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Developmental Biology

Bildung von Human Periodontal ligament Cell Spheroids auf Chitosan Filmen

Published: June 19, 2019 doi: 10.3791/59855
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 1, 3, 1
1Department of Periodontology, School & Hospital of Stomatology, Tongji University, Shanghai Engineering Research Center of Tooth Restoration and Regeneration, 2Department of Periodontology, Dental Diseases Prevention & Treatment Center of Jiading District, 3College of Materials Science and Engineering, Tongji University
* These authors contributed equally

Summary

Hier präsentieren wir Protokolle zur Kultivierung von Humanparodontalband (PDL) Zellsphäriden durch Chitosan-Filme. Die Kultur der dreidimensionalen (3D) zellulären Sphäroide bietet eine Alternative zum herkömmlichen Gewebekulturpolystyrol (TCPS) Kultursystem.

Abstract

Parodontalbandzellen (PDL) sind für die Regeneration des parodontalen Gewebes vielversprechend. Üblicherweise werden PDL-Zellen auf zweidimensionalen (2D) Substraten wie Gewebekulturpolystyrol (TCPS) kultiviert. Jedoch, charakteristische Veränderungen der PDL-Zellen wurden während der In-vitro-Kultur beobachtet. Dieses Phänomen liegt wahrscheinlich daran, dass sich das 2D TCPS von der dreidimensionalen (3D) Mikroumgebung in vivo unterscheidet. Im Vergleich zu Zellen, die auf 2D-Substraten kultiviert werden, weisen Zellen, die in einer 3D-Mikroumgebung angebaut werden, mehr Ähnlichkeiten mit In-vivo-Zellen auf. Daher bieten 3D-Zellkulturmodelle eine vielversprechende Alternative zur konventionellen 2D-Monolayer-Zellkultur. Um herkömmliche PDL-Zellkulturmodelle zu verbessern, haben wir vor kurzem eine 3D-Zellkulturmethode entwickelt, die auf der Sphäroidbildung von PDL-Zellen auf Chitosan-Filmen basiert. Hier präsentieren wir detaillierte Zellsphäroid-Kulturprotokolle, die auf Chitosan-Filmen basieren. Das 3D-Kultursystem der PDL-Zellsphäriden überwindet einige der Einschränkungen im Zusammenhang mit der konventionellen 2D-Monolayer-Zellkultur und eignet sich daher möglicherweise für die Herstellung von PDL-Zellen mit einer verbesserten therapeutischen Wirksamkeit für die zukünftige parodontale Geweberegeneration.

Introduction

Parodontitis, vor allem durch Zahnbelag1initialisiert, ist durch die Schädigung von Parodontalgewebe einschließlich Parodontalband (PDL), Alveolarknochen und Zement um gekennzeichnet. Aktuelle Behandlungen für Parodontitis sind in der Regel erfolgreich bei der Verhinderung des Fortschreitens der aktiven Krankheit, aber die Regeneration von verlorenen parodontalen Geweben bleibt eine klinische Herausforderung. In jüngster Zeit wurden wichtige Fortschritte bei zellbasierten Ansätzen für die parodontale Geweberegeneration erzielt, um die Nachteile der aktuellen Behandlungen2,3,4zu überwinden.

Unsere vorherige systematische Überprüfung ergab, dass PDL-Zellen ein großes Potenzial für die parodontale Regeneration zeigten5. Üblicherweise werden PDL-Zellen auf zweidimensionalen (2D) Substraten wie Gewebekulturpolystyrol (TCPS) kultiviert. Während der In-vitro-Kultur6wurden jedoch charakteristische Veränderungen von PDL-Zellen beobachtet. Dieses Phänomen liegt wahrscheinlich daran, dass sich der 2D TCPS von der dreidimensionalen (3D) Mikroumgebung in vivo unterscheidet7. Im Vergleich zu Zellen, die auf 2D-Substraten kultiviert werden, weisen Zellen, die in einer 3D-Mikroumgebung angebaut werden, mehr Ähnlichkeiten mit in vivo Zellenauf 8. Daher bieten 3D-Zellkulturmodelle eine vielversprechende Alternative zur konventionellen 2D-Monolayer-Zellkultur.

Herkömmliche 3D-Kulturmethode ist das Verkapseln von Zellen in 3D-Biomaterialien. Im Vergleich zu Zellen, die in 3D-Biomaterialien eingekapselt sind, imitieren zelluläre Sphäroide die In-vivo-Situation genauer, da Sphäroide Aggregate von Zellen sind, die frei von Fremdstoffen wachsen9,10,11, 12. Es wird berichtet, dass zelluläre Sphäroide MSC-Bioaktivitäten durch die Erhaltung von extrazellulären Matrixkomponenten (ECM) einschließlich Fibronectin und Laminin13förderten. Zur Verbesserung herkömmlicher PDL-Zellkulturmodelle haben wir vor kurzem eine 3D-PDL-Zellkulturmethode entwickelt, die aufder Sphäroidbildung von PDL-Zellen auf Chitosan-Filmen 14 basiert. Die Sphäroidbildung erhöhte die Selbsterneuerung und die osteogene Differenzierungsfähigkeit der PDL-Zellen14. Hier präsentieren wir detaillierte PDL-Zellsphäroid-Kulturprotokolle, die auf Chitosan-Filmen basieren. Das 3D-Kultursystem von PDL-Zellsphäriden beseitigt einige der Mängel im Zusammenhang mit der konventionellen TCPS-Zellkultur und eignet sich daher möglicherweise für die Herstellung von PDL-Zellen mit einer verbesserten therapeutischen Wirksamkeit für die zukünftige parodontale Geweberegeneration.

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Protocol

Das Studienprotokoll wurde von der Ethikkommission der Schule und des Krankenhauses für Stomatologie der Tongji University genehmigt. Alle Patienten erteilten ihre schriftliche Einwilligung in Kenntnis der Sachlage.

1. PDL-Zellisolierung

  1. Herstellung eines Proliferationsmediums für die Kultur von PDL-Zellen: das Medium von 10% FCS und 100 U/ml Pen/Strep.
  2. Bereiten Sie einen Behälter mit Eis vor, um isolierte dritte Molaren zu übertragen.
  3. Sterilisieren Sie chirurgische Instrumente mit einem Autoklaven.
  4. Extrahieren Sie normale menschliche Auswirkungen dritten Molaren von Erwachsenen (18-28 Jahre alt) in der Zahnklinik der Schule und Krankenhaus der Stomatologie, Tongji Universität.
  5. Dritte Molaren in das Proliferationsmedium geben und bei 4 °C ins Labor geben.
  6. Legen Sie den extrahierten Zahn in eine sterile 100 mm Petrischale und arbeiten Sie in einer biohazard laminaren Durchflusshaube.
  7. Fügen Sie 10 ml PBS hinzu, um den extrahierten Zahn zu waschen. Wiederholen Sie den Waschschritt zweimal.
  8. Durch die Verwendung eines sterilen Skalpells trennen Sie die PDL vorsichtig von der Wurzel.
    HINWEIS: PDL sollte aus dem mittleren Drittel der Wurzel abgekratzt werden, um Kontaminationen durch Gingiva oder apikales Gewebe zu vermeiden.
  9. Zerkleinern Sie PDL in 1-2-mm-Fragmente mit Hilfe einer sterilisierten Skalpellklinge.
  10. Legen Sie PDL-Fragmente in einen T-25-Kulturkolben, gefüllt mit 3-4 ml Proliferationsmedium.
  11. Die Proben in einem Inkubator bei 37 °C in 5% CO2 mit befeuchteter Luft ansaugen.
  12. Ändern Sie das Kulturmedium, nachdem das Wachstum von PDL-Zellen beobachtet wurde. Es dauert in der Regel 1-2 Wochen für das Wachstum von PDL-Zellen. Beobachten Sie das Wachstum von PDL-Zellen über ein inverses Phasenkontrastmikroskop.
  13. Ändern Sie das Kulturmedium danach zweimal pro Woche.
  14. Wenn PDL-Zellen den Zusammenfluss erreicht haben, werden Subkulturzellen im Verhältnis 1:4 (Passage 1) erreicht.
  15. Beobachten Sie das Zellwachstum täglich und verändern Sie das Kulturmedium zweimal pro Woche.
  16. Führen Sie jede nachfolgende Passage im Verhältnis 1:4 durch, nachdem die Zellen 80% Zusammenfluss erreicht haben. Verwenden Sie PDL-Zellen der dritten bis fünften Generation für die Zellaussaat.

2. Herstellung von Chitosan-Filmen

  1. Zur Herstellung einer 1% (v/v) Essigsäurelösung 5 ml Essigsäure zu 495 ml doppeldestilliertem Wasser in einem sauberen Glasbecher hinzufügen.
  2. Zur Herstellung einer 1% w/v Chitosan-Lösung 5 g Chitosanpulver (durchschnittliches Molekulargewicht 400 kDa, 85% Acetylierungsgrad) wiegen und zu 495 ml 1% (v/v) Essigsäurelösung hinzufügen.
  3. Die vorbereitete Lösung 24 Stunden lang mit Rührstab und magnetischer Rührplatte bei 60 °C umrühren.
  4. Autoklav die vorbereitete Lösung, um die vollständige Auflösung von Chitosan zu gewährleisten.
    HINWEIS: Das Experiment kann in dieser Phase angehalten werden.
  5. Um Chitosan-Filme zu bilden, fügen Sie 1% w/v Chitosan-Lösung in Gewebekultur-Polystyrol (TCPS) Gerichte bei 0,25 mL/cm2. Zum Beispiel fügen Sie 0,5 ml von 1% w/v Chitosan-Lösung zu einem Brunnen von 24 -well Platte.
  6. TcpS-Gerichte im Ofen bei 60 °C 24 Stunden lang trocknen, um Chitosan-Filme zu bilden.
  7. 0,5 N Natriumhydroxid (NaOH) zubereiten. 10 g NaOH, ein wenig nach dem anderen, mit dem magnetischen Rührstab in ein großes Volumen doppelt destillierten Wassers rühren und dann die Lösung verdünnen, um 0,5 L zu machen.
    HINWEIS: NaOH zu Wasser hinzufügen --nicht Wasser zu festem NaOH hinzufügen. Berühren Sie NaOH nicht! Es kann chemische Verbrennungen verursachen.
  8. Neutralisieren Sie Chitosan-Filme mit 0,5 N NaOH. Fügen Sie 0,5 ml 0,5 N NaOH Lösung zu einem Brunnen von 24-Well-Platte für 2 Stunden.
  9. Chitosan-Filme dreimal mit doppelt destilliertem Wasser waschen.
    HINWEIS: Das Experiment kann in dieser Phase angehalten werden.
  10. Vor der Zellaussaat die chitosanbeschichteten 24-Well-Platten in 70% Alkohol über Nacht bei Raumtemperatur sterilisieren.
  11. Spülen Sie Chitosan-beschichtete Platten dreimal mit PBS bei Raumtemperatur.
  12. Sterilisieren Sie Chitosan-beschichtete Platten durch Behandlung unter ultraviolettem Licht über Nacht bei Raumtemperatur.

3. Zellaussaat

  1. Vorwarme Proliferationsmedium PBS-Lösung und Trypsin/EDTA-Lösung bis 37 °C.
  2. Entsorgen Sie den Überstand aus dem T-75-Zellkulturkolben.
  3. Waschen Sie konfluente PDL-Zellen mit 10 ml PBS-Lösung.
  4. Verwerfen Sie die PBS-Lösung.
  5. Fügen Sie 1 ml Trypsin/EDTA-Lösung zum T-75-Zellkulturkolben hinzu.
  6. Inkubieren Sie Zellen mit Trypsin/EDTA-Lösung für 3 min bei 37 °C.
  7. Beenden Sie den Verdauungsprozess von Trypsin, indem Sie 3 ml Proliferationsmedium zu T-75 Zellkulturkolben hinzufügen.
  8. Übertragen Sie die vorbereitete Zellsuspension in ein 15 ml konisches Zentrifugenrohr.
  9. Zentrifugieren Sie die Suspension für 5 min bei 300 x g und Raumtemperatur.
  10. Entsorgen Sie den Überstand aus dem 15 ml konischen Zentrifugenrohr und hängen Sie das Zellpellet in 500 l Proliferationsmedium wieder auf.
  11. Zählen Sie PDL-Zellen mit einem Hämozytometer.
  12. Seed PDL-Zellen in der Dichte von 0,5 x 104, 1 x 104, 3 x 104und 6 x 104 Zellen/cm2.
  13. Kultur PDL-Zellen auf Chitosan-Filmen in einem Inkubator bei 37 °C in 5% CO2 mit befeuchteter Luft.
  14. Ändern Sie das Kulturmedium danach zweimal pro Woche.
  15. Beobachten Sie an den Tagen 1, 2, 3, 4 und 5 die Zellmorphologie täglich über ein inverses Phasenkontrastmikroskop.

4. Zellüberleben

  1. Nach 1, 3 und 6 Tagen Kultur, bestimmen Sie das Überleben der Zellen mit einem kommerziellen Lebensfähigkeit / Zytotoxizität Kit.
  2. In einem 15 ml Rohr 2 ml einer frischen Lösung von 2 mM Calcein-AM und 4 mM Ethidium-Homodimer in PBS durch Wirbeln für 5 s vorbereiten.
    HINWEIS: Halten Sie den Prozess im Dunkeln.
  3. Entfernen Sie das Kulturmedium und waschen Sie Sphäroide in PBS.
  4. Inkubieren Sie Sphäroide in PBS mit 2 mM Calcein-AM und 4 mM Ethidium-Homodimer für 30 min bei Raumtemperatur im Dunkeln.
  5. Sitheroide Sphäroide zweimal in PBS. Für Sphäroide aus einem Brunnen mit 24-Well-Platte, verwenden Sie 2 ml PBS für jedes Mal.
  6. Beobachten Sie die Proben mit einem Fluoreszenzmikroskop mit 10- oder 20-facher Vergrößerung.

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Representative Results

Mit dem vorliegenden Protokoll wurden erfolgreich lebensfähige PDL-Zellsphäride gebildet. Abbildung 1 zeigte, dass suspendierte Zellen oder Sphäroide anstelle von angehängten Zellen hauptsächlich auf Chitosan-Filmen beobachtet wurden. Bei der Saatdichte von 0,5 x 104 Zellen/cm2wurden gelegentlich an Tag 1 und 3 angehängte PDL-Zellen gefunden, und PDL-Zellsphäride wurden selten beobachtet. Im Gegenteil, für die Sädichten von 3 x 104 und 6 x 104 Zellen/cm2wurden seit Tag 1 verschiedene Größen von PDL Zellsphäriden gefunden. PDL-Zellsphäroidbildung wurde aus allen Sädichten nach 3 Tagen beobachtet. Wie in Abbildung 1dargestellt, war 3 x 104 Zellen/cm2 die optimale PDL-Zellsaatdichte, da die Größe der PDL-Zellsphäroide bei dieser Zellsaatdichte homogen war. Nach 5 Tagen Kultur wurden größere Sphäroide für alle Zellsädichten gebildet. Ausgesetzte PDL-Zellen wurden am 5. Tag selten gefunden.

Die Lebensfähigkeit von PDL-Zellen in Sphäroiden wurde nach 1, 3 und 6 Tagen beurteilt. Wie in Abbildung 2dargestellt, waren die meisten Zellen in Sphäroiden lebende Zellen an Tag 1, 3 und 6. Während am 6. Tag, die Anzahl der toten Zellen wurde im zentralen Teil erhöht.

Figure 1
Abbildung 1. Die Morphologie der PDL Zellsphäroide.
Bei der Sädichte von 0,5 x 104 Zellen/cm2wurden PDL-Zellsphäride an Tag 1 und 3 selten beobachtet. Für die Sädichten von 3 x 104 und 6 x 104 Zellen/cm2wurden seit tag 1 verschiedene Größen von PDL Zellsphäroiden gefunden. PDL-Zellsphäroidbildung wurde aus allen Sädichten nach 3 Tagen beobachtet. Nach 5 Tagen Kultur wurden größere Sphäroide für alle Zellsädichten gebildet. Ausgesetzte PDL-Zellen wurden am 5. Tag selten gefunden. Maßstabsleiste: 200 m. Diese Zahl wurde von Yan et al.14geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2. Die Lebensfähigkeit von PDL Zellsphäriden auf Chitosan-Filmen.
Die Lebensfähigkeit von PDL-Zellen in Sphäroiden wurde nach 1, 3 und 6 Tagen beurteilt. Wie hier gezeigt, waren die meisten Zellen in Sphäroiden lebende Zellen an Tag 1, 3 und 6. Während am 6. Tag, die Anzahl der toten Zellen wurde im zentralen Teil erhöht. Skalenbalken: 200 m. Diese Zahl wurde von Yan et al.14geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Die vorliegende Studie führte ein 3D-Zellkultursystem ein, um einige Einschränkungen im Zusammenhang mit konventioneller 2D-Monolayer-Zellkultur zu überwinden. Nach dem Protokoll, PDL zelluläre Sphäroide wurden erfolgreich durch die Kultivierung von Zellen auf Chitosan-Filme gebildet. Unsere vorherige Studie berichtete, dass die Sphäroidbildung die Selbsterneuerungs- und osteogene Differenzierungskapazitäten von PDL-Zellen14erhöht hat. Anstatt ein Enzym zu verwenden, um Zellen aus TCPS zu ernten, könnten PDL-Zellsphäride aus Chitosan-Filmen geerntet werden, indem das Medium einfach ein paar Mal14pipetiert werden. So können ECM- und interzelluläre Knoten gut erhalten werden.

Zu den entscheidenden Schritten dieses Protokolls gehören: (1) sicherstellen, dass die chirurgischen Instrumente und Chitosanfilme für die Zellkultur sterilisiert werden; (2) Abkratzen der PDL aus dem mittleren Drittel der Wurzel, um Kontaminationen durch Gingiva oder apikales Gewebe zu vermeiden; und (3) eine höhere Zellsädichte (ca. 3 x 104 Zellen/cm2 ) für die erfolgreiche Sphäroidbildung von PDL-Zellen.

Eine Einschränkung für diese Methode ist jedoch, dass eine verminderte Proliferation von PDL-Zellen nach Sphäroidbildung14beobachtet wurde, was einigen früheren Studien ähnelt, die an Fettstromalzellen10 und hepatozellulärem Karzinom durchgeführt wurden. Zelllinie15. Dies wird wahrscheinlich durch die unterschiedliche Regulierung von cyclinabhängigen Kinase-Inhibitoren zwischen Sphäroid- und Monolayer-Zellen16verursacht. Um die klinische Anwendung zu nutzen, sind weitere Studien zur Förderung der Proliferation von Zellsphäriden erforderlich.

Ein weiterer Nachteil des zellulären Sphäroids ist die unzureichende Diffusion im Kern. Obwohl PDL-Zellen hauptsächlich in der Sphäroidkultur lebten, wurde die Anzahl der abgestorbenen Zellen im zentralen Teil der Sphäroide an Tag 6 erhöht. Dieses Phänomen war wahrscheinlich, weil die Diffusion von Sauerstoff und Nährstoffen im Sphäroidkern beeinträchtigt ist, da PDL Zellsphäride größer werden17,18.

Andere Methoden, die berichtet, zelluläre Sphäroide zu induzieren gehören eine nicht-haftende Oberfläche19, Mikrowells20, Spinnerkolben21, mikrogemusterte Oberflächen22,23, hängende Tropfen24, und ein Zwangsaggregationstechnik25. Im Vergleich zu den oben genannten Methoden sind Chitosan-Filme relativ kostengünstig und leicht zu reproduzieren. Ein weiterer Vorteil dieser Methode sind die antimikrobiellen Eigenschaften von Chitosan26, das für die In-vitro-Zellkultur signifikant vorteilhaft ist.

Zusammenfassend stellen wir hier detaillierte 3D-Zell-Sphäroid-Kulturprotokolle auf Basis von Chitosan-Filmen vor. Die Kultur der PDL zellulären Sphäroide überwindet einige der Einschränkungen im Zusammenhang mit konventioneller 2D TCPS-Zellkultur und eignet sich daher möglicherweise für die Produktion von PDL-Zellen mit einer verbesserten therapeutischen Wirksamkeit für die zukünftige parodontale Geweberegeneration.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Diese Studie wurde von der National Natural Science Foundation of China (NSFC 81700978), Fundamental Research Funds for the Central Universities (1504219050), Natural Science Foundation of Shanghai (17ZR1432800) und Dem Shanghai Medical Exploration Project ( 17411972600).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
α-MEM Gibco 11900-073
acetic acid  Sigma-Aldrich 64197
Cell culture flask 25 cm2 Corning 430639
Cell culture flask 75 cm2 Corning 430641
Chitosan Heppe Medical Chitosan GmbH / molecular weight 500 kDa, degree of deacetylation 85%
FCS Gibco 26140-079
Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit Molecular Probes L3224
NaOH Sigma-Aldrich 1310732
PBS KeyGen Biotech  KGB5001
pen/strep Gibco 15140-122
Trypsin/EDTA  KeyGen Biotech  KGM25200
15 mL conical centrifuge tube Corning 430790
24-well plate Corning 3524

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