グルコース-6-リン酸イソメラーゼ(G6PI)誘発RAマウスにおけるiNKT細胞の導入免疫療法
Summary
このプロトコルは、G6PI混合ペプチドを使用して、CD4+ T細胞およびサイトカインにおけるヒト関節リウマチのモデルに近い関節リウマチモデルを構築します。特定の表現型および機能を有する高純度不変不変天然キラーT細胞(主にiNKT2)は、養子免疫療法のためのインビボ誘導およびインビトロ精製によって得られた。
Abstract
関節リウマチ(RA)は、複雑な慢性炎症性自己免疫疾患である。この疾患の病因は、不変性のナチュラルキラーT(iNKT)細胞に関連している。活性RAを有する患者は、より少ないiNKT細胞、欠損細胞機能、およびTh1の過剰な分極を有する。本研究では、hGPI325-339とhGPI469-483ペプチドの混合物を用いてRA動物モデルを確立した。iNKT細胞をインビボ誘導およびインビトロ精製により得られ、続いて、採用免疫療法用のRAマウスへの注入が行われた。インビボイメージングシステム(IVIS)の追跡により、iNKT細胞は主に脾臓および肝臓に分布していたことが明らかになった。細胞療法後12日目、疾患の進行は著しく低下し、臨床症状は緩和され、胸腺におけるiNKT細胞の存在量は増加し、胸腺におけるiNKT1の割合は減少し、TNF-α、IFN-γ、およびIL-6のレベルは1000年に増加した。血清が減少した。iNKT細胞の養子免疫療法は免疫細胞のバランスを回復させ、身体の過剰な炎症を矯正した。
Introduction
慢性関節リウマチ(RA)は、0.5~1%発生率1、2の慢性進行性侵襲を特徴とする自己免疫疾患である。その根底にある病因は自己反応性CD4+およびCD8+T細胞の異常増殖に起因し、CD4+IFN-γ+およびCD4+IL-17A+T細胞の割合の増加、およびCD4+IL-4+ + FoxP3+T細胞の減少した数によって明らかにされる。したがって、炎症性サイトカインの分泌が増加し、過度の炎症反応が身体の免疫系のネイティブバランスおよび耐性機能を破壊する。また、ヘルパーTリンパ球(Th)を関節に浸透させる1細胞は炎症反応や関節損傷を悪化させる。したがって、過剰な炎症反応の阻害と免疫寛容および免疫バランスの回復がRA3の治療の鍵である、4。
iNKT細胞は、NK細胞とT細胞の両方の機能と特性を有する。iNKT細胞には、限定TCRβ鎖レパートリー5を有する異なる不変T細胞受容体(TCR)α鎖を有し、抗原提示細胞の表面に主要組織適合性複合体(MHC)クラスI分子CD1dによって提示される糖脂質抗原を認識する。ミツオら6は、RAを含む多くの自己免疫疾患において多数のiNKT細胞および機能的欠陥を検出した。Aurore et al.7は、iNKT細胞が自己免疫寛容を維持するのにプラスの効果を有し、iNKT細胞の数と機能が回復すると、疾患が緩和されることを実証した。さらに、ミエロット・ガフソウら8は、iNKT細胞が病気を失起しただけでなく、病気の進行を増加させたことを発見した。これらの矛盾した結果は、iNKT細胞が異種T細胞であり、異なるサブセットの機能が逆転する可能性があることを示唆している。RAの臨床研究において、iNKT細胞の頻度は、疾患活性9のスコアと相関した。また、結果は、INKTの頻度がRA患者において減少し、CD4+IFN-γ+T細胞サブセットの数が増加し、炎症性サイトカインIFN-γおよびTNF-αの分泌レベルが10、11増加したことを確認した。さらに、シャリフら12は1型糖尿病(T1D)を調査し、iNKT細胞の選択的注入が炎症性サイトカインIL-4の発現をアップレギュレートし、免疫寛容を維持し、1型糖尿病の発症を妨げた。したがって、特定のiNKT細胞の導入またはiNKT細胞の標的活性化は、RA患者におけるiNKT細胞のレベルを増加させ、RA治療において画期的となり得る。
細胞免疫療法は現在、大きな関心を持っており、癌治療に広く使用されています。しかし、iNKT細胞は稀であり、異種免疫調節細胞(PBMCの総数のわずか0.3%)13であり、潜在的な臨床応用を制限する。これらの細胞は主に3つの亜集団に分けられる:1)iNKT1細胞は、前骨髄球性白血病ジンフィンガータンパク質(PLZF)およびTボックス転写因子(T-ベット)の高発現を有する。2) PLZFおよびGATA結合タンパク質3(GATA3)の中間発現を有するiNKT2細胞。3)INKT17細胞の発現が低いPLZF及びレチノイド関連の孤児核受容体(ROR)-γtがIFN-γ、IL-4、およびIL-1714を分泌する。活性化されたiNKT細胞は、Th1、Th2、およびTh17様サイトカインを分泌し、iNKT細胞15の異なる免疫調節効果を決定する。iNKT細胞の様々な亜集団の特異的活性化の免疫調節作用および免疫療法効果は異なる。従って、体の免疫応答を調節する抗炎症機能を有するiNKT細胞(主にiNKT2)の特定の表型の選択は、RAにおける免疫の不均衡および免疫障害を補正することができる。
理想的な動物モデルの確立は、RA病因の治療および研究にとって非常に重要である。現在、最も一般的に使用される成熟した動物モデルには、コラーゲン誘発関節炎、アジュバント関節炎、ジモサン誘発関節炎、多糖による関節炎16-17が含まれる。しかし、人間のRAのすべての特徴を完全にシミュレートできるモデルはありません。II型コラーゲン誘発関節炎(CIA)は、古典的な関節炎モデルです。CIAは、II型コラーゲン特異的モノクローナル抗体を用いたマウスの免疫によって誘導され、この疾患モデルの抗体依存性を反映している。Be歳代は、グルコース-6-リン酸イソメラーゼ(G6PI)に対する全身免疫応答を有するモデルを記載し、これは、感受性マウス株における末梢対称多関節炎を誘導する18、19である。このモデルでは、関節炎の発症はT細胞、B細胞、および自然免疫18、19、20に依存する。堀越21は、G6PIポリペプチド断片を有するDBA/1マウスの免疫から生じるRAモデルが、CIAモデルよりもCD4+T細胞およびサイトカイン(すなわち、IL-6およびTNF-α)の点でヒトRAに類似していることを発見した。TCR認識部位に対する刺激効果を高めるために、G6PI(hGPI325-339およびhGPI469-483)の混合ポリペプチド断片を使用して、DBA/1マウスを免疫化し、RAマウスモデルを構築した。hGPI325-339 および hGPI469-483 は I-A q 制限 T 細胞応答に対して免疫優位であるため、このアプローチの成功率は高くなる可能性があります。したがって、このモデルは、RA患者22におけるCD4+T細胞およびiNKT細胞欠損の過剰増殖をシミュレートすることができる。RA免疫病理学の基礎研究は、さらに詳細な調査の基礎を築きました。
Protocol
Representative Results
Discussion
iNKT細胞は、自然免疫と適応免疫を橋渡しする特殊なT細胞であり、主にCD4++ /CD8+胸腺細胞から開発されています。iNKT細胞は多様な免疫調節機能を有し、異なるサイトカイン23の直接接触および分泌により他の免疫細胞と相互作用し、樹状細胞(DC)、マクロファージ、好中球、B細胞、T細胞、およびNK細胞の分化および発達2<sup …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々の研究は、中国自然科学財団(NSFC)(81771755)、河北省の大学と大学の科学技術主要研究プロジェクト(ZD2017009)、河北大学動物実験センターによって支援されました。私たちは彼らのサポートに感謝しています。
Materials
| Alexa Fluor 647 Mouse Anti-PLZF | BD | 563490 | America |
| Anti-PE MicroBeads | Miltenyi | 130-048-801 | Germany |
| Columns | Miltenyi | MS | Germany |
| Cryogenic Centrifuge | Beckman | Allegra® X-15R | America |
| DiR | Thermo Fisher Scientific | D12731 | America |
| Embedding Center | Tianjin Aviation Electromechanical Co., Ltd. | BMJ-1 | China |
| FITC Hamster Anti-Mouse TCR β Chain | BD | 553170 | America |
| Flow cytometer | BD | Accuri C6 | America |
| Freund's complete adjuvant | Sigma | F5881 | America |
| hGPI325-339 (IWYINCFGCETHAML) | Karebay Biochem | 18062202 | China |
| hGPI469-483 (EGNRPTNSIVFTKLT) | Karebay Biochem | 18062203 | China |
| In Vivo Imaging System | PerkinElmer | caliper IVIS lumina II | America |
| Ionomycin Calcium | Cayman | 10004974 | America |
| KRN7000 | AdipoGen | AG-CN2-0013 | America |
| Mouse CD1d Tetramer-PE | MBL | TS-MCD-1 | Japan |
| Mouse percoll | Solarbio | P8620 | China |
| Optical Microscope | Olympus | Olympus-II | Japan |
| PerCP-CyTM5.5 Mouse anti-ROR-ϒt | BD | 562683 | America |
| PerCP-CyTM5.5 Mouse anti-T-bet | BD | 561316 | America |
| Pertussis toxin | Sigma | P7208 | America |
| phorbol esters | Cayman | 10008014 | America |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | BD | 555899 | America |
| RPMI-1640 | Biological Industries | 01-100-1ACS | Israel |
| Th1/Th2/Th17 cytokines kit | BD | 560485 | America |
| Ultramicrotome | Leica | Leica EM UC6 | Germany |
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