العلاج المناعي بالتبني من خلايا iNKT في الجلوكوز-6-الفوسفات Isomerase (G6PI) الناجمة عن الفئران RA
Summary
يستخدم هذا البروتوكول الببتيدات المختلطة G6PI لبناء نماذج التهاب المفاصل الروماتويدي التي هي أقرب إلى أن من التهاب المفاصل الروماتويدي الإنسان في CD4+ الخلايا التائية وسيتوكينات. تم الحصول على الخلايا التائية القاتلة الطبيعية عالية النقاء (iNKT2 بشكل رئيسي) مع أنماط ظاهرية ووظائف محددة عن طريق الاستقراء في الجسم الحي والتنقية المختبرية للعلاج المناعي بالتبني.
Abstract
التهاب المفاصل الروماتويدي (RA) هو مرض المناعة الذاتية الالتهابي المزمن المعقد. يرتبط الإمراض للمرض بخلايا T (iNKT) القاتلة الطبيعية الثابتة. المرضى الذين يعانون من RA النشطة تقديم عدد أقل من الخلايا iNKT, وظيفة الخلية المعيبة, والاستقطاب المفرط من Th1. في هذه الدراسة، تم إنشاء نموذج الحيوانات RA باستخدام خليط من hGPI325-339 وhGPI469-483 الببتيدات. تم الحصول على خلايا iNKT عن طريق الاستقراء في الجسم الحي وتنقية المختبر، تليها ضخ في الفئران RA للعلاج المناعي بالتبني. كشف نظام التصوير في الجسم الحي (IVIS) تتبع أن خلايا iNKT كانت موزعة بشكل رئيسي في الطحال والكبد. في اليوم 12 بعد العلاج بالخلايا ، تباطأ تطور المرض بشكل كبير ، وتم تخفيف الأعراض السريرية ، وزيادة وفرة خلايا iNKT في الغدة الصعترية ، وانخفضت نسبة iNKT1 في الغدة الصعترية ، وانخفضت مستويات TNF-α ، IFN-α ، وIL-6 في انخفض المصل. العلاج المناعي بالتبني من خلايا iNKT استعادة توازن الخلايا المناعية وتصحيح الالتهاب المفرط في الجسم.
Introduction
التهاب المفاصل الروماتويدي (RA) هو مرض المناعة الذاتية التي تتميز المزمنة، الغازية التدريجيمع 0.5-1% الإصابة1،2. ويعزى الإمراض الكامنة إلى الانتشار غير الطبيعي للخلايا CD4+ و CD8+ T ، التي تتجلى في زيادة في نسبة CD4+IFN– ο + وCD4+IL – 17A+ الخلايا التائية ، وانخفاض عدد CD4+IL – 4+ وCD4+CD25+FoxP3+ الخلايا التائية. لذلك ، يتم زيادة إفراز السيتوكينات الالتهابية ، ويدمر التفاعل الالتهابي المفرط التوازن الأصلي ووظيفة التسامح في الجهاز المناعي في الجسم. وعلاوة على ذلك، فإن الخلايا اللمفاوية T المساعد (Th) 1 الخلايا التي تخترق المفصل تفاقم الاستجابة الالتهابية وتلف المفاصل. لذلك ، فإن تثبيط الاستجابة الالتهابية المفرطة واستعادة التسامح المناعي والتوازن المناعي هي المفتاح لعلاج RA3،4.
تحتوي خلايا iNKT على كل من وظائف وخصائص الخلية NK وT. خلايا iNKT تأوي مستقبلات خلايا T (TCR) مميزة وثابتة (TCR) α-chain مع TCR α-chain محدود 5وتتعرف على مستضد الجليكوبيد الذي تقدمه الفئة الرئيسية من المعقدة الهيستونتيفية (MHC) I جزيء CD1d على سطح الخلايا التي تقدم المستضد. اكتشف ميتسو وآخرون6 عددًا كبيرًا من خلايا iNKT وعيوبوظيفية في العديد من أمراض المناعة الذاتية، بما في ذلك RA. Aurore وآخرون7 أظهرت أن خلايا iNKT لها تأثير إيجابي على الحفاظ على التسامح المناعة الذاتية وأنه عندما يتم استعادة عدد ووظيفة الخلايا iNKT، يتم تخفيف المرض. وبالإضافة إلى ذلك، وجد ميللوت – غاسو وآخرون8 أن خلايا iNKT لم تقم بإلغاء المرض فحسب، بل زادت أيضا ً من تطور المرض. تشير هذه النتائج المتناقضة إلى أن خلايا iNKT هي خلايا T غير متجانسة ، ويمكن عكس وظيفة المجموعات الفرعية المختلفة. في دراسة سريرية لجمهورية راك، تواتر خلايا iNKT ترتبط مع درجة نشاط المرض9. وأكدت النتائج أيضا أن تواتر iNKT انخفض في مرضى RA، وعدد CD4+IFN-ο+ مجموعات الخلايا T زاد، ومستويات إفراز السيتوكينات الالتهابية IFN-α وTNF-α زيادة10،11. بالإضافة إلى ذلك ، حقق شريف وآخرون12 في مرض السكري من النوع 1 (T1D) ووجدوا أن التسريب الانتقائي لخلايا iNKT أدى إلى زيادة تنظيم التعبير عن السيتوكين الالتهابي IL-4 ، وحافظ على التسامح المناعي ، ومنع تطور مرض السكري من النوع 1. ولذلك، ضخ بالتبني من خلايا iNKT محددة أو التنشيط المستهدف للخلايا iNKT يزيد من مستوى خلايا iNKT في مرضى RA، والتي يمكن أن تكون اختراقا في العلاج RA.
العلاج المناعي الخلوي حاليا من اهتمام كبير، وقد استخدمت على نطاق واسع في علاج السرطان. ومع ذلك، فإن خلايا iNKT هي خلايا نادرة وغير متجانسة للمناعة (فقط 0.3٪ من العدد الإجمالي لمركبات ثنائي الفينيل متعدد البروم)13، مما يحد من التطبيقات السريرية المحتملة. وتنقسم هذه الخلايا أساسا إلى ثلاث مجموعات فرعية: 1) خلايا iNKT1، التي لديها تعبير عال من بروتين البلعوم الببروني بالإصبع الزنك (PLZF) وعامل النسخ T-box (T-bet)؛ 2) خلايا iNKT2 مع التعبير المتوسط من PLZF وجاتا البروتين ملزمة 3 (GATA3)؛ 3) iNKT17 الخلايا مع انخفاض التعبير عن PLZF والرتينويد ذات الصلة مستقبلات نووية يتيمة (ROR) – αt التي تفرز IFN-ο، IL-4، وIL-1714. خلايا iNKT المنشطة تفرز Th1 و Th2 و Th17 مثل السيتوكينات ، والتي تحدد الآثار المناعية المختلفة لخلايا iNKT15. تختلف الآثار المناعية والعلاجالمناعي للتنشيط المحدد لمختلف الفئات السكانية الفرعية لخلايا iNKT. لذلك ، فإن اختيار الأنماط الظاهرية المحددة لخلايا iNKT (بشكل رئيسي iNKT2) مع وظائف مضادة للالتهابات لتنظيم الاستجابة المناعية للجسم يمكن أن يصحح عدم التوازن المناعي والاضطرابات المناعية في RA.
إنشاء نموذج مثالي للحيوانات ذات أهمية كبيرة لعلاج ودراسة الإمراض RA. في الوقت الحاضر ، تشمل النماذج الحيوانية الأكثر استخدامًا ونضجًا التهاب المفاصل الناجم عن الكولاجين ، والتهاب المفاصل المعقّد ، والتهاب المفاصل الناجم عن الزيموسان ، والتهاب المفاصل الناجم عن البوليسكاريد16–17. ومع ذلك ، لا يوجد نموذج يمكن أن يحاكي بشكل كامل جميع ميزات RA الإنسان. النوع الثاني من التهاب المفاصل الناجم عن الكولاجين (CIA) هو نموذج التهاب المفاصل الكلاسيكي. وكالة المخابرات المركزية هو الناجم عن تحصين الفئران مع النوع الثاني الكولاجين محددة الأجسام المضادة أحادية النسيلة، مما يعكس الاعتماد على الأجسام المضادة لهذا النموذج المرض. وصف Benurs وآخرون نموذجًا مع استجابة مناعية جهازية لـ glucose-6-phosphate isomerase (G6PI) ، والذي يحفز التهاب المفاصل المتماثل المحيطي في سلالات الماوس الحساسة18،19. في هذا النموذج ، يعتمد تطور التهاب المفاصل على الخلايا التائية والخلايا B والمناعة الفطرية18و19و20. وجد Horikoshi21 أن نماذج RA الناتجة عن تحصين فئران DBA/1 بشظايا البولي ببتيد G6PI هي أكثر تشابهًا مع RA البشري من حيث خلايا CD4+ T والسيتوكينات (أي IL-6 و TNF-α) من نماذج وكالة الاستخبارات المركزية. من أجل زيادة التأثير المحفز على موقع التعرف على TCR ، تم استخدام شظايا البولي ببتيد المختلطة من G6PI (hGPI325-339 و hGPI469-483) لتحصين فئران DBA/1 لبناء نموذج الماوس RA. يمكن أن يكون معدل نجاح هذا النهج مرتفعًا لأن hGPI325-339 و hGPI469-483 هما مناعيان مهيمنان لاستجابات الخلايا التُوتية المقيدة I-A. لذلك ، يمكن لهذا النموذج محاكاة الانتشار المفرط لخلايا CD4+ T وعيوب خلايا iNKT في مرضى RA22. وضعت الأبحاث الأساسية لعلم الأمراض المناعية RA الأساس لمزيد من التحقيق المتعمق.
Protocol
Representative Results
Discussion
خلايا iNKT هي خلايا T خاصة تسد المناعة الفطرية والتكيفية ويتم تطويرها بشكل رئيسي من CD4++/ CD8+ thymocytes. خلايا iNKT لديها وظائف متنوعة المناعة التنظيمية وتتفاعل مع الخلايا المناعية الأخرى عن طريق الاتصال المباشر وإفراز السيتوكينات المختلفة23، مما يؤثر على الخلا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم دراستنا من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (NSFC) (81771755) ، والكليات والجامعة العلمية والتكنولوجية مشروع البحوث الرئيسية في مقاطعة خبى (ZD2017009) ومختبر الحيوان من مركز التجارب الطبية ، جامعة خبى. ونحن ممتنون لدعمهم.
Materials
| Alexa Fluor 647 Mouse Anti-PLZF | BD | 563490 | America |
| Anti-PE MicroBeads | Miltenyi | 130-048-801 | Germany |
| Columns | Miltenyi | MS | Germany |
| Cryogenic Centrifuge | Beckman | Allegra® X-15R | America |
| DiR | Thermo Fisher Scientific | D12731 | America |
| Embedding Center | Tianjin Aviation Electromechanical Co., Ltd. | BMJ-1 | China |
| FITC Hamster Anti-Mouse TCR β Chain | BD | 553170 | America |
| Flow cytometer | BD | Accuri C6 | America |
| Freund's complete adjuvant | Sigma | F5881 | America |
| hGPI325-339 (IWYINCFGCETHAML) | Karebay Biochem | 18062202 | China |
| hGPI469-483 (EGNRPTNSIVFTKLT) | Karebay Biochem | 18062203 | China |
| In Vivo Imaging System | PerkinElmer | caliper IVIS lumina II | America |
| Ionomycin Calcium | Cayman | 10004974 | America |
| KRN7000 | AdipoGen | AG-CN2-0013 | America |
| Mouse CD1d Tetramer-PE | MBL | TS-MCD-1 | Japan |
| Mouse percoll | Solarbio | P8620 | China |
| Optical Microscope | Olympus | Olympus-II | Japan |
| PerCP-CyTM5.5 Mouse anti-ROR-ϒt | BD | 562683 | America |
| PerCP-CyTM5.5 Mouse anti-T-bet | BD | 561316 | America |
| Pertussis toxin | Sigma | P7208 | America |
| phorbol esters | Cayman | 10008014 | America |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | BD | 555899 | America |
| RPMI-1640 | Biological Industries | 01-100-1ACS | Israel |
| Th1/Th2/Th17 cytokines kit | BD | 560485 | America |
| Ultramicrotome | Leica | Leica EM UC6 | Germany |
References
- Tobón, G. J., Youinou, P., Saraux, A. The environment, geo-epidemiology, and autoimmune disease: Rheumatoid arthritis. Autoimmunity Reviews. 35 (1), 0 (2010).
- Cross, M., et al. The global burden of rheumatoid arthritis: estimates from the Global Burden of Disease 2010 study. Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (7), 1316-1322 (2014).
- Kanashiro, A., Bassi, G. S., Queiróz Cunha, F. D., Ulloa, L. From neuroimunomodulation to bioelectronic treatment of rheumatoid arthritis. Bioelectronics in Medicine. 1 (2), 151-165 (2018).
- Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions. Nature Reviews Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).
- Bianca, B. S. Unraveling Natural Killer T-Cells Development. Frontiers in Immunology. 8, 1950 (2018).
- Mitsuo, A., et al. Decreased CD161+CD8+ T cells in the peripheral blood of patients suffering from rheumatic diseases. Rheumatology. 45 (12), 1477-1484 (2006).
- Miellot, A., et al. Activation of invariant NK T cells protects against experimental rheumatoid arthritis by an IL-10-dependent pathway. European Journal of Immunology. 35 (12), 3704-3713 (2005).
- Miellot-Gafsou, A., et al. Early activation of invariant natural killer T cells in a rheumatoid arthritis model and application to disease treatment. Immunology. 130 (2), 296-306 (2010).
- Tudhope, S. J., Delwig, A. V., Falconer, J., Pratt, A., Ng, W. F. Profound invariant natural killer t-cell deficiency in inflammatory arthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 69 (10), 1873-1879 (2010).
- Ming, M., et al. Effects on immunoregulation of iNKT cells in RA by novel synthetic immunostimulator CH1b. Chinese Journal of Immunology. 32 (02), 218-222 (2016).
- Ming, M., et al. Study of the correlation between the percentage of iNKT cells and the ratio of IFN-γ/IL-4 in patients with rheumatoid arthritis. Chinese Journal of Microbiology Immunology. 35 (3), 213-218 (2015).
- Sharif, S., et al. Activation of natural killer T cells by α-galactosylceramide treatment prevents the onset and recurrence of autoimmune Type 1 diabetes. Nature Medicine. 7, 1057-1062 (2010).
- Gapin, L. Development of invariant natural killer T cells. Current Opinion in Immunology. 39, 68-74 (2016).
- Kwon, D. I., Lee, Y. J. Lineage Differentiation Program of Invariant Natural Killer T Cells. Immune Network. 17 (6), (2017).
- Thapa, P., et al. The differentiation of ROR-γt expressing iNKT17 cells is orchestrated by Runx1. Scientific Reports. 7 (1), 7018 (2017).
- Schurgers, E., Billiau, A., Matthys, P. Collagen-induced arthritis as an animal model for rheumatoid arthritis: focuson interferon-γ. Interferon Cytokine Research. 31 (12), 917-926 (2011).
- Van Haalen, H. G. M., Severens, J. L., Tran-Duy, A., Boonen, A. How cost-effectiveness A systematic review and stepwise approach for selecting a transferable health economic evaluation rheumatoid arthritis. Pharmacoeconomics. 32 (5), 429-442 (2014).
- Schubert, D., Maier, B., Morawietz, L., Krenn, V., Kamradt, T. Immunization with glucose-6-phosphate isomerase induces T cell-dependent peripheral polyarthritis in genetically unaltered mice. Journal of Immunology. 172, 4503-4509 (2004).
- Bockermann, R., Schubert, D., Kamradt, T., Holmdahl, R. Induction of a B-cell-dependent chronic arthritis with glucose-6-phosphate isomerase. Arthritis Research, Therapy. 7, 131613-131624 (2005).
- Kamradt, T., Schubert, D. The role and clinical implications of G6PI in experimental models of rheumatoid arthritis. Arthritis Research, Therapy. 7, 20-28 (2005).
- Horikoshi, M., et al. Activation of Invariant NKT Cells with Glycolipid Ligand α-Galactosylceramide Ameliorates Glucose-6-Phosphate Isomerase Peptide-Induced Arthritis. PlosOne. 7 (12), 51215 (2012).
- Zhang, X. J., et al. Immunization with mixed peptides derived from glucose-6-phosphate isomerase induces rheumatoid arthritis in DBA /1 mice. Chinese Journal of Pathophysiology. 32 (3), 569-576 (2016).
- Motohashi, S., Nakayama, T. Invariant natural killer T cell-based immunotherapy for cancer. Immunotherapy. 1 (1), 73 (2017).
- Jung, S., et al. The requirement of natural killer T-cells in tolerogenic APCs-mediated suppression of collagen-induced arthritis. Experimental and Molecular Medicine. 42 (8), 547-554 (2010).
- Luc, V. K., Lan, W. Therapeutic Potential of Invariant Natural Killer T Cells in Autoimmunity. Frontiers in Immunology. 9, 519-526 (2018).
- Chiba, A., et al. Suppression of collagen-induced arthritis by natural killer T cell activation with OCH, a sphingosine-truncated analog of α-galactosylceramide. Arthritis, Rheumatism. 50 (1), 305-313 (2004).
- Tudhope, S. J., Delwig, A. V., Falconer, J., Pratt, A., Ng, W. F. Profound invariant natural killer t-cell deficiency in inflammatory arthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 69 (10), 1873-1879 (2010).
- Bruns, L., et al. Immunization with an immunodominant self-peptide derived from glucose-6-phosphate isomerase induces arthritis in DBA/1 mice. Arthritis Research, Therapy. 11 (4), (2009).
- Parietti, V., et al. Rituximab treatment overcomes reduction of regulatory iNKT cells in patients with rheumatoid arthritis. Clinical Immunology. 134 (3), 331-339 (2010).
- Yoshida, Y., et al. Functional mechanism(s) of the inhibition of disease progression by combination treatment with fingolimod plus pathogenic antigen in a glucose-6-phosphate isomerase peptide-induced arthritis mouse model. Biological, Pharmaceutical Bulletin. 38 (8), 1120-1125 (2015).
- Chen, D., et al. Study of the adoptive immunotherapy on rheumatoid arthritis with Thymus-derived invariant natural killer T cells. International Immunopharmacology. 67, 427-440 (2019).
