חיסוני המאמצת של תאים iNKT ב גלוקוז-6-פוספט איזומראז (G6PI)-הנגרמת עכברים RA
Summary
פרוטוקול זה משתמש G6PI פפטידים מעורבים לבנות מודלים דלקת מפרקים שגרונית כי הם קרובים לזו של דלקת מפרקים שגרונית האדם ב CD4+ T תאים ציטוקינים. טוהר גבוהה קבוע הרוצח טבעי תאים T (בעיקר iNKT2) עם פנוטיפים ספציפיים פונקציות הושגו על-ידי בvivo אינדוקציה וטיהור מבחנה עבור חיסוני המאמצת.
Abstract
דלקת מפרקים שגרונית (RA) היא מחלה חיסונית כרונית מורכבת דלקתית. הפתוגנזה של המחלה קשורה הרוצח הטבעי קבוע T (iNKT) תאים. חולים עם RA פעיל מציגים פחות תאים iNKT, הפונקציה תא פגום, ו פולריזציה מוגזמת של Th1. במחקר זה, מודל בעל חיים RA הוקמה באמצעות תערובת של hGPI325-339 ו-hGPI469-483 פפטידים. התאים iNKT הושגו על ידי vivo אינדוקציה וטיהור מבחנה, ואחריו אינפוזיה לתוך עכברים RA לטיפול חיסוני המאמצת. במערכת הדמיה vivo (IVIS) מעקב חשף כי תאים iNKT הופצו בעיקר בטחול ובכבד. ביום 12 לאחר טיפול בתאים, התקדמות המחלה האט למטה באופן משמעותי, הסימפטומים הקליניים היו להקלה, שפע של תאים iNKT ב בלוטת התימוס גדל, הפרופורציה של iNKT1 ב בלוטת התימוס ירד, ואת רמות של TNF-α, IFN-γ, ו-IL-6 ב הנסיוב ירד. חיסוני המאמצת של תאים iNKT שוחזר את האיזון של תאים חיסוניים תוקן דלקת מוגזמת של הגוף.
Introduction
דלקת מפרקים שגרונית (RA) היא מחלה אוטואימונית מאופיין על ידי כרונית, החלטיות מתקדמת עם 0.5 – 1%השכיחות 1,2. הפתוגנזה הבסיסית מיוחסת התפשטות נורמלית של התאים האוטומטיים CD4+ ו CD8+ T, המתבטאת בגידול ביחס של CD4+IFN-γ+ ו CD4+il-17a+ T תאים, ואת מספר מופחת של CD4+il-4+ ו CD4+CD25 + FoxP3 + T תאים. לכן, הפרשת ציטוקינים דלקתיים מוגברת, ותגובה דלקתית מוגזמת הורסת את האיזון הטבעי ואת תפקוד הסובלנות של המערכת החיסונית של הגוף. יתר על כן, המסייע T לימפוציטים (Th) 1 תאים החודרים המפרק להחמיר את התגובה הדלקתית נזק משותף. לכן, עיכוב של תגובה דלקתית מוגזמת ושחזור של סובלנות החיסונית ואיזון החיסון הם המפתח לטיפול RA3,4.
התאים iNKT יש גם תא NK ו-T פונקציות תא ומאפיינים. התאים iNKT הנמל ברורים, קולטן תא T קבוע (TCR) α-שרשרת עם מוגבל TCR β-שרשרת repertoires5 ולהכיר את האנטיגן גליקולפיד הציג על ידי מורכבות מורכבת היסטולידית העיקריים (mhc) מולקולה cd1d ו על פני השטח של תאים אנטיגן הצגת. מיצ ואח ‘6 זיהה מספר גדול של תאים inkt ופגמים פונקציונליים במחלות אוטואימוניות רבות, כולל RA. Aurore ואח ‘7 הפגינו כי תאים inkt יש השפעה חיובית על שמירה על סובלנות אוטואימונית וכי כאשר מספר ותפקוד של תאים inkt משוחזרים, המחלה היא להקלה. בנוסף, Miellot-גסו ואח ‘8 נמצא כי תאים inkt לא רק abרוזין את המחלה אלא גם הגביר את ההתקדמות של המחלה. אלה התוצאות סותרות מראים כי תאים iNKT הם תאים T הטרוגנית, ואת הפונקציה של קבוצות מערכות שונות יכול להיות הפוך. במחקר קליני של RA, תדירות של תאים iNKT בקורלציה עם התוצאה של פעילות המחלה9. התוצאות אישרו גם כי התדירות של inkt הצטמצמה בחולים RA, מספר CD4+ifn-γ+ תא מערכות המשנה של התא גדל, ואת רמות הסוד של ציטוקינים דלקתיות ifn-γ ו-tnf-α גדל10,11. בנוסף, שריף ואח ‘12 חקר סוכרת סוג 1 (T1D) ומצא כי עירוי סלקטיבי של תאים inkt upregulated את הביטוי של cy, דלקתיות IL-4, מתוחזק סובלנות החיסונית, ומנעו את ההתפתחות של סוכרת מסוג 1. לכן, עירוי המאמצת של תאים מסוימים iNKT או הפעלה ממוקדת של תאים iNKT מגביר את רמת התאים iNKT בחולים RA, אשר יכול להיות פריצת דרך בטיפול RA.
חיסוני הסלולר הוא כעת עניין רב והיה בשימוש נרחב בטיפול בסרטן. עם זאת, תאים iNKT הם נדירים, הטרוגנית החיסונית תאים (רק 0.3% מהמספר הכולל של PBMCs)13, אשר מגביל יישומים קליניים פוטנציאליים. תאים אלה מחולקים בעיקר לשלוש אוכלוסיות משנה: 1) iNKT1 תאים, אשר יש ביטוי גבוה של פרוליקמיה לוקמיה אבץ אצבע (PLZF) ומקדם תמלול T-box (T-bet); 2) iNKT2 תאים עם ביטוי ביניים של חלבון מאגד PLZF ו-טה 3 (GATA3); 3) iNKT17 תאים בעלי ביטוי נמוך של הקולטן PLZF ו retinoid הקשורים ליתומים גרעיני (ROR)-γt להפריש IFN-γ, IL-4, ו-IL-1714. תאים iNKT הופעל להפריש Th1, Th2, ו Th17 כמו ציטוקינים, אשר קובעים את ההשפעות האימונומודולטוריים שונים של תאים iNKT15. האפקטים האימונומודולטוריים והאימונותרפיה של הפעלה ספציפית של אוכלוסיות משנה שונות של תאי iNKT שונים. לכן, הבחירה של פנוטיפים ספציפיים של תאים iNKT (בעיקר iNKT2) עם פונקציות אנטי דלקתיות כדי לווסת את התגובה החיסונית של הגוף יכול לתקן את חוסר האיזון החיסונית הפרעות החיסון RA.
הקמתה של המודל החי האידיאלי הוא משמעותי מאוד לטיפול ולחקר של הפתוגנזה RA. כיום, הדגמים הנפוצים ביותר בשימוש בעלי חיים בוגרים כוללים דלקת מפרקים הנגרמת קולגן, דלקת מפרקים, מפרקים zymosan המושרה, ודלקת מפרקים רב המושרה16–17. עם זאת, אין מודל שיכול לדמות לחלוטין את כל התכונות של RA האנושית. סוג II קולגן המושרה דלקת מפרקים (CIA) הוא מודל דלקת מפרקים קלאסית. ה-CIA נגרמת על ידי חיסון של עכברים עם סוג II הקולגן הספציפי נוגדנים חד שבטיים, המשקף את התלות הנוגדן של מודל זה מחלה. Benurs ואח ‘ תיאר מודל עם תגובה חיסונית מערכתית ל גלוקוז-6-פוספט איזומראז (G6PI), אשר משרה מערכת מפרקים סימטרית היקפית סימטרי בזנים של העכבר הרגיש18,19. במודל זה, התפתחות של דלקת מפרקים תלויה בתאי T, B תאים, וחסינות מולדת18,19,20. Horikoshi21 נמצא כי מודלים RA כתוצאה מחיסון של DBA/1 עכברים עם שברי G6PI פוליפטידים דומים יותר לאדם RA במונחים של CD4+ T תאים ציטוקינים (כלומר, IL-6 ו-tnf-α) מאשר דגמי ה-CIA. כדי להגביר את ההשפעה המעוררת על אתר הזיהוי של TCR, שברי הפוליפפטיד המעורבים של G6PI (hGPI325-339 ו-hGPI469-483) שימשו לחיסון של עכברים DBA/1 כדי לבנות את מודל העכבר RA. שיעור ההצלחה של גישה זו יכול להיות גבוה בגלל hGPI325-339 ו-hGPI469-483 הם אימונומישומיניטית עבור התגובות האלה של תא T-A-q-מוגבל. לכן, מודל זה יכול לדמות את התפשטות יתר של CD4+ T תאים ופגמים תא inkt בחולים RA22. המחקר הבסיסי של RA immunopathology הניח את הבסיס לחקירה העמוקה יותר שלנו.
Protocol
Representative Results
Discussion
תאים iNKT הם תאי T מיוחדים המגשרים חסינות מולדת ואדפטיבית מפותחים בעיקר מ CD4+/cd8+ thymocytes. תאים iNKT יש פונקציות immunoregulatory מגוונת אינטראקציה עם תאים חיסוניים אחרים על ידי מגע ישיר הפרשת ציטוקינים שונים23, המשפיעים על תאים דנדריטים (DCs), מקרופאגים, נויטרופילים, B ת…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחקר שלנו היה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (NSFC) (81771755), מכללות והמדע של האוניברסיטה וטכנולוגיה מפתח מחקר הפרויקט של מחוז חביי (ZD2017009) ואת המעבדה לבעלי חיים של ניסוי רפואי מרכז, אוניברסיטת חביי. . אנו אסירי תודה על תמיכתם
Materials
| Alexa Fluor 647 Mouse Anti-PLZF | BD | 563490 | America |
| Anti-PE MicroBeads | Miltenyi | 130-048-801 | Germany |
| Columns | Miltenyi | MS | Germany |
| Cryogenic Centrifuge | Beckman | Allegra® X-15R | America |
| DiR | Thermo Fisher Scientific | D12731 | America |
| Embedding Center | Tianjin Aviation Electromechanical Co., Ltd. | BMJ-1 | China |
| FITC Hamster Anti-Mouse TCR β Chain | BD | 553170 | America |
| Flow cytometer | BD | Accuri C6 | America |
| Freund's complete adjuvant | Sigma | F5881 | America |
| hGPI325-339 (IWYINCFGCETHAML) | Karebay Biochem | 18062202 | China |
| hGPI469-483 (EGNRPTNSIVFTKLT) | Karebay Biochem | 18062203 | China |
| In Vivo Imaging System | PerkinElmer | caliper IVIS lumina II | America |
| Ionomycin Calcium | Cayman | 10004974 | America |
| KRN7000 | AdipoGen | AG-CN2-0013 | America |
| Mouse CD1d Tetramer-PE | MBL | TS-MCD-1 | Japan |
| Mouse percoll | Solarbio | P8620 | China |
| Optical Microscope | Olympus | Olympus-II | Japan |
| PerCP-CyTM5.5 Mouse anti-ROR-ϒt | BD | 562683 | America |
| PerCP-CyTM5.5 Mouse anti-T-bet | BD | 561316 | America |
| Pertussis toxin | Sigma | P7208 | America |
| phorbol esters | Cayman | 10008014 | America |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | BD | 555899 | America |
| RPMI-1640 | Biological Industries | 01-100-1ACS | Israel |
| Th1/Th2/Th17 cytokines kit | BD | 560485 | America |
| Ultramicrotome | Leica | Leica EM UC6 | Germany |
References
- Tobón, G. J., Youinou, P., Saraux, A. The environment, geo-epidemiology, and autoimmune disease: Rheumatoid arthritis. Autoimmunity Reviews. 35 (1), 0 (2010).
- Cross, M., et al. The global burden of rheumatoid arthritis: estimates from the Global Burden of Disease 2010 study. Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (7), 1316-1322 (2014).
- Kanashiro, A., Bassi, G. S., Queiróz Cunha, F. D., Ulloa, L. From neuroimunomodulation to bioelectronic treatment of rheumatoid arthritis. Bioelectronics in Medicine. 1 (2), 151-165 (2018).
- Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions. Nature Reviews Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).
- Bianca, B. S. Unraveling Natural Killer T-Cells Development. Frontiers in Immunology. 8, 1950 (2018).
- Mitsuo, A., et al. Decreased CD161+CD8+ T cells in the peripheral blood of patients suffering from rheumatic diseases. Rheumatology. 45 (12), 1477-1484 (2006).
- Miellot, A., et al. Activation of invariant NK T cells protects against experimental rheumatoid arthritis by an IL-10-dependent pathway. European Journal of Immunology. 35 (12), 3704-3713 (2005).
- Miellot-Gafsou, A., et al. Early activation of invariant natural killer T cells in a rheumatoid arthritis model and application to disease treatment. Immunology. 130 (2), 296-306 (2010).
- Tudhope, S. J., Delwig, A. V., Falconer, J., Pratt, A., Ng, W. F. Profound invariant natural killer t-cell deficiency in inflammatory arthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 69 (10), 1873-1879 (2010).
- Ming, M., et al. Effects on immunoregulation of iNKT cells in RA by novel synthetic immunostimulator CH1b. Chinese Journal of Immunology. 32 (02), 218-222 (2016).
- Ming, M., et al. Study of the correlation between the percentage of iNKT cells and the ratio of IFN-γ/IL-4 in patients with rheumatoid arthritis. Chinese Journal of Microbiology Immunology. 35 (3), 213-218 (2015).
- Sharif, S., et al. Activation of natural killer T cells by α-galactosylceramide treatment prevents the onset and recurrence of autoimmune Type 1 diabetes. Nature Medicine. 7, 1057-1062 (2010).
- Gapin, L. Development of invariant natural killer T cells. Current Opinion in Immunology. 39, 68-74 (2016).
- Kwon, D. I., Lee, Y. J. Lineage Differentiation Program of Invariant Natural Killer T Cells. Immune Network. 17 (6), (2017).
- Thapa, P., et al. The differentiation of ROR-γt expressing iNKT17 cells is orchestrated by Runx1. Scientific Reports. 7 (1), 7018 (2017).
- Schurgers, E., Billiau, A., Matthys, P. Collagen-induced arthritis as an animal model for rheumatoid arthritis: focuson interferon-γ. Interferon Cytokine Research. 31 (12), 917-926 (2011).
- Van Haalen, H. G. M., Severens, J. L., Tran-Duy, A., Boonen, A. How cost-effectiveness A systematic review and stepwise approach for selecting a transferable health economic evaluation rheumatoid arthritis. Pharmacoeconomics. 32 (5), 429-442 (2014).
- Schubert, D., Maier, B., Morawietz, L., Krenn, V., Kamradt, T. Immunization with glucose-6-phosphate isomerase induces T cell-dependent peripheral polyarthritis in genetically unaltered mice. Journal of Immunology. 172, 4503-4509 (2004).
- Bockermann, R., Schubert, D., Kamradt, T., Holmdahl, R. Induction of a B-cell-dependent chronic arthritis with glucose-6-phosphate isomerase. Arthritis Research, Therapy. 7, 131613-131624 (2005).
- Kamradt, T., Schubert, D. The role and clinical implications of G6PI in experimental models of rheumatoid arthritis. Arthritis Research, Therapy. 7, 20-28 (2005).
- Horikoshi, M., et al. Activation of Invariant NKT Cells with Glycolipid Ligand α-Galactosylceramide Ameliorates Glucose-6-Phosphate Isomerase Peptide-Induced Arthritis. PlosOne. 7 (12), 51215 (2012).
- Zhang, X. J., et al. Immunization with mixed peptides derived from glucose-6-phosphate isomerase induces rheumatoid arthritis in DBA /1 mice. Chinese Journal of Pathophysiology. 32 (3), 569-576 (2016).
- Motohashi, S., Nakayama, T. Invariant natural killer T cell-based immunotherapy for cancer. Immunotherapy. 1 (1), 73 (2017).
- Jung, S., et al. The requirement of natural killer T-cells in tolerogenic APCs-mediated suppression of collagen-induced arthritis. Experimental and Molecular Medicine. 42 (8), 547-554 (2010).
- Luc, V. K., Lan, W. Therapeutic Potential of Invariant Natural Killer T Cells in Autoimmunity. Frontiers in Immunology. 9, 519-526 (2018).
- Chiba, A., et al. Suppression of collagen-induced arthritis by natural killer T cell activation with OCH, a sphingosine-truncated analog of α-galactosylceramide. Arthritis, Rheumatism. 50 (1), 305-313 (2004).
- Tudhope, S. J., Delwig, A. V., Falconer, J., Pratt, A., Ng, W. F. Profound invariant natural killer t-cell deficiency in inflammatory arthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 69 (10), 1873-1879 (2010).
- Bruns, L., et al. Immunization with an immunodominant self-peptide derived from glucose-6-phosphate isomerase induces arthritis in DBA/1 mice. Arthritis Research, Therapy. 11 (4), (2009).
- Parietti, V., et al. Rituximab treatment overcomes reduction of regulatory iNKT cells in patients with rheumatoid arthritis. Clinical Immunology. 134 (3), 331-339 (2010).
- Yoshida, Y., et al. Functional mechanism(s) of the inhibition of disease progression by combination treatment with fingolimod plus pathogenic antigen in a glucose-6-phosphate isomerase peptide-induced arthritis mouse model. Biological, Pharmaceutical Bulletin. 38 (8), 1120-1125 (2015).
- Chen, D., et al. Study of the adoptive immunotherapy on rheumatoid arthritis with Thymus-derived invariant natural killer T cells. International Immunopharmacology. 67, 427-440 (2019).
