Inmunoterapia adoptiva de células iNKT en ratones RA inducidos por glucosa-6-fosfato (G6PI)

Summary

Este protocolo utiliza péptidos mixtos G6PI para construir modelos de artritis reumatoide que están más cerca de la artritis reumatoide humana en células CD4⁺ T y citoquinas. Células T asesinas naturales invariables de alta pureza (principalmente iNKT2) con fenotipos y funciones específicas se obtuvieron mediante inducción in vivo y purificación in vitro para inmunoterapia adoptiva.

Abstract

La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad autoinmune inflamatoria crónica compleja. La patogénesis de la enfermedad está relacionada con células T (iNKT) asesinas naturales invariables. Los pacientes con AR activa presentan menos células iNKT, función celular defectuosa y polarización excesiva de Th1. En este estudio, se estableció un modelo animal de RA utilizando una mezcla de péptidos hGPI325-339 y hGPI469-483. Las células iNKT se obtuvieron por inducción in vivo y purificación in vitro, seguida de perfusión en ratones RA para inmunoterapia adoptiva. El seguimiento del sistema de imágenes in vivo (IVIS) reveló que las células iNKT se distribuyeron principalmente en el bazo y el hígado. El día 12 después de la terapia celular, la progresión de la enfermedad se desaceleró significativamente, los síntomas clínicos se aliviaron, la abundancia de células iNKT en el timo aumentó, la proporción de iNKT1 en el timo disminuyó, y los niveles de TNF-, IFN-o, y IL-6 en el suero disminuyó. La inmunoterapia adoptiva de las células iNKT restauró el equilibrio de las células inmunitarias y corrigió la inflamación excesiva del cuerpo.

Introduction

La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad autoinmune caracterizada por una invasividad crónica progresiva con incidencia de 0,5-1%^1,2. La patogénesis subyacente se atribuye a la proliferación anormal de células autoreactivas CD4⁺ y CD8⁺ T, manifestadas por un aumento en la proporción de células CD4⁺IFN-+ y CD4⁺IL-17A⁺ T, y el número reducido de células CD4⁺IL-4⁺ y CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺ T. Por lo tanto, la secreción de citoquinas inflamatorias se incrementa, y una reacción inflamatoria excesiva destruye el equilibrio nativo y la función de tolerancia del sistema inmunológico del cuerpo. Además, las células auxiliares del linfocito T (Th) 1 que penetran en la articulación agravan la respuesta inflamatoria y el daño articular. Por lo tanto, la inhibición de la respuesta inflamatoria excesiva y la restauración de la tolerancia inmune y el equilibrio inmune son clave para el tratamiento de RA^3,4.

Las celdas iNKT tienen funciones y características de células NK y células T. Las células iNKT albergan una cadena distinta e invariable de receptor de células T (TCR) con repertorios limitados de cadena TCR⁵ y reconocen el antígeno glucólido presentado por la molécula CD1d del complejo de histocompatibilidad principal (MHC) CD1d en la superficie de las células que presentan antígenos. ⁶ detectó un gran número de células iNKT y defectos funcionales en muchas enfermedades autoinmunes, incluida la AR. 7^demostraron que las células iNKT tienen un efecto positivo en el mantenimiento de la tolerancia autoinmune y que cuando se restaura el número y la función de las células iNKT, la enfermedad se alivia. Además, Miellot-Gafsou et al.⁸ encontraron que las células iNKT no sólo abrogaron la enfermedad, sino que también aumentaron la progresión de la enfermedad. Estos resultados contradictorios sugieren que las células iNKT son células T heterogéneas, y la función de diferentes subconjuntos puede revertirse. En un estudio clínico de AR, la frecuencia de las células iNKT se correlacionó con la puntuación de la actividad de la enfermedad⁹. Los resultados también confirmaron que la frecuencia de iNKT se redujo en pacientes con AR, el número de subconjuntos de células CD4⁺IFN +^T aumentó, y los niveles secretores de citoquinas inflamatorias IFN-o y TNF-o aumentaron^10,11. Además,¹² investigaron la diabetes tipo 1 (T1D) y encontraron que la infusión selectiva de células iNKT reguló la expresión de la citoquina inflamatoria IL-4, mantuvo la tolerancia inmune y presionó el desarrollo de la diabetes tipo 1. Por lo tanto, la infusión adoptiva de células iNKT específicas o la activación dirigida de células iNKT aumenta el nivel de células iNKT en pacientes con AR, lo que puede ser un avance en el tratamiento con AR.

La inmunoterapia celular es actualmente de gran interés y ha sido ampliamente utilizada en la terapia contra el cáncer. Sin embargo, las células iNKT son células inmunorreguladoras heterogéneas raras (sólo 0,3% del número total de PBMC)^13,lo que limita las posibles aplicaciones clínicas. Estas células se dividen principalmente en tres subpoblaciones: 1) células iNKT1, que tienen una alta expresión de la leucemia promielocítica proteína zinc-dedo (PLZF) y factor de transcripción T-caja (T-bet); 2) células iNKT2 con expresión intermedia de PLZF y proteína de unión GATA 3 (GATA3); 3) células iNKT17 con baja expresión de PLZF y receptor nuclear huérfano (ROR) relacionado con retinoides- que secretan IFN-, IL-4 e IL-17¹⁴. Las células iNKT activadas secretan citoquinas similares a Th1, Th2 y Th17, que determinan los diferentes efectos inmunomoduladores de las células iNKT^15. Los efectos inmunomoduladores e inmunoterapéuticos de la activación específica de varias subpoblaciones de células iNKT son diferentes. Por lo tanto, la selección de fenotipos específicos de células iNKT (principalmente iNKT2) con funciones antiinflamatorias para regular la respuesta inmune del cuerpo puede corregir el desequilibrio inmune y los trastornos inmunológicos en la AR.

El establecimiento de un modelo animal ideal es de gran importancia para el tratamiento y estudio de la patogénesis de la AR. Actualmente, los modelos animales más comúnmente utilizados y maduros incluyen artritis inducida por colágeno, artritis adyuvante, artritis inducida por cimosa, y artritis inducida por polisacáridos^16–17. Sin embargo, no hay ningún modelo que pueda simular completamente todas las características de la RA humana. La artritis inducida por colágeno tipo II (CIA) es un modelo clásico de artritis. La CIA es inducida por la inmunización de ratones con anticuerpos monoclonales específicos para colágeno tipo II, lo que refleja la dependencia de anticuerpos de este modelo de enfermedad. Describió un modelo con una respuesta inmune sistémica a la isomerasa de glucosa-6-fosfato (G6PI), que induce la poliartritis simétrica periférica en cepas de ratón susceptibles^18,19. En este modelo, el desarrollo de la artritis depende de las células T, células B, e inmunidad innata^18,19,20. Horikoshi²¹ encontró que los modelos de RA resultantes de la inmunización de ratones DBA/1 con fragmentos de polipéptidos G6PI son más similares a la RA humana en términos de células CD4⁺ T y citoquinas (es decir, IL-6 y TNF)) que los modelos de la CIA. Con el fin de aumentar el efecto estimulante en el sitio de reconocimiento TCR, los fragmentos de polipéptidos mixtos de G6PI (hGPI325-339 y hGPI469-483) se utilizaron para inmunizar ratones DBA/1 para construir el modelo de ratón RA. La tasa de éxito de este enfoque puede ser alta porque hGPI325-339 y hGPI469-483 son inmunodominantes para las respuestas de células T restringidas a Q-A. Por lo tanto, este modelo puede simular la sobreproliferación de células CD4⁺ T y defectos celulares iNKT en pacientes con AR^22. La investigación básica de la inmunopatología de la AR sentó las bases para nuestra investigación más profunda.

Protocol

Todos los ratones experimentales (150 en total) eran ratones machosanos, de 6 a 8 semanas de edad (20,0 x 1,5 g), criados en un entorno específico libre de patógenos (SPF). No hay ningún tratamiento especial antes del modelado. El experimento se dividió en un grupo de control saludable (15 ratones), un grupo de control de modelos (15 ratones) y un grupo de terapia celular (55 ratones). Este estudio fue aprobado por el Comité de Bienestar Animal y Etica de la Universidad de Hebei. 1. Constru…

Representative Results

La puntuación del índice de artritis y el grosor de la pata aumentaron después del modelado. En comparación con el grupo de control, los dedos del grupo modelo RA comenzaron a mostrar hinchazón roja a los 6 días después del modelado, con agravamiento gradual. A los 14 días, la hinchazón roja en la articulación del tobillo alcanzó su punto máximo, seguido de un alivio gradual. El grosor de la pata cambió de forma similar (P < 0.05) (Figura 1). <p class="jove_content"…

Discussion

Las células iNKT son células T especiales que unen inmunidad innata y adaptativa y se desarrollan principalmente a partir de CD4⁺⁺/ CD8⁺ timocitos. Las células iNKT tienen diversas funciones inmunorreguladoras e interactúan con otras células inmunitarias por contacto directo y secreción de diferentes citoquinas^23,afectando a las células dendríticas (CC), macrófagos, neutrófilos, células B, células T y diferenciación y desarrollo de célula…

Materials

Alexa Fluor 647 Mouse Anti-PLZF	BD	563490	America
Anti-PE MicroBeads	Miltenyi	130-048-801	Germany
Columns	Miltenyi	MS	Germany
Cryogenic Centrifuge	Beckman	Allegra® X-15R	America
DiR	Thermo Fisher Scientific	D12731	America
Embedding Center	Tianjin Aviation Electromechanical Co., Ltd.	BMJ-1	China
FITC Hamster Anti-Mouse TCR β Chain	BD	553170	America
Flow cytometer	BD	Accuri C6	America
Freund's complete adjuvant	Sigma	F5881	America
hGPI325-339 (IWYINCFGCETHAML)	Karebay Biochem	18062202	China
hGPI469-483 (EGNRPTNSIVFTKLT)	Karebay Biochem	18062203	China
In Vivo Imaging System	PerkinElmer	caliper IVIS lumina II	America
Ionomycin Calcium	Cayman	10004974	America
KRN7000	AdipoGen	AG-CN2-0013	America
Mouse CD1d Tetramer-PE	MBL	TS-MCD-1	Japan
Mouse percoll	Solarbio	P8620	China
Optical Microscope	Olympus	Olympus-II	Japan
PerCP-CyTM5.5 Mouse anti-ROR-ϒt	BD	562683	America
PerCP-CyTM5.5 Mouse anti-T-bet	BD	561316	America
Pertussis toxin	Sigma	P7208	America
phorbol esters	Cayman	10008014	America
Red Blood Cell Lysis Buffer	BD	555899	America
RPMI-1640	Biological Industries	01-100-1ACS	Israel
Th1/Th2/Th17 cytokines kit	BD	560485	America
Ultramicrotome	Leica	Leica EM UC6	Germany