Ultrastructural のための新生ラット脳組織の調製 Morphometric 神経末端におけるシナプス小胞分布の解析
Summary
我々は、新生ラット脳組織を処理して、神経終末におけるシナプス小胞分布の morphometric 分析のための高分解能電子顕微鏡写真を得るための手順を説明する。これらの方法で得られた顕微鏡写真は、多数の他の細胞成分およびそれらの寸法構造関係の形態を研究するためにも使用することができる。
Abstract
私たちの研究室や他の多くは、シナプス小胞の形態と空間的組織化を研究するために、透過型電子顕微鏡検査の高い分解力を利用しています。シナプス前小胞分布の定量分析に必要な形態学的詳細の程度を得られる高品質の電子顕微鏡写真を得るためには、最適な試料調製が重要である。化学的固定は、試料調製のプロセスの第一歩であり、微細な ultrastructure を維持するために最も重要です。グルタルアルデヒド溶液を用いた血管固定、続いて四酸化オスミウムを用いたビブラトーム切片標本の治療により、分子の最大数、特にタンパク質と脂質を安定化し、優れた保存をもたらすの ultrastructure。その後、組織は、切片、シーケンシャル脱水および樹脂包埋で処理されます。酢酸ウラニル (すなわち、樹脂埋め込み前のビブラトームによる組織の染色) による En ブロック染色は、内因性のコントラストを高め、検体処理中の抽出に対して細胞成分を安定化させます。コントラストは、超薄断面の後染色として酢酸ウラニルを適用することによってさらに増加させることができる。酢酸ウラニル処理後のクエン酸鉛を用いた極薄の切片の二重染色により、ウラニルへの鉛の選択的結合による核酸含有構造の電子不透過性を強化することにより、画像分解能も向上させる。透過型電子顕微鏡法は、シナプスベシクルの形態学的詳細の特徴付けと、末端 bouton におけるそれらのサイズおよび空間的組織の定量化のための強力なツールである。しかし、固定された組織を使用しているため、透過型電子顕微鏡は、生きているプロセスや進化する過程に関する間接情報しか提供できません。したがって、主な目的は、シナプスの小胞の人身売買およびエキソサイトーシスの動的または機能的側面を研究することである場合、他の技術を考慮する必要があります。
Introduction
我々は、新生ラット脳組織の調製方法について、神経ターミナル1、2におけるシナプス小胞空間分布の詳細な morphometric 分析のための高品質の電子顕微鏡写真を得るために記述する。これらの方法に従って検体を処理することによって得ることができるハイコントラスト顕微鏡写真は、多数の細胞成分およびそれらの寸法構造関係3,4の詳細な形態を研究するためにも使用することができる。
透過型電子顕微鏡 (TEM) は、オルガネラや他の細胞構造の形態を定量的に研究する強力なツールです。この十年のように、高圧凍結による cryofixation を除いて、免疫タグ付けなしで脂質膜およびオルガネラの同じ程度の分解能を提供できる他の調査方法はない。しかし、凍結置換技術は広く使用されておらず、通常は高価な装置と長い準備時間を必要とします。
TEM の高い分解力を活かすためには、最適な試料調製が最も重要です。検体調製の主な目的は、生体状態からの変化を最小限に抑えて組織構造を保存し、検体のコントラストを高め、処理中の細胞成分の抽出や電子への曝露に対する組織の安定化を図ることである。ビーム。TEM のティッシュの準備のための多数の議定書は長年にわたっていくつかの実験室によって導入され、完成した。それらの多くは、シナプス小胞5、6、7、8、9、10、11の最適な可視化のための方法に焦点を当てています。現在使用されている多くの確立された、金の標準的な方法の中で、私達は最適のティッシュの構造を維持することを目指す化学固定、ポスト固定、en ブロックの染色、連続的な脱水、樹脂の埋め込みおよびポストの染色のためのプロシージャを選びました優れた画像コントラストを実現します。注目すべきは、新生児ラット脳組織で作業する場合、微細 ultrastructure の保存は特に困難な場合があります。実際には、非常に若い動物の中枢神経系は、成体の脳よりも高い水分含量、細胞外空間のより顕著な拡大、および細胞12間のより緩い接続によって特徴付けられる。これにより、新生ラット脳組織はオスモル濃度の変化に深く敏感であり、異なる張度12の逐次溶液を通して処理されたときに、artifactual 収縮および/または腫脹を生じやすい。したがって、我々の方法は、ラット新生児の脳のそれにできるだけ近いオスモル濃度の標本処理のためのソリューションを採用しています。私たちの目標は、神経末端のシナプス小胞空間分布を定量的に評価する高品質・高分解能の電子顕微鏡像を得ることでした。具体的には、神経終末内の小胞の数、シナプス前の形質膜からのシナプスの小胞の距離、シナプス前膜に停泊している小胞の数、シナプス小胞の大きさ、間小胞距離1.
十分な化学的固定は、シナプス小胞形態および空間的組織を研究するために必要な形態学的詳細を提供することができる高品質の電子顕微鏡写真を得るための前提条件である。固定のいくつかのモードが存在するが、血管灌流による脳組織の固定は、他の方法より明らかに優れている。血管灌流による固定は、全身循環の停止の直後に始まるので、脳組織の脱酸素とタンパク質の固定剤との架橋の間の間隔が短くなり、細胞内での最小変化が生じる構造。さらに、それは、血管床から細胞外および細胞区画12、13、14までの固定液の急速な流れのために、迅速かつ均一な浸透を達成する。グルタルアルデヒドとの主な固定は、続いて、四酸化オスミウムとの二次固定 (後固定) によって、微細構造15,16,17の優れた保存をもたらす。グルタルアルデヒドとパラホルムアルデヒドの混合物は、組織12へのより迅速な浸透の追加の利点を有する。
生物学的組織は、樹脂マトリックスを支持せずに薄い切片に切断するのに十分な剛性がないので、薄い断面化する前に培地に埋め込まれている必要がある。水非混和性エポキシ樹脂は、TEM に埋め込み媒体として一般的に使用されている。このタイプのマトリックスを使用する場合、すべての試料の自由水は、樹脂浸潤の前に有機溶媒に交換する必要があります。水は、エタノールおよび/またはアセトン12の上昇濃度の一連の溶液を通して標本を通過させることによって除去される。この議定書では、標本は柔軟な aclar シートの間で最初に平らに埋め込まれ、次にカプセルに埋め込まれる。最終結果は円筒形樹脂ブロックの先端に位置する組織で、ミクロトームの断面化中に生じる振動の影響を最小限にする理想的な形状を有しています。
内因性組織のコントラストを高めるために重金属で染色することは、試料調製のもう一つの重要な側面です。TEM における画像コントラストは、組織内の原子による電子散乱によるものである。しかし、生物学的材料は、主に、低原子量分子 (すなわち、炭素、水素、酸素および窒素) からなる。したがって、十分な散乱コントラストの生成は、組織の細胞成分に高い原子量の原子を組み込むことを必要とする。これは、重金属12、18、19を用いた試料の染色によって達成される。脂質に強く結合するオスミウム四酸化、ウラン、鉛は、電子染色として用いられる最も一般的な重金属です。
オスミウム (原子番号 76) は、存在する最も密金属の一つです。それは、固定剤および染色剤の両方であり、TEM におけるその主な役割は、信頼性の高い定着性12としてである。使用中の様々な固定プロトコルの中で、オスミウムに続くグルタルアルデヒドとの二重固定の方法は、検体調製中の細胞成分の抽出を減少させるのに最も効果的である。これらの2つの固定剤は、異なる種類の分子、特にタンパク質および脂質の最大数を安定化するために使用され、組織 ultrastructure の優れた保存をもたらす12、14、15、16,17.
ウラン (原子番号 92) は、電子染色として使用される最も重い金属であり、最も典型的には酢酸ウラニルの形態である。オスミウムと同様に、それは、染色剤および固定剤として作用し、TEM におけるその主な役割は、染色20、21としてのものである。核酸含有および膜構造は、アルデヒド固定組織22、23においてウラニル塩で強くかつ優先的に染色される。Osmication および脱水前のウラニルによる組織の治療は、膜および核酸含有構造の安定化、ならびに強化されたコントラストをもたらし、そして、そうではないいくつかの構造的な細部の同定を可能にする、オスミウム単独で染色された検体においては12,24,25に容易に検出することができる。酢酸ウラニルは、osmication24中に脂質膜上に堆積した低オスミウムと組み合わせることで微細な構造を安定化させることが考えられる。最大コントラストは、ウラニル酢酸が埋め込む前に適用され、薄いセクション12でポストステインとして達成されます。
鉛 (原子番号 82) TEM のために使用される最も一般的な染色であり、主に薄い切片の後染色のために採用されています。鉛塩は、高い電子不透明度を有し、膜、核および細胞質蛋白質、核酸及びグリコーゲン26、27を含む細胞構造の広い範囲のための親和性を示します。二重染色法が採用されている場合 (すなわち、ウラニル酢酸塩による染色は、鉛による治療が続く)、後者はウラニル酢酸染色の開発者として作用する。例えば、グルタルアルデヒドによって固定されたクロマチンのリードポスト染色では、ウラニルの酢酸摂取量は28、29、30、31、32の3倍に増加します。鉛はまた、オスミウムなどの他の金属によって付与される染色を増強する。鉛塩は、減少したオスミウム33の存在下でホスファチドの極性基に付着することにより、オスミウム固定組織の膜を染色すると考えられている。酢酸ウラニルおよび鉛の両方による染色の潜在的な欠点は、特に長期間にわたって、多くの異なる構造的な要素が等しくかつ非特異的に染色され、したがって、互いに容易に区別できない可能性があることである12.
光学超解像の写真活性化された局在の顕微鏡検査のような代わりとなる光源の最近の導入は、かなり改善される光顕微鏡検査の決断を持っている34。しかし、光顕微鏡は、個々に標識されたタンパク質または酵素を視覚化するために組織化と免疫 cytochemical 法に依存しているため、TEM の力は、一度にすべての構造要素を表示するために、そのままの綿密な研究のために卓越しています。組織構造の形態と寸法関係特に、他の技術は、シナプス前神経 boutons におけるシナプス小胞分布の morphometric 分析を行うために必要な形態学的詳細を提供することができる。それにもかかわらず、電子顕微鏡写真は、生物が死亡した後に組織の構造を捕捉し、したがって、シナプス前小胞輸送およびエキソサイトーシスのダイナミクスに関する情報を提供することができないことに注意することが重要である。したがって、FM 色素ライブイメージングやパッチクランプ電気生理学などの他のツールは、主な目的がシナプス小胞輸送およびエキソサイトーシスの動的および/または機能的側面を研究することであると考える必要があります。
Protocol
Representative Results
Discussion
TEM のための試料調製中の組織切片の処理は、かなりの程度の技巧、濃度および忍耐を必要とする。マイクロピペットを使用して溶液を添加および除去する場合、試料は表面張力によってピペットチップに吸入される可能性があるので、ピペットによる組織損傷を避けるために細心の注意が必要である。また、脱水シーケンスの特定のステップは、1分として迅速であることができるので、オ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この原稿は、NIH/NIGMS K08 123321 (to N.L.) とバージニア大学麻酔科からの資金によって支えられました。研究者は Erisir (Alev、バージニア大学、シャーロッツビル、VA) に感謝し、TEM での優れたトレーニングと技術支援のために、そして、彼女の貴重な原稿批評のためにありがとうと思っています。また、バージニア大学の高度電子顕微鏡検査施設では、検体の断面化と染色後の技術支援にも感謝しています。
Materials
| 4% Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19170 | acqueous |
| 50% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16310 | EM grade, acqueous |
| Aclar 33 C embedding film | Electron Microscopy Sciences | 50425-25 | 7.8 mil thickness, size 8"x10" |
| BEEM capsule holder | Electron Microscopy Sciences | 69916 | holds size "00" capsules |
| BEEM embedding capsules | Electron Microscopy Sciences | 70021 | size "00", flat |
| Butler block trimmer | Electron Microscopy Sciences | 69945-01 | |
| Camel hair paint brush | Electron Microscopy Sciences | 65576-01 | |
| Disc punch | Electron Microscopy Sciences | 77850-09 | |
| Embed 812 kit | Electron Microscopy Sciences | 14120 | |
| Lead acetate | Electron Microscopy Sciences | 17600 | |
| Lead citrate | Electron Microscopy Sciences | 17800 | |
| Lead nitrate | Electron microscopy Sciences | 17900 | |
| Leica UC7 ultracut microtome | Leica | ||
| Micro scale | Electron Microscopy Sciences | 62091-23 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19208 | EM grade, granular |
| Precision Thelco laboratory oven | Thelco | 51221159 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldricht | S2002 | |
| StatMark pen | Electron Microscopy Sciences | 72109-01 | |
| Tyrode solution | Electron Microscopy Sciences | 11760-05 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | powder |
Referências
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