Immunothérapie adoptive des cellules iNKT dans les souris de RA induites par l'isomérase de glucose-6-Phosphate (G6PI)

Summary

Ce protocole utilise des peptides mixtes G6PI pour construire des modèles de polyarthrite rhumatoïde qui sont plus proches de celui de la polyarthrite rhumatoïde humaine dans les cellules^T CD4 et cytokines. Des lymphocytes T tueurs naturels invariants de haute pureté (principalement iNKT2) avec des phénotypes et des fonctions spécifiques ont été obtenus par induction in vivo et purification in vitro pour l’immunothérapie adoptive.

Abstract

La polyarthrite rhumatoïde (PR) est une maladie auto-immune inflammatoire chronique complexe. La pathogénie de la maladie est liée aux cellules tueuses naturelles invariantes De T (iNKT). Les patients présentant la RA active présentent moins de cellules iNKT, fonction cellulaire défectueuse, et polarisation excessive de Th1. Dans cette étude, un modèle animal de RA a été établi utilisant un mélange de hGPI325-339 et de peptides de hGPI469-483. Les cellules d’iNKT ont été obtenues par induction in vivo et purification in vitro, suivies de l’infusion dans des souris de RA pour l’immunothérapie adoptive. Le suivi du système d’imagerie in vivo (IVIS) a révélé que les cellules iNKT étaient principalement distribuées dans la rate et le foie. Le jour 12 après la thérapie cellulaire, la progression de la maladie a ralenti de manière significative, les symptômes cliniques ont été allégés, l’abondance des cellules iNKT dans le thymus a augmenté, la proportion d’iNKT1 dans le thymus a diminué, et les niveaux de TNF-, IFN-, et IL-6 dans le sérum a diminué. L’immunothérapie adoptive des cellules iNKT a rétabli l’équilibre des cellules immunitaires et a corrigé l’inflammation excessive du corps.

Introduction

La polyarthrite rhumatoïde (PR) est une maladie auto-immune caractérisée par une invasivité chronique et progressive avec une incidence de 0,5 à 1 %^1,2. La pathogénie sous-jacente est attribuée à la prolifération anormale des cellules CD4 et CD8 et T autoréactives, qui se manifeste par une augmentation de la proportion de CD4, IFN^et CD4, IL-17A, et par la réduction du nombre de cD4, il il-4 et CD4, CD25, FoxP3^et T. Par conséquent, la sécrétion des cytokines inflammatoires est augmentée, et une réaction inflammatoire excessive détruit l’équilibre indigène et la fonction de tolérance du système immunitaire du corps. En outre, le lymphocyte T aide (Th) 1 cellules qui pénètrent dans l’articulation aggravent la réponse inflammatoire et les dommages articulaires. Par conséquent, l’inhibition de la réponse inflammatoire excessive et le rétablissement de la tolérance immunitaire et l’équilibre immunitaire sont essentiels au traitement de la RA^3,4.

Les cellules iNKT ont à la fois des fonctions et des caractéristiques des cellules NK et des lymphocytes T. Les cellules iNKT abritent un récepteur de cellules T (TCR) distinct et invariant avec des répertoires limités de chaîne TCR⁵ et reconnaissent l’antigène glycolipidique présenté par la molécule majeure de classe I du complexe d’histocompatibilité (MHC) CD1d à la surface des cellules présentant des antigènes. Mitsuo et coll.⁶ ont détecté un grand nombre de cellules iNKT et de défauts fonctionnels dans de nombreuses maladies auto-immunes, y compris la polyarthrite rhumatoïde. Aurore et coll.⁷ ont démontré que les cellules iNKT ont un effet positif sur le maintien de la tolérance auto-immune et que lorsque le nombre et la fonction des cellules iNKT sont restaurés, la maladie est atténuée. En outre, Miellot-Gafsou et coll.⁸ ont constaté que les cellules iNKT non seulement abrogé la maladie, mais aussi augmenté la progression de la maladie. Ces résultats contradictoires suggèrent que les cellules iNKT sont des lymphocytes T hétérogènes, et la fonction de différents sous-ensembles peut être inversée. Dans une étude clinique de la POLY, la fréquence des cellules iNKT corrélée avec le score de l’activité de la maladie⁹. Les résultats ont également confirmé que la fréquence de l’iNKT a été diminuée chez les patients atteints de polyarthrite rhumatoïde, que le nombre de sous-ensembles de cellules^{T CD4}et IFN a augmenté, et que les niveaux sécréteurs de cytokines inflammatoires IFN et TNF-MD ont augmenté de^10,11. En outre, Sharif et coll.¹² ont étudié le diabète de type 1 (T1D) et ont constaté que l’infusion sélective de cellules iNKT régulait l’expression de la cytokine inflammatoire IL-4, maintenait la tolérance immunitaire et empêchait le développement du diabète de type 1. Par conséquent, l’infusion adoptive de cellules spécifiques d’iNKT ou l’activation ciblée des cellules d’iNKT augmente le niveau des cellules d’iNKT dans les patients de RA, qui peut être une percée dans le traitement de RA.

L’immunothérapie cellulaire est actuellement d’un grand intérêt et a été largement utilisé dans la thérapie contre le cancer. Cependant, les cellules iNKT sont rares, les cellules immunorégulatrices hétérogènes (seulement 0,3% du nombre total de PBMC)¹³, ce qui limite les applications cliniques potentielles. Ces cellules sont principalement divisées en trois sous-populations : 1) les cellules iNKT1, qui ont une forte expression de la leucémie promyélolocytique de la protéine zinc-doigt (PLZF) et du facteur de transcription de la boîte T (T-bet); 2) cellules iNKT2 avec expression intermédiaire de PLZF et gatA protéine de liaison 3 (GATA3); 3) cellules iNKT17 avec une faible expression de PLZF et rétinoïde-connexe récepteur nucléaire orphelin (ROR)-t qui sécrètent IFN-, IL-4, et IL-17¹⁴. Les cellules iNKT activées sécrètent des cytokines de type Th1, Th2 et Th17, qui déterminent les différents effets immunomodulatoires des cellules iNKT¹⁵. Les effets immunomodulatoires et immunothérapeutiques de l’activation spécifique de diverses sous-populations de cellules iNKT sont différents. Par conséquent, la sélection de phénotypes spécifiques de cellules iNKT (principalement iNKT2) avec des fonctions anti-inflammatoires pour réguler la réponse immunitaire de l’organisme peut corriger le déséquilibre immunitaire et les troubles immunitaires dans la PR.

L’établissement d’un modèle animal idéal est d’une grande importance pour le traitement et l’étude de la pathogénie de RA. À l’heure actuelle, les modèles animaux les plus couramment utilisés et matures comprennent l’arthrite induite par le collagène, l’arthrite adjuvante, l’arthrite induite par les zymosans et l’arthrite induite par le polysaccharide^16à17. Cependant, il n’existe aucun modèle qui puisse simuler pleinement toutes les caractéristiques de la POLY humaine. L’arthrite induite par le collagène de type II (CIA) est un modèle classique de l’arthrite. La CIA est induite par la vaccination des souris avec des anticorps monoclonaux de type II spécifiques au collagène, reflétant la dépendance d’anticorps de ce modèle de maladie. Benurs et coll. ont décrit un modèle avec une réponse immunitaire systémique à l’isomérase glucose-6-phosphate (G6PI), qui induit la polyarthrite symétrique périphérique dans les souches sensibles de souris^18,19. Dans ce modèle, le développement de l’arthrite dépend des lymphocytes T, des cellules B et de l’immunité innée^18,19,20. Horikoshi²¹ a constaté que les modèles de RA résultant de la vaccination des souris DBA/1 avec des fragments de polypeptide G6PI sont plus semblables à la RA humaine en termes de CD4^– lymphocytes T et cytokines (c.-à-d., IL-6 et TNF-) que les modèles de la CIA. Afin d’augmenter l’effet stimulant sur le site de reconnaissance TCR, les fragments mixtes de polypeptide de G6PI (hGPI325-339 et hGPI469-483) ont été utilisés pour immuniser les souris DBA/1 pour construire le modèle de souris RA. Le taux de réussite de cette approche peut être élevé parce que hGPI325-339 et hGPI469-483 sont immunodominants pour les réponses de lymphocytes T I-A q-restricted. Par conséquent, ce modèle peut simuler la surprolifération des cellules CD4^t et des défauts de cellules iNKT chez les patients atteints de POLY²². La recherche fondamentale de l’immunopathologie de RA a jeté les bases de notre recherche plus approfondie.

Protocol

Toutes les souris expérimentales (150 au total) étaient des souris mâles en bonne santé DBA/1, âgées de 6 à 8 semaines (20,0 à 1,5 g), dans un environnement spécifique exempt d’agents pathogènes (FPS). Il n’y a pas de traitement spécial avant la modélisation. L’expérience a été divisée en un groupe témoin sain (15 souris), un groupe témoin modèle (15 souris) et un groupe de thérapie cellulaire (55 souris). Cette étude a été approuvée par le Comité du bien-être animal et de l’éthique de l’Univer…

Representative Results

Le score de l’indice d’arthrite et l’épaisseur de la patte ont augmenté après la modélisation. Comparé au groupe témoin, les orteils du groupe modèle de RA ont commencé à montrer le gonflement rouge à 6 jours après modélisation, avec l’aggravation progressive. À 14 jours, l’enflure rouge dans l’articulation de cheville a culminé, suivie du soulagement progressif. L’épaisseur de la patte a changé de la même façon(P et lt; 0,05) (Figure 1). <p class="jove_content…

Discussion

Les cellules iNKT sont des lymphocytes T spéciaux qui comblent l’immunité innée et adaptative et sont principalement développés à partir de CD4^etde thymocytes CD8. Les cellules iNKT ont diverses fonctions immunorégulatrices et interagissent avec d’autres cellules immunitaires par contact direct et sécrétion de différentes cytokines²³, affectant les cellules dendritiques (DC), les macrophages, les neutrophiles, les cellules B, les lymphocytes …

Materials

Alexa Fluor 647 Mouse Anti-PLZF	BD	563490	America
Anti-PE MicroBeads	Miltenyi	130-048-801	Germany
Columns	Miltenyi	MS	Germany
Cryogenic Centrifuge	Beckman	Allegra® X-15R	America
DiR	Thermo Fisher Scientific	D12731	America
Embedding Center	Tianjin Aviation Electromechanical Co., Ltd.	BMJ-1	China
FITC Hamster Anti-Mouse TCR β Chain	BD	553170	America
Flow cytometer	BD	Accuri C6	America
Freund's complete adjuvant	Sigma	F5881	America
hGPI325-339 (IWYINCFGCETHAML)	Karebay Biochem	18062202	China
hGPI469-483 (EGNRPTNSIVFTKLT)	Karebay Biochem	18062203	China
In Vivo Imaging System	PerkinElmer	caliper IVIS lumina II	America
Ionomycin Calcium	Cayman	10004974	America
KRN7000	AdipoGen	AG-CN2-0013	America
Mouse CD1d Tetramer-PE	MBL	TS-MCD-1	Japan
Mouse percoll	Solarbio	P8620	China
Optical Microscope	Olympus	Olympus-II	Japan
PerCP-CyTM5.5 Mouse anti-ROR-ϒt	BD	562683	America
PerCP-CyTM5.5 Mouse anti-T-bet	BD	561316	America
Pertussis toxin	Sigma	P7208	America
phorbol esters	Cayman	10008014	America
Red Blood Cell Lysis Buffer	BD	555899	America
RPMI-1640	Biological Industries	01-100-1ACS	Israel
Th1/Th2/Th17 cytokines kit	BD	560485	America
Ultramicrotome	Leica	Leica EM UC6	Germany