Adoptieve immunotherapie van iNKT-cellen in glucose-6-fosfaat-isomerase (G6PI)-Geïnduceerde RA-muizen
Summary
Dit protocol maakt gebruik van G6PI gemengde peptiden om reumatoïde artritis modellen die dichter bij die van de menselijke reumatoïde artritis in CD4+ T cellen en cytokines construeren. Hoge zuiverheid invariant natuurlijke killer T cellen (voornamelijk iNKT2) met specifieke fenotypes en functies werden verkregen door in vivo inductie en in vitro zuivering voor adoptieve immunotherapie.
Abstract
Reumatoïde artritis (RA) is een complexe chronische inflammatoire auto-immuunziekte. De pathogenese van de ziekte is gerelateerd aan invariant natuurlijke killer T (iNKT) cellen. Patiënten met actieve RA presenteren minder iNKT-cellen, een defecte celfunctie en overmatige polarisatie van Th1. In deze studie werd een RA-diermodel opgezet met behulp van een mengsel van hGPI325-339 en hGPI469-483 peptiden. De iNKT-cellen werden verkregen door in vivo inductie en in vitro zuivering, gevolgd door infusie in RA-muizen voor adoptieve immunotherapie. Uit het in vivo imaging systeem (IVIS) bleek dat iNKT-cellen voornamelijk in de milt en lever werden verdeeld. Op dag 12 na de celtherapie vertraagde de progressie van de ziekte aanzienlijk, werden de klinische symptomen verlicht, nam de overvloed aan iNKT-cellen in de thymus toe, nam het aandeel iNKT1 in de thymus af en daalde het niveau van TNF-α, IFN-γ en IL-6 in het serum afnam. Adoptieve immunotherapie van iNKT-cellen herstelde het evenwicht van immuuncellen en corrigeerde de overmatige ontsteking van het lichaam.
Introduction
Reumatoïde artritis (RA) is een auto-immuunziekte gekenmerkt door chronische, progressieve invasiefheid met 0,5-1% incidentie1,2. De onderliggende pathogenese wordt toegeschreven aan de abnormale proliferatie van autoreactieve CD4+ en CD8+ T cellen, gemanifesteerd door een toename van het aandeel cd4+IFN-γ+ en CD4+IL-17A+ T cellen, en het verminderde aantal CD4+IL-4+ en CD4+CD25+FoxP3+ T cellen. Daarom wordt de afscheiding van ontstekingscytokinen verhoogd en vernietigt een overmatige ontstekingsreactie de inheemse balans en tolerantiefunctie van het immuunsysteem van het lichaam. Bovendien verergeren de helper T-lymfocyten (Th) 1 cellen die het gewricht binnendringen de ontstekingsreactie en gewrichtsschade. Daarom zijn de remming van overmatige ontstekingsrespons en herstel van immuuntolerantie en immuunbalans de sleutel tot de behandeling van RA3,4.
De iNKT cellen hebben zowel NK cel als T cel functies en kenmerken. De iNKT-cellen herbergen een aparte, invariant T-celreceptor (TCR) α-keten met beperkte TCR β-keten repertoires5 en herkennen het glycolipid antigeen gepresenteerd door het grote histocompatibiliteitscomplex (MHC) klasse I molecuul CD1d op het oppervlak van de antigeen-presenterende cellen. Mitsuo et al.6 ontdekte een groot aantal iNKT-cellen en functionele defecten bij veel auto-immuunziekten, waaronder RA. Aurore et al.7 toonden aan dat iNKT-cellen een positief effect hebben op het handhaven van auto-immuuntolerantie en dat wanneer het aantal en de functie van iNKT-cellen worden hersteld, de ziekte wordt verlicht. Bovendien, Miellot-Gafsou et al.8 bleek dat iNKT cellen niet alleen de ziekte ingetrokken, maar ook verhoogde de progressie van de ziekte. Deze tegenstrijdige resultaten suggereren dat iNKT-cellen heterogene T-cellen zijn en dat de functie van verschillende subgroepen kan worden omgekeerd. In een klinische studie van RA correleerde de frequentie van iNKT-cellen met de score van de ziekteactiviteit9. De resultaten bevestigden ook dat de frequentie van iNKT werd verlaagd bij RA-patiënten, het aantal CD4+IFN-γ+ T celsubsets steeg en de secretoire niveaus van ontstekingscytokines IFN-γ en TNF-α stegenmet 10,11. Bovendien onderzochten Sharif et al.12 diabetes type 1 (T1D) en ontdekten dat selectieve infusie van iNKT-cellen de expressie van de inflammatoire cytokine IL-4 uprestelde, immuuntolerantie handhaafde en de ontwikkeling van diabetes type 1 verhinderde. Daarom verhoogt adoptieve infusie van specifieke iNKT-cellen of gerichte activering van iNKT-cellen het niveau van iNKT-cellen bij RA-patiënten, wat een doorbraak kan zijn in ra-behandeling.
Cellulaire immunotherapie is momenteel van groot belang en is op grote schaal gebruikt in kankertherapie. INKT-cellen zijn echter zeldzame, heterogene immunoregulerende cellen (slechts 0,3% van het totale aantal PBMC’s)13, wat potentiële klinische toepassingen beperkt. Deze cellen zijn voornamelijk verdeeld in drie subpopulaties: 1) iNKT1 cellen, die een hoge expressie van promyelocytische leukemie zink-vinger eiwit (PLZF) en T-box transcriptie factor (T-bet); 2) iNKT2-cellen met tussenexpressie van PLZF en GATA bindend eiwit 3 (GATA3); 3) iNKT17 cellen met een lage expressie van PLZF en retinoïde-gerelateerde weesnucleaire receptor (ROR)-γt die IFN-γ, IL-4 en IL-1714afscheiden. Geactiveerde iNKT-cellen scheiden Th1, Th2 en Th17-achtige cytokinen af, die de verschillende immunomodulatorische effecten van iNKT-cellenbepalen 15. De immunomodulatorische en immunotherapeutische effecten van specifieke activering van verschillende subpopulaties van iNKT-cellen zijn verschillend. Daarom kan de selectie van specifieke fenotypes van iNKT-cellen (voornamelijk iNKT2) met ontstekingsremmende functies om de immuunrespons van het lichaam te reguleren, de immuunonbalans en immuunaandoeningen in RA corrigeren.
De oprichting van een ideaal diermodel is van groot belang voor de behandeling en studie van RA pathogenese. Momenteel, de meest gebruikte en volwassen dierlijke modellen omvatten collageen-geïnduceerde artritis, adjuvante artritis, zymosan-geïnduceerde artritis, en polysaccharide-geïnduceerde artritis16–17. Er is echter geen model dat alle kenmerken van de menselijke RA volledig kan simuleren. Type II collageen-geïnduceerde artritis (CIA) is een klassiek artritis model. De CIA wordt veroorzaakt door immunisatie van muizen met type II collageen-specifieke monoklonale antilichamen, als gevolg van de afhankelijkheid van het lichaam van dit ziektemodel. Benurs et al. beschreven een model met een systemische immuunrespons op glucose-6-fosfaat-isomerase (G6PI), dat perifere symmetrische polyartritis induceert bij vatbare muizenstammen18,19. In dit model is de ontwikkeling van artritis afhankelijk van T-cellen, B-cellen en aangeboren immuniteit18,19,20. Horikoshi21 vond dat RA-modellen als gevolg van immunisatie van DBA/1 muizen met G6PI polypeptide fragmenten zijn meer vergelijkbaar met de menselijke RA in termen van CD4+ T cellen en cytokinen (dat wil zeggen, IL-6 en TNF-α) dan de CIA-modellen. Om het stimulerende effect op de TCR-herkenningssite te vergroten, werden de gemengde polypeptidefragmenten van G6PI (hGPI325-339 en hGPI469-483) gebruikt om DBA/1 muizen te immuniseren om het RA-muismodel te construeren. Het slagingspercentage van deze aanpak kan hoog zijn omdat hGPI325-339 en hGPI469-483 immunodominant zijn voor I-A q-restricted T-celreacties. Daarom kan dit model de overproliferatie van CD4+ T-cellen en iNKT-celdefecten bij RA-patiëntensimuleren 22. Het basisonderzoek naar RA immunopathologie legde de basis voor ons verder diepgaand onderzoek.
Protocol
Representative Results
Discussion
iNKT-cellen zijn speciale T-cellen die aangeboren en adaptieve immuniteit overbruggen en voornamelijk worden ontwikkeld uit CD4++/CD8+ thymocyten. iNKT-cellen hebben uiteenlopende immunoregulerende functies en werken samen met andere immuuncellen door direct contact en afscheiding van verschillende cytokines23, die dendritische cellen (DC’s), macrofagen, neutrofielen, B-cellen, T-cellen en NK-celdifferentiatie en -ontwikkeling2<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Onze studie werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (NSFC) (81771755), Hogescholen en wetenschap en technologie van de universiteit belangrijk onderzoeksproject van de provincie Hebei (ZD2017009) en het Animal Lab of Medical Experiment Center, Hebei University. We zijn dankbaar voor hun steun.
Materials
| Alexa Fluor 647 Mouse Anti-PLZF | BD | 563490 | America |
| Anti-PE MicroBeads | Miltenyi | 130-048-801 | Germany |
| Columns | Miltenyi | MS | Germany |
| Cryogenic Centrifuge | Beckman | Allegra® X-15R | America |
| DiR | Thermo Fisher Scientific | D12731 | America |
| Embedding Center | Tianjin Aviation Electromechanical Co., Ltd. | BMJ-1 | China |
| FITC Hamster Anti-Mouse TCR β Chain | BD | 553170 | America |
| Flow cytometer | BD | Accuri C6 | America |
| Freund's complete adjuvant | Sigma | F5881 | America |
| hGPI325-339 (IWYINCFGCETHAML) | Karebay Biochem | 18062202 | China |
| hGPI469-483 (EGNRPTNSIVFTKLT) | Karebay Biochem | 18062203 | China |
| In Vivo Imaging System | PerkinElmer | caliper IVIS lumina II | America |
| Ionomycin Calcium | Cayman | 10004974 | America |
| KRN7000 | AdipoGen | AG-CN2-0013 | America |
| Mouse CD1d Tetramer-PE | MBL | TS-MCD-1 | Japan |
| Mouse percoll | Solarbio | P8620 | China |
| Optical Microscope | Olympus | Olympus-II | Japan |
| PerCP-CyTM5.5 Mouse anti-ROR-ϒt | BD | 562683 | America |
| PerCP-CyTM5.5 Mouse anti-T-bet | BD | 561316 | America |
| Pertussis toxin | Sigma | P7208 | America |
| phorbol esters | Cayman | 10008014 | America |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | BD | 555899 | America |
| RPMI-1640 | Biological Industries | 01-100-1ACS | Israel |
| Th1/Th2/Th17 cytokines kit | BD | 560485 | America |
| Ultramicrotome | Leica | Leica EM UC6 | Germany |
References
- Tobón, G. J., Youinou, P., Saraux, A. The environment, geo-epidemiology, and autoimmune disease: Rheumatoid arthritis. Autoimmunity Reviews. 35 (1), 0 (2010).
- Cross, M., et al. The global burden of rheumatoid arthritis: estimates from the Global Burden of Disease 2010 study. Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (7), 1316-1322 (2014).
- Kanashiro, A., Bassi, G. S., Queiróz Cunha, F. D., Ulloa, L. From neuroimunomodulation to bioelectronic treatment of rheumatoid arthritis. Bioelectronics in Medicine. 1 (2), 151-165 (2018).
- Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions. Nature Reviews Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).
- Bianca, B. S. Unraveling Natural Killer T-Cells Development. Frontiers in Immunology. 8, 1950 (2018).
- Mitsuo, A., et al. Decreased CD161+CD8+ T cells in the peripheral blood of patients suffering from rheumatic diseases. Rheumatology. 45 (12), 1477-1484 (2006).
- Miellot, A., et al. Activation of invariant NK T cells protects against experimental rheumatoid arthritis by an IL-10-dependent pathway. European Journal of Immunology. 35 (12), 3704-3713 (2005).
- Miellot-Gafsou, A., et al. Early activation of invariant natural killer T cells in a rheumatoid arthritis model and application to disease treatment. Immunology. 130 (2), 296-306 (2010).
- Tudhope, S. J., Delwig, A. V., Falconer, J., Pratt, A., Ng, W. F. Profound invariant natural killer t-cell deficiency in inflammatory arthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 69 (10), 1873-1879 (2010).
- Ming, M., et al. Effects on immunoregulation of iNKT cells in RA by novel synthetic immunostimulator CH1b. Chinese Journal of Immunology. 32 (02), 218-222 (2016).
- Ming, M., et al. Study of the correlation between the percentage of iNKT cells and the ratio of IFN-γ/IL-4 in patients with rheumatoid arthritis. Chinese Journal of Microbiology Immunology. 35 (3), 213-218 (2015).
- Sharif, S., et al. Activation of natural killer T cells by α-galactosylceramide treatment prevents the onset and recurrence of autoimmune Type 1 diabetes. Nature Medicine. 7, 1057-1062 (2010).
- Gapin, L. Development of invariant natural killer T cells. Current Opinion in Immunology. 39, 68-74 (2016).
- Kwon, D. I., Lee, Y. J. Lineage Differentiation Program of Invariant Natural Killer T Cells. Immune Network. 17 (6), (2017).
- Thapa, P., et al. The differentiation of ROR-γt expressing iNKT17 cells is orchestrated by Runx1. Scientific Reports. 7 (1), 7018 (2017).
- Schurgers, E., Billiau, A., Matthys, P. Collagen-induced arthritis as an animal model for rheumatoid arthritis: focuson interferon-γ. Interferon Cytokine Research. 31 (12), 917-926 (2011).
- Van Haalen, H. G. M., Severens, J. L., Tran-Duy, A., Boonen, A. How cost-effectiveness A systematic review and stepwise approach for selecting a transferable health economic evaluation rheumatoid arthritis. Pharmacoeconomics. 32 (5), 429-442 (2014).
- Schubert, D., Maier, B., Morawietz, L., Krenn, V., Kamradt, T. Immunization with glucose-6-phosphate isomerase induces T cell-dependent peripheral polyarthritis in genetically unaltered mice. Journal of Immunology. 172, 4503-4509 (2004).
- Bockermann, R., Schubert, D., Kamradt, T., Holmdahl, R. Induction of a B-cell-dependent chronic arthritis with glucose-6-phosphate isomerase. Arthritis Research, Therapy. 7, 131613-131624 (2005).
- Kamradt, T., Schubert, D. The role and clinical implications of G6PI in experimental models of rheumatoid arthritis. Arthritis Research, Therapy. 7, 20-28 (2005).
- Horikoshi, M., et al. Activation of Invariant NKT Cells with Glycolipid Ligand α-Galactosylceramide Ameliorates Glucose-6-Phosphate Isomerase Peptide-Induced Arthritis. PlosOne. 7 (12), 51215 (2012).
- Zhang, X. J., et al. Immunization with mixed peptides derived from glucose-6-phosphate isomerase induces rheumatoid arthritis in DBA /1 mice. Chinese Journal of Pathophysiology. 32 (3), 569-576 (2016).
- Motohashi, S., Nakayama, T. Invariant natural killer T cell-based immunotherapy for cancer. Immunotherapy. 1 (1), 73 (2017).
- Jung, S., et al. The requirement of natural killer T-cells in tolerogenic APCs-mediated suppression of collagen-induced arthritis. Experimental and Molecular Medicine. 42 (8), 547-554 (2010).
- Luc, V. K., Lan, W. Therapeutic Potential of Invariant Natural Killer T Cells in Autoimmunity. Frontiers in Immunology. 9, 519-526 (2018).
- Chiba, A., et al. Suppression of collagen-induced arthritis by natural killer T cell activation with OCH, a sphingosine-truncated analog of α-galactosylceramide. Arthritis, Rheumatism. 50 (1), 305-313 (2004).
- Tudhope, S. J., Delwig, A. V., Falconer, J., Pratt, A., Ng, W. F. Profound invariant natural killer t-cell deficiency in inflammatory arthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 69 (10), 1873-1879 (2010).
- Bruns, L., et al. Immunization with an immunodominant self-peptide derived from glucose-6-phosphate isomerase induces arthritis in DBA/1 mice. Arthritis Research, Therapy. 11 (4), (2009).
- Parietti, V., et al. Rituximab treatment overcomes reduction of regulatory iNKT cells in patients with rheumatoid arthritis. Clinical Immunology. 134 (3), 331-339 (2010).
- Yoshida, Y., et al. Functional mechanism(s) of the inhibition of disease progression by combination treatment with fingolimod plus pathogenic antigen in a glucose-6-phosphate isomerase peptide-induced arthritis mouse model. Biological, Pharmaceutical Bulletin. 38 (8), 1120-1125 (2015).
- Chen, D., et al. Study of the adoptive immunotherapy on rheumatoid arthritis with Thymus-derived invariant natural killer T cells. International Immunopharmacology. 67, 427-440 (2019).
