Adoptive Immuntherapie von iNKT-Zellen in Glucose-6-Phosphat-Isomerase (G6PI)-Induzierte RA-Mäuse
Summary
Dieses Protokoll verwendet G6PI gemischte Peptide, um rheumatoide Arthritis-Modelle zu konstruieren, die näher an denen der menschlichen rheumatoiden Arthritis in CD4+ T-Zellen und Zytokinen sind. Hochreine invariante natürliche Killer-T-Zellen (hauptsächlich iNKT2) mit spezifischen Phänotypen und Funktionen wurden durch In-vivo-Induktion und In-vitro-Reinigung zur Adoptivimmuntherapie erhalten.
Abstract
Rheumatoide Arthritis (RA) ist eine komplexe chronisch entzündliche Autoimmunerkrankung. Die Pathogenese der Krankheit ist mit invarianten natürlichen Killer-T-Zellen (iNKT) verwandt. Patienten mit aktiver RA präsentieren weniger iNKT-Zellen, defekte Zellfunktion und übermäßige Polarisation von Th1. In dieser Studie wurde ein RA-Tiermodell mit einer Mischung aus hGPI325-339 und hGPI469-483 Peptiden erstellt. Die iNKT-Zellen wurden durch In-vivo-Induktion und In-vitro-Reinigung gewonnen, gefolgt von einer Infusion in RA-Mäuse für die Adoptivimmuntherapie. Das In-vivo-Bildgebungssystem (IVIS)-Tracking ergab, dass iNKT-Zellen hauptsächlich in Milz und Leber verteilt waren. Am 12. Tag nach der Zelltherapie verlangsamte sich die Krankheitsprogression signifikant, die klinischen Symptome wurden gelindert, die Häufigkeit von iNKT-Zellen im Thymus nahm zu, der Anteil von iNKT1 im Thymus nahm ab, und die Konzentrationen von TNF-, IFN-, und IL-6 in das Serum verringerte sich. Die Adoptivimmuntherapie von iNKT-Zellen stellte das Gleichgewicht der Immunzellen wieder her und korrigierte die übermäßige Entzündung des Körpers.
Introduction
Rheumatoide Arthritis (RA) ist eine Autoimmunerkrankung, die durch chronische, fortschreitende Invasivität mit 0,5–1% Inzidenz1,2gekennzeichnet ist. Die zugrunde liegende Pathogenese wird auf die abnormale Proliferation von autoreaktiven CD4+ und CD8+ T-Zellen zurückgeführt, die sich durch einen Anstieg des Anteils von CD4+IFN-+ und CD4+IL-17A+ T-Zellen und die reduzierte Anzahl von CD4+IL-4+ und CD4+CD25 + FoxP3+T-Zellen manifestiert. Daher wird die Sekretion von entzündlichen Zytokinen erhöht, und eine übermäßige Entzündungsreaktion zerstört die native Gleichgewichts- und Toleranzfunktion des körpereigenen Immunsystems. Darüber hinaus verschlimmern der Helfer T Lymphozyten (Th) 1 Zellen, die das Gelenk durchdringen, die Entzündungsreaktion und Gelenkschäden. Daher sind die Hemmung einer übermäßigen Entzündungsreaktion und die Wiederherstellung der Immuntoleranz und des Immungleichgewichts der Schlüssel zur Behandlung von RA3,4.
Die iNKT-Zellen haben sowohl NK-Zell- als auch T-Zellfunktionen und -Eigenschaften. Die iNKT-Zellen beherbergen eine ausgeprägte, invariante T-Zell-Rezeptor-Kette (TCR) mit begrenztem TCR-Kettenrepertoire5 und erkennen das Glycolipid-Antigen, das durch das Hauptmolekül des Histokompatibilitätskomplexes (MHC) Der Klasse I auf der Oberfläche der Antigen-präsentierenden Zellen dargestellt wird. Mitsuo et al.6 entdeckten eine große Anzahl von iNKT-Zellen und funktionelle Defekte bei vielen Autoimmunerkrankungen, einschließlich RA. Aurore et al.7 zeigten, dass iNKT-Zellen einen positiven Effekt auf die Aufrechterhaltung der Autoimmuntoleranz haben und dass, wenn die Anzahl und Funktion der iNKT-Zellen wiederhergestellt werden, die Krankheit gelindert wird. Darüber hinaus fanden Miellot-Gafsou et al.8 heraus, dass iNKT-Zellen nicht nur die Krankheit aushoben, sondern auch das Fortschreiten der Krankheit erhöhten. Diese widersprüchlichen Ergebnisse deuten darauf hin, dass iNKT-Zellen heterogene T-Zellen sind und die Funktion verschiedener Teilmengen umgekehrt werden kann. In einer klinischen Studie mit RA korrelierte die Häufigkeit von iNKT-Zellen mit dem Score der Krankheitsaktivität9. Die Ergebnisse bestätigten auch, dass die Häufigkeit von iNKT bei RA-Patienten verringert wurde, die Anzahl der CD4+IFN-A+ T-Zell-Untergruppen stieg und die sekretorischen Konzentrationen der entzündlichen Zytokine IFN– und TNF—Werte um10,11stiegen. Darüber hinaus untersuchten Sharif et al.12 Typ-1-Diabetes (T1D) und fanden heraus, dass eine selektive Infusion von iNKT-Zellen die Expression des entzündlichen Zytokins IL-4 hochregulierte, die Immuntoleranz aufrechterhielt und die Entwicklung von Typ-1-Diabetes verhinderte. Daher erhöht die Adoptivinfusion bestimmter iNKT-Zellen oder die gezielte Aktivierung von iNKT-Zellen das Niveau von iNKT-Zellen bei RA-Patienten, was ein Durchbruch in der RA-Behandlung sein kann.
Die zelluläre Immuntherapie ist derzeit von großem Interesse und wurde häufig in der Krebstherapie eingesetzt. INKT-Zellen sind jedoch seltene, heterogene immunregulierende Zellen (nur 0,3% der Gesamtzahl der PBMCs)13, was potenzielle klinische Anwendungen einschränkt. Diese Zellen sind hauptsächlich in drei Subpopulationen unterteilt: 1) iNKT1-Zellen, die eine hohe Expression von promyelocytischer Leukämie Zink-Finger-Protein (PLZF) und T-Box-Transkriptionsfaktor (T-bet) haben; 2) iNKT2-Zellen mit Zwischenexpression von PLZF und GATA-Bindungsprotein 3 (GATA3); 3) iNKT17-Zellen mit geringer Expression von PLZF und retinooid-bezogenen Orphan-Rezeptor (ROR)–,–, die IFN-, IL-4 und IL-1714absondern. Aktivierte iNKT-Zellen sezernieren Th1, Th2 und Th17-ähnliche Zytokine, die die verschiedenen immunmodulatorischen Wirkungen von iNKT-Zellen15bestimmen. Die immunmodulatorischen und immuntherapeutischen Wirkungen der spezifischen Aktivierung verschiedener Subpopulationen von iNKT-Zellen sind unterschiedlich. Daher kann die Auswahl spezifischer Phänotypen von iNKT-Zellen (hauptsächlich iNKT2) mit entzündungshemmenden Funktionen zur Reregulierung der Immunantwort des Körpers das Immunungleichgewicht und Immunstörungen bei RA korrigieren.
Die Etablierung eines idealen Tiermodells ist von großer Bedeutung für die Behandlung und Untersuchung der RA-Pathogenese. Derzeit, die am häufigsten verwendeten und reifen Tiermodelle gehören Kollagen-induzierte Arthritis, adjuvante Arthritis, Zymosan-induzierte Arthritis, und Polysaccharid-induzierte Arthritis16–17. Es gibt jedoch kein Modell, das alle Funktionen menschlicher RA vollständig simulieren kann. Typ II Kollagen-induzierte Arthritis (CIA) ist ein klassisches Arthritis-Modell. Die CIA wird durch Immunisierung von Mäusen mit Typ-II-Kollagen-spezifischen monoklonalen Antikörpern induziert, die die Antikörperabhängigkeit dieses Krankheitsmodells widerspiegeln. Benurs et al. beschrieben ein Modell mit einer systemischen Immunantwort auf Glucose-6-Phosphat-Isomerase (G6PI), das periphere symmetrische Polyarthritis bei anfälligen Mausstämmen18,19induziert. In diesem Modell hängt die Entwicklung von Arthritis von T-Zellen, B-Zellen und angeborener Immunität18,19,20ab. Horikoshi21 fand heraus, dass RA-Modelle, die aus der Immunisierung von DBA/1-Mäusen mit G6PI-Polypeptidfragmenten resultieren, in Bezug auf CD4+ T-Zellen und Zytokine (d. h. IL-6 und TNF-A) ähnlicher sind als die CIA-Modelle. Um die stimulierende Wirkung auf die TCR-Erkennungsstelle zu erhöhen, wurden die gemischten Polypeptidfragmente von G6PI (hGPI325-339 und hGPI469-483) verwendet, um DBA/1-Mäuse zu immunisieren, um das RA-Mausmodell zu konstruieren. Die Erfolgsrate dieses Ansatzes kann hoch sein, da hGPI325-339 und hGPI469-483 immundominant für I-A q-eingeschränkte T-Zellreaktionen sind. Daher kann dieses Modell die Überproliferation von CD4+ T-Zellen und iNKT-Zelldefekten bei RA-Patienten simulieren22. Die Grundlagenforschung der RA-Immunpathologie legte den Grundstein für unsere weitere vertiefte Untersuchung.
Protocol
Representative Results
Discussion
iNKT-Zellen sind spezielle T-Zellen, die angeborene und adaptive Immunität überbrücken und hauptsächlich aus CD4++/CD8+ Thymosyten entwickelt werden. iNKT-Zellen haben verschiedene immunregulierende Funktionen und interagieren mit anderen Immunzellen durch direkten Kontakt und Sekretion verschiedener Zytokine23, die dendritische Zellen (DCs), Makrophagen, Neutrophile, B-Zellen, T-Zellen und NK-Zelldifferenzierung und -Entwicklung beeinflussen<sup c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Unsere Studie wurde von der National Natural Science Foundation of China (NSFC) (81771755), Colleges und dem Wissenschafts- und Technologie-Schlüsselforschungsprojekt der Provinz Hebei (ZD2017009) und dem Animal Lab of Medical Experiment Center, Hebei University, unterstützt. Wir sind dankbar für ihre Unterstützung.
Materials
| Alexa Fluor 647 Mouse Anti-PLZF | BD | 563490 | America |
| Anti-PE MicroBeads | Miltenyi | 130-048-801 | Germany |
| Columns | Miltenyi | MS | Germany |
| Cryogenic Centrifuge | Beckman | Allegra® X-15R | America |
| DiR | Thermo Fisher Scientific | D12731 | America |
| Embedding Center | Tianjin Aviation Electromechanical Co., Ltd. | BMJ-1 | China |
| FITC Hamster Anti-Mouse TCR β Chain | BD | 553170 | America |
| Flow cytometer | BD | Accuri C6 | America |
| Freund's complete adjuvant | Sigma | F5881 | America |
| hGPI325-339 (IWYINCFGCETHAML) | Karebay Biochem | 18062202 | China |
| hGPI469-483 (EGNRPTNSIVFTKLT) | Karebay Biochem | 18062203 | China |
| In Vivo Imaging System | PerkinElmer | caliper IVIS lumina II | America |
| Ionomycin Calcium | Cayman | 10004974 | America |
| KRN7000 | AdipoGen | AG-CN2-0013 | America |
| Mouse CD1d Tetramer-PE | MBL | TS-MCD-1 | Japan |
| Mouse percoll | Solarbio | P8620 | China |
| Optical Microscope | Olympus | Olympus-II | Japan |
| PerCP-CyTM5.5 Mouse anti-ROR-ϒt | BD | 562683 | America |
| PerCP-CyTM5.5 Mouse anti-T-bet | BD | 561316 | America |
| Pertussis toxin | Sigma | P7208 | America |
| phorbol esters | Cayman | 10008014 | America |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | BD | 555899 | America |
| RPMI-1640 | Biological Industries | 01-100-1ACS | Israel |
| Th1/Th2/Th17 cytokines kit | BD | 560485 | America |
| Ultramicrotome | Leica | Leica EM UC6 | Germany |
References
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