러츠빌, 버지니아) 건강 지침의 국가 학회에 따라 실시. 1. 혈관 관류에의 한 고정 참고: 랫 트 뇌 혈관 관류를 위한 방법에 대 한 일반적인 설명은이 학술지 (13 )에서 이미 상세히 기술 되어 왔으며이 프로토콜의 범위를 벗어납니다. 그러나, 다음의…

Representative Results

TEM에 대 한 시 편의 만족 또는 결함 보전을 나타내는 것으로 대부분 인정 되는 일반 기준이 확립 되었다. 이러한 기준은 4 개의 선택 된 전자 현미경 (최적의 제제의 두 가지 예, 결함 있는 제제의 두 가지 예)에서 예시 되는데,이는이 프로토콜에 기재 된 방법에 따라 젊은 쥐 뇌 조직을 치료 함으로써 얻어진 다. 일반적으로, 상 질 전자 현미경 사진은 질서 있는, 독특하고 전반?…

Discussion

TEM에 대 한 표본 준비 중 조직 섹션의 처리는 상당한 기교, 집중력 및 인내심을 필요로 합니다. 마이크로 파이 펫을 사용 하 여 용액을 추가 하 고 제거 하는 경우, 시 편은 표면 장력에 의해 피 펫 팁으로 빨려 들어갈 수 있으므로 파이 펫에의 한 조직 손상을 방지 하기 위해 주의를 기울여야 합니다. 또한, 탈수 서 열의 특정 단계는 1 분으로 빨리 할 수 있으므로 작업자는 다음 탈수 단계가 시간에 ?…

Materials

4% Osmium tetroxide	Electron Microscopy Sciences	19170	acqueous
50% Glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16310	EM grade, acqueous
Aclar 33 C embedding film	Electron Microscopy Sciences	50425-25	7.8 mil thickness, size 8"x10"
BEEM capsule holder	Electron Microscopy Sciences	69916	holds size "00" capsules
BEEM embedding capsules	Electron Microscopy Sciences	70021	size "00", flat
Butler block trimmer	Electron Microscopy Sciences	69945-01
Camel hair paint brush	Electron Microscopy Sciences	65576-01
Disc punch	Electron Microscopy Sciences	77850-09
Embed 812 kit	Electron Microscopy Sciences	14120
Lead acetate	Electron Microscopy Sciences	17600
Lead citrate	Electron Microscopy Sciences	17800
Lead nitrate	Electron microscopy Sciences	17900
Leica UC7 ultracut microtome	Leica
Micro scale	Electron Microscopy Sciences	62091-23
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	19208	EM grade, granular
Precision Thelco laboratory oven	Thelco	51221159
Sodium azide	Sigma-Aldricht	S2002
StatMark pen	Electron Microscopy Sciences	72109-01
Tyrode solution	Electron Microscopy Sciences	11760-05
Uranyl acetate	Electron Microscopy Sciences	22400	powder