Immunoterapia adottiva delle cellule iNKT in isomerasi indotta da glucosio (G6PI)

Summary

Questo protocollo utilizza peptidi misti G6PI per costruire modelli di artrite reumatoide che sono più vicini a quello dell’artrite reumatoide umana in CD4^– cellule T e citochine. Cellule T killer naturali ad alta purezza (principalmente iNKT2) con fenotipi e funzioni specifiche sono state ottenute mediante induzione e purificazione in vitro per l’immunoterapia adottiva.

Abstract

L’artrite reumatoide (RA) è una malattia autoimmune infiammatoria cronica complessa. La patogenesi della malattia è correlata alle cellule T (iNKT) killer naturali invarianti. I pazienti con RA attiva presentano meno cellule iNKT, funzione cellulare difettosa e polarizzazione eccessiva di Th1. In questo studio, è stato stabilito un modello animale RA utilizzando una miscela di peptidi hGPI325-339 e hGPI469-483. Le cellule iNKT sono state ottenute mediante induzione e purificazione in vitro, seguite da infusione nei topi RA per immunoterapia adottiva. Il monitoraggio del sistema di imaging in vivo (IVIS) ha rivelato che le cellule iNKT sono state distribuite principalmente nella milza e nel fegato. Il giorno 12 dopo la terapia cellulare, la progressione della malattia ha rallentato in modo significativo, i sintomi clinici sono stati alleviati, l’abbondanza di cellule iNKT nel timo è aumentata, la proporzione di iNKT1 nel timo è diminuita e i livelli di TNF-z, IFN-e IL-6 in il siero è diminuito. L’immunoterapia adottiva delle cellule iNKT ha ripristinato l’equilibrio delle cellule immunitarie e corretto l’eccessiva infiammazione del corpo.

Introduction

L’artrite reumatoide (RA) è una malattia autoimmune caratterizzata da invasività cronica e progressiva con incidenza dello 0,5-1%^1,2. La patogenesi di fondo è attribuita alla proliferazione anomala di cellule^CD4 autoattive e CD8^, manifestata da un aumento della proporzione di cellule^{T cd4}, IFN-e^CD4, IL-17A, e al numero ridotto di cellule T^CD4– IL-4^{e CD4}– CD25 – FoxP3 . Pertanto, la secrezione di citochine infiammatorie è aumentata e una reazione infiammatoria eccessiva distrugge l’equilibrio nativo e la funzione di tolleranza del sistema immunitario del corpo. Inoltre, le cellule helper del linfocito T (Th) 1 che penetrano nell’articolazione aggravano la risposta infiammatoria e i danni articolari. Pertanto, l’inibizione dell’eccessiva risposta infiammatoria e il ripristino della tolleranza immunitaria e dell’equilibrio immunitario sono fondamentali per il trattamento dell’RA^3,4.

Le celle iNKT hanno funzioni e caratteristiche sia della cellula NK che di cellule T. Le cellule iNKT ospitano una catena di z distinta e invarianti con repertori a catena TCR^{limitati 5} e riconoscono l’antigene glicolipido presentato dalla principale molecola CD1d del complesso di istocompatibilità (MHC) sulla superficie delle cellule che presentano l’antigene. Mitsuo et al.⁶ ha rilevato un gran numero di cellule iNKT e difetti funzionali in molte malattie autoimmuni, tra cui ra. Aurore et al.⁷ ha dimostrato che le cellule iNKT hanno un effetto positivo sul mantenimento della tolleranza autoimmune e che quando il numero e la funzione delle cellule iNKT vengono ripristinate, la malattia viene alleviata. Inoltre, Miellot-Gafsou et al.⁸ ha scoperto che le cellule iNKT non solo abrogavano la malattia, ma aumentavano anche la progressione della malattia. Questi risultati contraddittori suggeriscono che le cellule iNKT sono cellule T eterogenee e la funzione di diversi sottoinsiemi può essere invertita. In uno studio clinico di RA, la frequenza delle cellule iNKT è correlata al punteggio dell’attività della malattia⁹. I risultati hanno anche confermato che la frequenza di iNKT è stata diminuita nei pazienti affetti da rappare, il numero di sottoinsiemi di cellule T^CD4– IFN-z-^s è aumentato, e i livelli secretorici di citochine infiammatorie IFN-e TNF-aumentati di^10,11. Inoltre, Sharif et al.¹² ha studiato il diabete di tipo 1 (T1D) e ha scoperto che l’infusione selettiva di cellule iNKT regolava l’espressione della citochina infiammatoria IL-4, manteneva la tolleranza immunitaria e impediva lo sviluppo del diabete di tipo 1. Pertanto, l’infusione adottiva di specifiche cellule iNKT o l’attivazione mirata di cellule iNKT aumenta il livello delle cellule iNKT nei pazienti affetti da RA, che può essere una svolta nel trattamento dell’AR.

L’immunoterapia cellulare è attualmente di grande interesse ed è stata ampiamente utilizzata nella terapia del cancro. Tuttavia, le cellule iNKT sono cellule immunoregolatorie rare ed eterogenee (solo lo 0,3% del numero totale di PBMC)¹³, il che limita le potenziali applicazioni cliniche. Queste cellule sono principalmente suddivise in tre sottopopolazioni: 1) cellule iNKT1, che hanno un’alta espressione di proteina leucemia promielocitica zinco-dita (PL-F) e fattore di trascrizione T-box (T-bet); 2) cellule iNKT2 con espressione intermedia della proteina legante PL-F e GATA 3 (GATA3); 3) cellule iNKT17 con bassa espressione di PL-F e recettore orfano legato ai retinoidi (ROR) – che secernono IFN-z, IL-4, e IL-17¹⁴. Le cellule iNKT attivate secernono Th1, Th2 e Th17-come citochine, che determinano i diversi effetti immunomodulatori delle cellule iNKT¹⁵. Gli effetti immunomodulatori e immunoterapeutici dell’attivazione specifica di varie sottopopolazioni di cellule iNKT sono diversi. Pertanto, la selezione di fenotipi specifici delle cellule iNKT (principalmente iNKT2) con funzioni antinfiammatorie per regolare la risposta immunitaria del corpo può correggere lo squilibrio immunitario e i disturbi immunitari nell’AR.

L’istituzione di un modello animale ideale è di grande importanza per il trattamento e lo studio della patogenesi ra. Attualmente, i modelli animali più comunemente utilizzati e maturi includono artrite indotta dal collagene, artrite adiuvante, artrite indotta da zymiosan e artrite indotta dal polisaccoro^16–17. Tuttavia, non esiste un modello in grado di simulare completamente tutte le caratteristiche dell’AR umana. L’artrite indotta dal collagene di tipo II (CIA) è un modello classico di artrite. La CIA è indotta dall’immunizzazione dei topi con anticorpi monoclonali specifici del collagene di tipo II, che riflettono la dipendenza da anticorpi di questo modello di malattia. Benurs et al. ha descritto un modello con una risposta immunitaria sistemica all’isomerassia del glucosio-6-fosfato (G6PI), che induce la poliartrite simmetrica periferica nei ceppi di topo sensibili^18,19. In questo modello, lo sviluppo dell’artrite dipende dalle cellule T, cellule B e dall’immunità innata^18,19,20. Horikoshi²¹ ha scoperto che i modelli RA risultanti dall’immunizzazione dei topi DBA/1 con frammenti di polipeptide G6PI sono più simili all’AR umana in termini di CD4^– cellule T e citochine (cioè IL-6 e TNF-z) rispetto ai modelli della CIA. Al fine di aumentare l’effetto stimolante sul sito di riconoscimento TCR, i frammenti misti di polipeptide di G6PI (hGPI325-339 e hGPI469-483) sono stati utilizzati per immunizzare i topi DBA/1 per costruire il modello murino RA. Il tasso di successo di questo approccio può essere elevato perché hGPI325-339 e hGPI469-483 sono immunodominanti per le risposte delle cellule T con restrizioni I-A q. Pertanto, questo modello può simulare la proliferazione di CD4^– cellule T e difetti cellulari iNKT nei pazienti RA²². La ricerca di base dell’immunopatologia dell’AR ha gettato le basi per la nostra ulteriore indagine approfondita.

Protocol

Tutti i topi sperimentali (150 in totale) erano maschi sani di tipo DBA/1 topi, di 6-8 settimane (20,0 x 1,5 g), allevati in uno specifico ambiente privo di agenti patogeni (SPF). Non esiste un trattamento speciale prima della modellazione. L’esperimento è stato diviso in un gruppo di controllo sano (15 topi), un gruppo di controllo del modello (15 topi) e un gruppo di terapia cellulare (55 topi). Questo studio è stato approvato dall’Animal Welfare and Ethical Committee dell’Università di Hebei. <p class="jove_tit…

Representative Results

Il punteggio dell’indice di artrite e lo spessore della zampa sono aumentati dopo la modellazione. Rispetto al gruppo di controllo, le dite del gruppo di modelli RA hanno cominciato a mostrare gonfiore rosso a 6 giorni dopo la modellazione, con graduale aggravamento. A 14 giorni, il gonfiore rosso nell’articolazione della caviglia ha raggiunto il picco, seguito da un graduale sollievo. Lo spessore della zampa è cambiato in modo analogo (P < 0,05) (Figura 1). <p class="jove_cont…

Discussion

Le cellule iNKT sono cellule T speciali che colmano l’immunità innata e adattiva e sono sviluppate principalmente a partire da^CD4/CD8^e timociti. Le cellule iNKT hanno diverse funzioni immunoregolatorie e interagiscono con altre cellule immunitarie per contatto diretto e secrezione di diverse citochine²³, che interessano le cellule dendritiche (DC), macrofagi, neutrofili, cellule B, cellule T e differenziazione e sviluppo delle cellule NK<sup class="xr…

Materials

Alexa Fluor 647 Mouse Anti-PLZF	BD	563490	America
Anti-PE MicroBeads	Miltenyi	130-048-801	Germany
Columns	Miltenyi	MS	Germany
Cryogenic Centrifuge	Beckman	Allegra® X-15R	America
DiR	Thermo Fisher Scientific	D12731	America
Embedding Center	Tianjin Aviation Electromechanical Co., Ltd.	BMJ-1	China
FITC Hamster Anti-Mouse TCR β Chain	BD	553170	America
Flow cytometer	BD	Accuri C6	America
Freund's complete adjuvant	Sigma	F5881	America
hGPI325-339 (IWYINCFGCETHAML)	Karebay Biochem	18062202	China
hGPI469-483 (EGNRPTNSIVFTKLT)	Karebay Biochem	18062203	China
In Vivo Imaging System	PerkinElmer	caliper IVIS lumina II	America
Ionomycin Calcium	Cayman	10004974	America
KRN7000	AdipoGen	AG-CN2-0013	America
Mouse CD1d Tetramer-PE	MBL	TS-MCD-1	Japan
Mouse percoll	Solarbio	P8620	China
Optical Microscope	Olympus	Olympus-II	Japan
PerCP-CyTM5.5 Mouse anti-ROR-ϒt	BD	562683	America
PerCP-CyTM5.5 Mouse anti-T-bet	BD	561316	America
Pertussis toxin	Sigma	P7208	America
phorbol esters	Cayman	10008014	America
Red Blood Cell Lysis Buffer	BD	555899	America
RPMI-1640	Biological Industries	01-100-1ACS	Israel
Th1/Th2/Th17 cytokines kit	BD	560485	America
Ultramicrotome	Leica	Leica EM UC6	Germany