Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Preparación de muestras biológicas para la especiación a temperatura criogénica mediante espectroscopia de absorción de rayos X de alta resolución

Published: May 27, 2022 doi: 10.3791/60849
Automatic Translation
1, 2, 3, 4,5, 4,5, 4,5, 1,6
1University Grenoble Alpes, INSERM UA7, Synchrotron Radiation for Biomedicine (STROBE), 2CNRS, UMR 5254, Université Pau & Pays Adour, E2S UPPA, Institut des Sciences Analytiques et de Physicochimie pour l'Environnement et les Matériaux, 3Institut Jacques Monod, UMR 7592 CNRS, Université Paris Diderot, 4OSUG, UMS 832 CNRS, Université Grenoble Alpes, 5FAME and FAME-UHD beamlines, ESRF, the European Synchrotron, 6ID16A beamline, ESRF, the European Synchrotron

Summary

Este protocolo presenta un procedimiento detallado para preparar criomuestras biológicas para experimentos de espectroscopia de absorción de rayos X basados en sincrotrón. Describimos todos los pasos necesarios para optimizar la preparación y criopreservación de muestras con ejemplos del protocolo con células de cáncer y fitoplancton. Este método proporciona un estándar universal de criopreparación de muestras.

Abstract

El estudio de elementos con espectroscopia de absorción de rayos X (XAS) es de particular interés cuando se estudia el papel de los metales en los sistemas biológicos. La preparación de muestras es un procedimiento clave y a menudo complejo, particularmente para muestras biológicas. Aunque las técnicas de especiación de rayos X son ampliamente utilizadas, aún no se ha difundido ningún protocolo detallado para los usuarios de la técnica. Además, la modificación del estado químico es motivo de preocupación, y se recomiendan técnicas basadas en crioterapia para analizar las muestras biológicas en su estado hidratado casi nativo para proporcionar la máxima preservación de la integridad química de las células o tejidos. Aquí, proponemos un protocolo de preparación celular basado en muestras criopreservadas. Se demuestra en un estudio de espectroscopia de absorción de rayos X de alta resolución de fluorescencia detectada de selenio en células cancerosas y un estudio de hierro en fitoplancton. Este protocolo se puede utilizar con otras muestras biológicas y otras técnicas de rayos X que pueden dañarse por irradiación.

Introduction

El estudio de las biotransformaciones celulares de elementos esenciales o tóxicos requiere técnicas de especiación con alta sensibilidad y debe minimizar los pasos de preparación de muestras que a menudo son propensos a la modificación de especies químicas.

Se sabe que los elementos fisiológicos como el selenio y el hierro son particularmente difíciles de especificar debido a su química compleja, varias estabilidades de las especies de selenio o hierro, y su baja concentración en el rango de ppm (mg / kg) o incluso sub-ppm. Por lo tanto, el estudio de la especiación de estos elementos por XAS puede ser extremadamente desafiante. El sincrotrón XAS y especialmente la fluorescencia de alta resolución de energía detectada XAS (HERFD-XAS), que permite una relación señal-fondo muy baja1, están disponibles en fuentes de sincrotrón para especiar elementos altamente diluidos en matrices biológicas complejas 2,3. Las mediciones convencionales de fluorescencia-XAS se pueden realizar utilizando un detector de estado sólido (SSD) de energía resuelta con un ancho de banda de energía ~ 150–250 eV, en la línea de haz CRG-FAME en la Instalación Europea de Radiación Sincrotrón (ESRF)4, mientras que las mediciones HERFD-XAS necesitan un espectrómetro analizador de cristal (CAS), con un ancho de banda de energía ~ 1–3 eV, en la línea de haz CRG-FAME-UHD en el ESRF2 . Los fotones de fluorescencia son discriminados con respecto a su energía con procesos electrónicos u ópticos respectivamente.

La criopreparación de la muestra es esencial para preservar las estructuras y mantener la integridad química de la composición, lo que permite un análisis cercano al estado biológico nativo5. Además, los análisis realizados a temperaturas criogénicas tan bajas como 10 K utilizando enfriamiento criogénico de helio líquido (LN2), permiten que el daño por radiación disminuya la velocidad y preserve la especiación elemental para XAS. Aunque algunas revisiones sobre técnicas XAS aplicadas a muestras biológicas informan de la necesidad de preparar y analizar muestras en condiciones criogénicas (por ejemplo, Sarret et al.6, Porcaro et al.7), ninguna de ellas describe claramente el protocolo detallado relacionado. En esta publicación, se describe un método para la criopreparación de células cancerosas y microorganismos de plancton para la especiación HERFD-XAS de Se8 y Fe9 a temperatura criogénica.

Las buenas prácticas para la preparación de muestras y el entorno durante las mediciones de espectroscopia XAS de última generación requieren 1) una configuración; 2) un procedimiento de análisis que limite al máximo los efectos del daño por radiación; y 3) una muestra (o referencia de compuesto modelo) lo más homogénea posible con respecto al tamaño del haz de fotones de rayos X. El primer elemento se tiene en cuenta realizando la adquisición a baja temperatura, utilizando un criostato de helio líquido. El segundo ítem se trata realizando cada adquisición en una zona fresca de la muestra moviéndola con respecto a la viga. Finalmente, considerando la tercera condición, las muestras (pellets) y las referencias (polvos) se acondicionan en pellets prensados a granel para limitar al máximo las porosidades e inhomogeneidades, y para evitar la rugosidad con respecto al tamaño del haz en la superficie de la muestra sonda de rayos X. Explicamos cómo el protocolo trata todos estos puntos.

Utilizamos la línea celular de próstata humana PC-3 (alto potencial metastásico) y la línea celular ovárica OVCAR-3 (que representa hasta el 70% de todos los casos de cáncer de ovario) para investigar las propiedades antiproliferativas hacia las células cancerosas de las nanopartículas de selenio (Se-NPs), y la diatomea Phaeodactylum tricornutum como especie modelo para investigar el secuestro de hierro en fitoplancton.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Preparación de los gránulos de células cancerosas PC-3 y OVCAR-3 humanas para la especiación de selenio

NOTA: El siguiente protocolo está adaptado de Weekley et al.10. Todos los pasos deben llevarse a cabo bajo una capucha de cultivo celular bajo condiciones y restricciones de nivel de bioseguridad 2, utilizando técnicas asépticas.

  1. Cuente las células usando una cámara de conteo de células de Malassez. Sembrar 150.000-200.000 células por matraz para la línea celular PC-3 y 300.000 células para la línea celular OVCAR-3.
  2. Células de semilla en matraces T-75 (tres matraces por condición para tener triplicados) en los medios de cultivo celular adecuados (Tabla 1) debajo de la campana de flujo laminar.
  3. Dejar que los cultivos celulares crezcan en una incubadora a 37 °C y en una atmósfera humidificada con un 5% de CO2 hasta que alcancen el 80% de confluencia. Por lo general, las líneas celulares de cáncer de próstata PC-3 se duplican después de 24 h, mientras que las líneas celulares de cáncer de ovario OVCAR-3 tardan 72 h. Los matraces deben dejarse en la incubadora.
  4. Mientras tanto, diluya los Se-NP utilizados para el tratamiento a una concentración final que corresponda al IC20 (concentración inhibitoria para lograr un 20% de muerte celular) que ha sido predeterminado por el ensayo MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro) para la evaluación de la citotoxicidad. Estas concentraciones son específicas para cada tipo de Se-NP, pero también específicas para la línea celular estudiada.
    1. Coloque la solución madre de nanopartículas (2 mg/ml de albúmina sérica bovina [BSA] o Se-NPs recubiertas de quitosano) en un baño de agua de ultrasonido durante 30 min a temperatura ambiente (RT).
    2. Diluir la solución de Se-NP mediante diluciones en serie en medio de cultivo celular completo para alcanzar concentraciones de trabajo. Entre cada dilución, vórtice durante 1 min.
  5. Prepare un control positivo de selenio con sal de selenio diluida para el tratamiento.
    1. Preparar una solución acuosa de selenito de sodio (1 mg/ml) en un tubo de polipropileno de 15 ml. Mezcle 1 mg de polvo de selenito de sodio con 1 ml de agua ultrapura.
    2. Vórtice la solución madre durante 1 min.
    3. Diluya la solución madre de selenito de sodio mediante diluciones en serie en medio de cultivo celular completo para alcanzar concentraciones de trabajo.
      NOTA: No olvide pipetear varias veces antes de cada dilución para homogeneizar la solución.
  6. Exponer las células cancerosas a tratamientos con selenio.
    NOTA: Esta parte del protocolo debe repetirse para cada nanopartícula (NP) probada. Aquí, los NP son de dos tipos, BSA y Se-NP recubiertos de quitosano, más los controles. La solución de selenito de sodio es el control positivo y ningún tratamiento es el control negativo.
    1. Abra los tres matraces T-75 que contienen las celdas de la campana de flujo laminar.
    2. Retire el medio y lave las células suavemente 2 veces con 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) calentada (37 °C).
    3. Suavemente, en la parte inferior del matraz y no directamente en la capa celular, agregue 15 ml del tratamiento en cada matraz utilizando una pipeta automática equipada con pipetas de plástico estéril de 25 ml. Coloque las tapas en los matraces. No cierre bien las tapas.
      NOTA: Como se describe en los pasos 1.3 y 1.4, las soluciones de tratamiento deben haber sido resuspendidas de antemano para ser homogeneizadas.
    4. Deje los tres matraces horizontalmente en una incubadora a 37 °C y una atmósfera humidificada con 5% de CO2 durante 24 h.
  7. Preparación de los pellets celulares
    1. Lave suavemente las células 2 veces con 5 ml de PBS calentado (37 °C) directamente en los matraces T75.
    2. Añadir 6 ml de medio de cultivo celular calentado (37 °C) en la capa celular del matraz T-75 utilizando un pipeteo equipado con pipetas de plástico estéril de 10 ml.
    3. Recoja las células mediante un raspado suave con un raspador de células. Utilice un raspador de celdas por matraz.
    4. Usando un pipeta y una pipeta de 10 ml, aspire el líquido y enjuague la celda / medio en la superficie del matraz para recolectar todas las células. Repita este paso varias veces para disociar e individualizar las células. Recoger el medio que contiene las células en un tubo de polipropileno de 15 ml.
    5. Girar hacia abajo a 250 x g durante 5 min en RT. Aspirar el sobrenadante.
    6. Enjuague las células resuspiéndolas en 5 ml de PBS.
    7. Gire hacia abajo a 250 x g durante 5 min en RT. Aspire el sobrenadante y repita los pasos 1.6.5 y 1.6.6 2x para deshacerse de todos los rastros restantes del tratamiento.
    8. Resuspend las células en 1 mL de PBS y transfiéralas a un tubo de polipropileno de 1,5 mL. Finalmente, hágalos girar a 250 x g durante 5 min en RT. La Figura 1 representa el pellet celular obtenido después de centrifugar y desechar el sobrenadante.
    9. Retire suavemente todo el sobrenadante PBS con una pipeta de 200 μL.
      NOTA: Tenga cuidado de no tocar y dañar el pellet celular. Idealmente, el pellet debe tener 2–3 mm de alto o grosor, con un diámetro de 3–6 mm. Para la línea celular PC-3, se requieren 9 x 106–10 x 106 celdas para el ensayo. Para la línea celular OVCAR-3, se requieren 8 x 106–9 x 106 celdas (Figura 1). Es probable que algunas células se pierdan durante los pasos posteriores de enjuague tampón. Cuanto mayor sea el número de células, mejor será el pellet.
  8. Congelación instantánea de los gránulos celulares
    1. Sumerja la parte inferior del tubo de 1,5 ml que contiene el pellet en nitrógeno líquido (LN2) al nivel del pellet celular.
    2. En una guantera completamente purgada con una atmósfera inerte como el gas nitrógeno, recoja el gránulo de la celda golpeando suavemente el tubo de 1,5 ml en la superficie plana de un bloque de cobre refrigerado porLN 2 (Figura 2). El pellet se recoge sin pérdida celular.
      NOTA: Use equipo de crioprotección, bata de laboratorio, zapatos cerrados, guantes criogénicos y un protector facial o gafas de seguridad para el manejo de LN2 .
    3. Si es necesario, se puede usar una aguja refrigerada LN2 para ayudar a extraer el pellet.
      NOTA: El pellet de célula congelada resultante puede fragmentarse. Estos pasos deben realizarse en el espacio de unos pocos minutos y dependen de la destreza y la velocidad del investigador.
    4. Las dimensiones del pellet congelado deben ajustarse al soporte de la muestra de criostato. Utilizando el equipo descrito, si el pellet de celda es mayor de 2 mm de altura y ligeramente más pequeño que el orificio del portamuestras utilizado para XAS, la muestra se puede usar directamente. De lo contrario, o si se desea una superficie plana para el análisis, se debe preparar un pellet cilíndrico a granel, manteniendo el pellet en su estado congelado. Si el pellet celular está fragmentado, los siguientes pasos se pueden usar idealmente en una guantera completamente purgada con una atmósfera inerte.
  9. Preparación de los pellets cilíndricos congelados a granel
    1. Sumergir todas las partes de una prensa hidráulica manual que estará en contacto con la muestra en LN2 (Figura 3A; troqueles de pellets de 3 o 5 mm de diámetro, molde, tracción de pistón/alambre).
    2. Transfiera los fragmentos de pellets rápidamente congelados al molde cargado con las matrices de pellets apropiadas (Figura 3B).
    3. Peletización rápida con la prensa hidráulica. El uso de 1,5 toneladas para un pellet de 5 mm de diámetro o 0,5 toneladas para un pellet de 3 mm de diámetro es suficiente (Figura 3C).
      NOTA: Después de cada preparación de pellets con la prensa hidráulica, todos los materiales deben descongelarse y secarse adecuadamente utilizando gas nitrógeno para evitar cualquier problema con las heladas y la humedad restantes.
    4. Recoja el pellet a granel de células congeladas rápidamente y colóquelo en un criotubo adecuado para su almacenamiento.
    5. Guárdelo de nuevo en el tanque LN2 para su almacenamiento a largo plazo.
    6. Transfiera y monte los crio-pellets para su análisis. El pellet almacenado en un criotubo refrigerado LN2 se transfiere a un soporte de muestra de criostato preenfriado de 77 K en líquido N2 (Figura 4, como se usa para una línea de haz CRG-FAME-UHD). Este paso debe realizarse lo más rápido posible, pero puede tardar unos minutos. Luego transfiera el soporte de la muestra al criostato y manténgalo a 10 K durante todo el análisis XAS.
      NOTA: Los pasos 1.9.3 y 1.9.6 son difíciles porque deben hacerse rápidamente para evitar cualquier formación de escarcha que bloquee el pistón y el molde. Una alternativa es realizar estos pasos bajo una carpa de plástico totalmente purgada con gas nitrógeno. La masa de cobre LN2-cool permite que el pellet se mantenga congelado.

2. Preparación de las células de plancton para la especiación del hierro

NOTA: El agua de mar sintética utilizada para este protocolo se preparó agregando sales marinas de agua ultrapura, ácido morfolino propanosulfónico, nitrato de amonio, nitrato de sodio, metasilicato de sodio pentahidratado, fosfato de sodio monobásico, stock de vitaminas, stock de metales traza, stock de antibióticos y tampón HEPES a pH = 7.9. Las concentraciones de cada componente se indican en la Tabla de Materiales. Los detalles sobre la cultura se pueden encontrar en Sutak et al.11

  1. Centrifugar un cultivo de diatomeas de P. tricornutum en un tubo de polipropileno de 50 ml a 1.100 x g durante 6 min y transferir el pellet a un matraz con medio fresco.
  2. Deje que el cultivo crezca en agua de mar sintética en una cámara de crecimiento durante 24 h.
  3. Centrifugar el cultivo de plancton durante 6 min a 1.100 x g y transferir el pellet a un medio fresco que contenga fe-citrato (1 μM en el cultivo final). Incubar durante 72 h.
  4. Preparar las células de plancton
    1. Centrifugar las células durante 3 min a 1.100 x g y enjuagar con medio sin hierro.
    2. Transfiera el pellet a un tubo de polipropileno de 1,5 ml, lave con agua ultrapura y centrífuga 2x durante 3 min a 1.100 x g. Retire el sobrenadante.
    3. Sumerja la parte inferior del tubo de polipropileno de 1,5 ml que contiene el pellet en LN2 como se describe en el paso 1.8.
    4. Transfiera las células congeladas en un moldeador congelado LN2 y presione rápidamente con una prensa de pellets XRF (Figura 3 y Figura 7) como se describe en el paso 1.9.
    5. Retire el pellet y guárdelo en un tanque LN2 para su almacenamiento a largo plazo.
    6. Siga el paso 1.9.6 (consulte la Figura 4 para la transferencia al portamuestras de criostato).

3. Preparación y medición de compuestos de referencia

NOTA: Los compuestos de referencia (sólidos o líquidos) representativos de la especie y que se espera que se encuentren en el sistema biológico deben ser preparados y analizados por XAS para su comparación con muestras biológicas experimentales. Los espectros de referencia también se pueden encontrar en las bases de datos 12,13,14 y se pueden utilizar siempre que las condiciones de medición (por ejemplo, resolución espectral) fueran similares a las muestras experimentales.

  1. Para referencias en solución acuosa, pesar los compuestos iniciales en polvo o líquido en condiciones anaeróbicas o atmósfera inerte. Preparar referencias sensibles a los redox en una atmósfera inerte (es decir, en una guantera anaeróbica o en una línea schlenk, ver Figura 5 y Figura 6) para evitar cualquier reacción oxido-reductora y preservar la integridad química del compuesto, que puede ser altamente reactivo e inestable en el aire ambiente). Aquí, todas las referencias de selenio se prepararon utilizando una línea schlenk y agua ultrapura desgasificada (Figura 6). El feIII-malato líquido y la ferritina se prepararon al aire ambiente.
  2. Mezclar con la solución adecuada para alcanzar una concentración final del 1% en peso del elemento estudiado (es decir, selenio o hierro) para su recolección en modo de fluorescencia.
    NOTA: El agua ultrapura es la solución más utilizada para preparar referencias XAS. Se requiere la adición de glicerol (15%-20%) para los líquidos medidos utilizando la fluorescencia XAS estándar para evitar artefactos que surjan de la difracción de rayos X por cristales de hielo y preservar la calidad de la señal XAS recolectada con el detector de estado sólido. Sin embargo, para HERFD-XAS, el glicerol no es obligatorio. Utilizando un espectrómetro analizador de cristales en lugar de un detector de estado sólido, la energía se selecciona con una resolución extremadamente alta y la difracción inducida por los cristales de hielo no afecta la recopilación de datos del elementoestudiado 1.
  3. Conservar y almacenar la solución preparada en un globo de Schlenk sellado (Figura 5) o en un tubo de polipropileno de 1,5 ml hasta su medición en las mismas condiciones que las muestras.
  4. Para referencias sólidas, pesar los polvos compuestos modelo de selenio o hierro al aire ambiente o en una guantera si las especies son sensibles a los redox. Aquí, las referencias sólidas de FeII (acetato de FeII y vivianita) se prepararon en una guantera gaseosa N2 , mientras que FeIII (Fe(OH)3 y FeIII-fosfato) se prepararon al aire ambiente.
  5. Pesar el polvo de nitruro de boro de alta pureza y mezclar con los polvos de compuestos modelo para alcanzar una concentración final del 1% en peso del elemento estudiado (Figura 7A).
  6. Moler a un polvo fino usando un mortero durante al menos 15 min.
  7. Coloque la mezcla de polvo en el moldeador para preparar pellets con la prensa hidráulica (Figura 7B, similar a la Figura 3A para el pellet de muestra).
  8. Cierre el moldeador con el pistón (Figura 7C, similar a la Figura 3B para el pellet de muestra).
  9. Presione para obtener el pellet a granel (Figura 7D, similar a la Figura 3C para el pellet de muestra).
  10. Guarde los gránulos a granel preparados en la guantera hasta que se analicen en las mismas condiciones que las muestras.
    NOTA: El pellet a granel a veces se adhiere a los pistones, dependiendo de la compacidad del polvo, por ejemplo. Quitarlo suavemente sin romperlo entonces puede ser difícil. En ese caso, se debe utilizar el siguiente procedimiento utilizando discos de poliimida (por ejemplo, Kapton).
  11. Coloque una gota de etanol a cada lado de los pistones que estarán en contacto con el polvo (Figura 8A).
  12. Prepare dos discos de poliimida con un diámetro ligeramente menor que los pistones. El espesor de la poliimida debe ser de 10 a 25 μm (el más delgado será difícil de manipular, más grueso absorberá demasiado de los fotones de rayos X durante el análisis).
  13. Coloque los discos en los pistones. Se pegarán por acción capilar (Figura 8B).
  14. Monte el moldeador con el pistón, agregue el polvo y coloque el segundo pistón (Figura 8C).
  15. Pulse (consulte el paso 3.11) y retire el pellet comprimido a granel de los pistones.
    NOTA: Las referencias sólidas se pueden montar en el soporte de muestra específico del criostato como las muestras (consulte el paso 1.8.6). Las referencias líquidas se pueden montar en el portamuestras específico del criostato. Consulte la Figura 9A para un soporte de muestra de criostato CRG-FAME. El mismo procedimiento se puede aplicar utilizando un soporte de muestra CRG-FAME-UHD, que se muestra en la Figura 4D, utilizando el siguiente procedimiento.
  16. Montaje de referencia líquida en el portamuestras de criostato.
    1. Coloque la cinta de poliimida (por ejemplo, Kapton) (25 μm de espesor) para sellar un lado del orificio en el soporte de la muestra en RT (Figura 9B).
    2. Con una jeringa, llene la cavidad lentamente con la solución hasta que llegue a la parte superior. Evita las burbujas. El depósito debe llenarse (Figura 9C, izquierda).
    3. Selle el otro lado de la cavidad con la cinta (Figura 9C, derecha).
    4. Sumerja el soporte de muestra sellado en LN2 (Figura 9D, T0–T3).
    5. Una reacción térmica induce el burbujeo de LN2 . Espere hasta que el burbujeo se detenga, señalando el final de la reacción (Figura 9D, T3–T5).
    6. Transfiera el soporte de muestra a 77 K al criostato de la línea de haz antes de comenzar la recopilación de datos (Figura 9D, T6) o almacenarlo en el LN2 Dewar.
      NOTA: La solución congelada está bien extendida en la cavidad y forma un pellet uniforme y homogéneo (Figura 9D, T7).

4. HERFD-XAS: procedimiento de medición

  1. Optimizar todos los cristales del CAS en condiciones Bragg con respecto a la línea de fluorescencia de energía de interés. Este procedimiento se puede realizar con un compuesto de referencia concentrado.
  2. Calibre la energía del haz monocromático incidente utilizando una referencia para la cual se conoce la posición de energía del borde de absorción (típicamente una lámina metálica pura). Esta referencia se puede posicionar en un segundo paso después de la muestra, en modo de doble transmisión, para poder comprobar la calibración de cada espectro obtenido y eventualmente alinearlos después del tratamiento.
  3. Coloque la muestra en un criostato de helio líquido para muestras biológicas siguiendo el procedimiento apropiado descrito en el paso 1.9.6.
  4. Cierre la caseta experimental siguiendo las reglas de seguridad del sincrotrón.
  5. Realice la adquisición de XAS en un rango de energía que cubra el borde de absorción seleccionado.
  6. Después de cada adquisición espectral, mueva la muestra al menos el doble del tamaño del haz en la dirección del movimiento antes de comenzar una nueva adquisición.
    NOTA: En este caso, las mediciones se realizaron utilizando cristales Ge(440) para seleccionar la líneaFe K a1 y utilizando cristales Ge(844) para seleccionar la líneaSe K a1. El tamaño del haz en la muestra fue de 200 x 100 μm² (H x V Full Width Half Maximum). El movimiento de la muestra entre cada adquisición fue de 500 μm en ambas direcciones, con el fin de sondear la homogeneidad estructural y analizar una nueva área libre de posibles daños por radiación anteriores cada vez. Los espectros individuales se comparan y fusionan si son superponibles dentro del ruido. La medición se detiene para una muestra dada cuando la calidad del espectro combinado es correcta. Luego, el análisis de datos se puede realizar utilizando cualquier software dedicado al análisis XAS, especialmente aquellos que permiten una combinación lineal de espectros normalizados, por ejemplo Athena y Artemis (grupo de software Demeter)15, SixPack16 o Viper17. Las explicaciones completas y detalladas del análisis XAS quedan fuera del alcance de este protocolo y se pueden encontrar en los artículos recientes18,19, algunos de ellos más específicamente dedicados a muestras biológicas20. Los espectros de referencia de selenio XANES ya están reunidos en la base de datos de espectros SSHADE21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Los principales objetivos de estas preparaciones fueron investigar la interacción entre las nanopartículas de selenio (Se-NP) y las células cancerosas, y la unión y secuestro de hierro en el fitoplancton.

Los espectros HERFD-XANES del selenio en estado inicial (BSA Se-NPs) y en células incubadas en medio nutritivo (BSA Se-NPs después de 24 h de incubación) se muestran en la Figura 10. Los resultados mostraron que el selenio en los Se-NP iniciales estaba presente como Se(0) y formas similares a la selenita, mientras que después de las interacciones con las células PC-3, el selenio en las células estaba presente principalmente como Se(0), lo que demuestra un cambio de las especies de selenio en las células. Para el hierro, los espectros de referencias de HERFD-XANES mostraron distintas posiciones de borde dependiendo del estado de oxidación del hierro, con especies reducidas de hierro desplazadas a valores de baja energía (Figura 11). Dos espectros sucesivos recogidos en la misma posición de un pellet de diatomeas fueron similares, lo que indica que el daño del haz estaba limitado entre dos adquisiciones cuando se usaba un he-criostato a 10 K. Además, los espectros de diferentes posiciones del pellet de diatomeas (aquí tres posiciones) fueron idénticos, lo que demuestra que el pellet de muestra era homogéneo y que los espectros podían promediarse para obtener un mejor espectro de relación señal-ruido (espectro promediado). El espectro promediado para diatomeas muestra características de borde que corresponden principalmente a Fe(III). A continuación, se realizó un ajuste de combinación lineal de los espectros de referencia para cuantificar la proporción de las especies de hierro descritas en Sarret et al.6.

Figure 1
Figura 1: Pellets celulares típicos. Los tubos de polipropileno de 1,5 ml (células OVCAR-3 a la izquierda, células PC-3 a la derecha) contienen 8 x 106 células y 1 x 107 células, respectivamente. Crédito: Caroline Bissardon. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Preparación en guantera anaeróbica. (A) Guantera anaeróbica que contiene un bastidor de tubo de polipropileno (azul) de 1,5 ml (B) completamente sumergido en líquido LN2. El líquido LN2 no se presenta en la imagen para mayor claridad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Esquema de peletización celular. (A) Muestra de pellet en la prensa antes de la carga. (B) Muestra durante la carga. (C) Muestra de pellet a granel después de la carga. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Montaje de la(s) crio-muestra(s). Montaje en el soporte de muestras específico para la línea de haz BM16 XAS en ESRF. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Preparación anóxica de solución de referencia. Ejemplos de preparaciones de referencia de selenio almacenadas en globos Schlenk. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Configuración para la preparación anóxica de soluciones de referencia. Configuración de la rampa Schlenk con agua ultrapura desgasificada en la botella de la derecha. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Preparación en pellet sólido de referencia. Preparación de gránulos cilíndricos prensados para compuestos en polvo, ya sea en el aire ambiente o debajo de la guantera. A) Peso del polvo de referencia. (B) El polvo en el orificio cilíndrico del soporte de prensa. C) Soporte de prensa cerrado. D) Prensado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8: Preparación de un pellet sólido de referencia utilizando discos de poliimida. Preparación de pellet cilíndrico prensado para compuestos en polvo pegajosos o quebradizos. (A) Una gota de etanol a cada lado de los pistones que estará en contacto con el polvo permitirá que los discos de poliimida en los pistones se adhieran a ellos (B). El moldeador está montado con el pistón. Luego, el polvo se puede depositar y el moldeador se puede cerrar con el segundo pistón (C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 9
Figura 9: Pasos de preparación para el portamuestras de criostato para una referencia o muestra líquida. Para mayor claridad de la imagen, las fotos se tomaron fuera de la guantera y sin sustancias peligrosas. Aquí, utilizamos agua ddH2O. Si es necesario, esta preparación se puede hacer bajo una guantera o una carpa de plástico de atmósfera inerte (N2). (A) Soporte para muestras. (B) Coloque cinta de poliimida en la superficie curva para sellar el agujero. (C) Inyecte lentamente las soluciones de referencia gota a gota con una jeringa hasta que se llene la cavidad. No deben quedar burbujas de aire. Selle el otro orificio con cinta de poliimida. (D) Sumérgete en LN2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 10
Figura 10: Análisis típico de HERFD-XANES de borde K. Se K-edge HERFD-XANES de Se-NPs recubiertos de BSA, tal como se recibieron y dejaron 24 h en medio de cultivo celular, y células PC-3 expuestas a Se-NPs recubiertos de BSA. Los espectros se desplazan para mayor claridad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 11
Figura 11: Análisis típico de FE K-edge HERFD-XANES. Ejemplo de los espectros recogidos durante nuestro experimento sobre la especiación del hierro en plancton. Los seis espectros superiores corresponden a las referencias/estándares. Los espectros superpuestos (en rojo y negro) corresponden a dos espectros recogidos en la misma posición del pellet. Los espectros etiquetados pos#1, pos#2 y pos#3 se recolectaron en tres posiciones diferentes del pellet de muestra. El espectro llamado Diatomeas Promedio corresponde a los espectros promediados recogidos en varias posiciones del pellet y es la muestra para la cual se debe determinar la especiación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Productos Línea celular PC3 Línea celular OVCAR3
ATCC modificado RPMI 1640 medio 445 ml 394,5 ml
Suero bovino fetal 50 ml 100 ml
Penicilina-Estreptomicina 5 ml 5 ml
Insulina bovina - 500 μL

Tabla 1. Preparación de medios de cultivo celular. Las células se cultivan en el medio RPMI 1640 modificado por la American Type Culture Collection (ATCC) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de penicilina-estreptomicina (PS) para células de cáncer de próstata PC-3 y con 20% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina y 0,01 mg / ml de insulina bovina para células de cáncer de ovario OVCAR-3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Este protocolo se utilizó para estudiar la forma química del selenio y el hierro en muestras biológicas mediante espectroscopia de absorción de rayos X. Se centra en la criopreparación y almacenamiento de muestras biológicas y compuestos de referencia, así como en las mediciones HERFD-XAS.

Criopreparación y almacenamiento
La criopreparación de los pellets de muestra biológica a granel permite preservar la integridad química de las especies presentes en las muestras. Esto es crucial, porque se han observado cambios de especiación cuando se utiliza la liofilización o el secado al aire para la preparación6. Este protocolo debe utilizarse tan pronto como la línea de haz seleccionada para las mediciones esté equipada con un criostato de helio.

Para los compuestos de referencia, es necesario trabajar en una atmósfera anóxica cuando se utilizan elementos sensibles a los redox para preservar el estado de oxidación. Esto se puede verificar con variaciones en la posición del borde espectral como se muestra para los compuestos de referencia ferrosos y férricos (Figura 11).

Esta preparación de la muestra se puede realizar antes del sincrotrón o del análisis de laboratorio. En este caso, el pellet o referencia congelado debe transferirse a un criotubo y almacenarse en un tanque LN2 . Este almacenamiento de LN2 es obligatorio para proporcionar un ambiente inerte protector y evitar cambios en las especies químicas, particularmente para el hierro reactivo o los compuestos seleno. Preferiblemente, las muestras deben prepararse justo antes de la medición o almacenarse unos días antes del análisis. Es mejor no almacenar muestras durante un largo período de tiempo (es decir, meses).

Crioanálisis
El análisis a bajas temperaturas, idealmente a 10 K, es muy recomendable para frenar el daño inducido por el intenso haz de rayos X, particularmente la formación de radicales libres a partir de la hidrólisis del agua, que puede dañar la matriz proteica y crear fotorreducción de iones de metales de transición o fotorreducción de elementos como el azufre22. Lo mejor es tener en cuenta estos posibles cambios en las especies químicas a través de la rápida adquisición del espectro XAS. La muestra también debe escanearse para exponer un área no irradiada para cada espectro. Como lo demuestran los espectros recogidos en las tres posiciones diferentes del pellet de fitoplancton (Figura 11), tal estrategia revela espectros poderosos, que luego se pueden promediar para obtener una mejor relación señal-ruido.

Aplicaciones futuras
En nuestro trabajo, utilizamos una línea de haz dedicada a las mediciones HERFD-XAS (FAME-UHD, ESRF, Francia), pero este protocolo para la preparación de muestras biológicas se puede aplicar en cualquier línea de haz XAS estándar equipada con un criostato mientras se utilizan otros tipos de detectores como multielemento Ge Solid-State-Detector o Silicon-Drift Detector. El flujo de trabajo propuesto también se puede aplicar a cualquier otro elemento químico o cualquier material biológico que se espera que se estudie mediante espectroscopia de absorción de rayos X.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses.

Acknowledgments

Agradecemos las contribuciones financieras al desarrollo de la línea de haz por parte de CEMHTI (Orleans, Francia, ANR-13-BS08-0012-01) y Labex OSUG@2020 (Grenoble, Francia, ANR-10-LABX-0056). El proyecto FAME-UHD cuenta con el apoyo financiero del "grand emprunt" francés EquipEx (EcoX, ANR-10-EQPX-27-01), el consorcio CEA-CNRS CRG y el instituto INSU CNRS. Estamos agradecidos de todas las contribuciones durante los experimentos, especialmente a todas las personas que trabajan en BM30B y BM16. Los autores reconocen la Instalación Europea de Radiación sincrotrón para la provisión de tiempo de haz de radiación sincrotrón. También reconocemos el proyecto PHYTOMET ANR por apoyo financiero (ANR-16-CE01-0008) y el proyecto SEDMAC por apoyo financiero (INCA-Plan cáncer-ASC16019CS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ammonium nitrate Sigma-Aldrich A3795 NH4NO3, 2.66 mg/L of milliQ water
Anaerobic chamber Coy Laboratory, USA equipped with Anaerobic Monitor (CAM-12)
Antibiotic stock Sigma-Aldrich A0166 for ampicillin, S9137 for streptomycin sulfate 1 mL/L of milliQ water (ampicillin sodium and streptomycin sulfate, 100 mg/mL)
Boron nitride powder Sigma-Aldrich 255475
Cell counting chamber Neubauer or Malassez
Cell scraper
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) GIBCO 14190-094 Without Calcium, Magnesium, Phenol Red
Eppendorf tubes 0.5 mL and 1.5 mL
Falcon tubes 15 mL and 50 mL
Ferric citrate Fe/citrate = 1/20 Sigma-Aldrich F3388 aqueous solution of FeCl3 50 mM and Na-citrate 1M pH 6.5
Fetal Bovine Serum GIBCO A31604-02 Performance Plus, certified One Shot format, US origin
Flasks Sigma-Aldrich Z707503 TPP 150 cm2 area
Growth chamber Sanyo Sanyo MLR-352 at 20 °C and under a 12:12 light (3,000 lux) dark regime
HEPES buffer Sigma-Aldrich H4034 1 g/L of milliQ water HEPES
High grade serous, OVCAR-3 ATCC, Rockville, MD HTB-161 Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature
Incubator Incubator at 37°C, humidified atmosphere with 5% CO2
Insulin solution from bovine pancreas Sigma-Aldrich I0516 10 mg/mL insulin in 25mM HEPES, pH 8.2, BioReagent, sterile-filtered, suitable for cell culture
Manual hydraulic press Specac, USA
Marine diatom Phaeodactylum tricornutum Roscoff culture collection RCC69 http://roscoff-culture-collection.org/rcc-strain-details/69
Morpholinepropanesulfonic acid Sigma-Aldrich M3183 MOPS, 250 mg/L of milliQ water (pH 7.3)
Optical microscope
PC-3 ECCAC, Salisbury, UK 90112714 Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333 Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Pipette-boy 25mL-, 10mL-, and 5mL sterile plastic-pipettes
Plankton culture products, Mf medium: Sea salts Sigma-Aldrich S9883 40g/L of milliQ water. Composition: Cl- 19.29 g, Na+ 10.78 g, SO42- 2.66 g, Mg2+ 1.32 g, K+ 420 mg, Ca2+ 400 mg, CO32- /HCO3- 200 mg, Sr2+ 8.8 mg, BO2- 5.6 mg, Br- 56 mg, I- 0.24 mg, Li+ 0.3 mg, F- 1 mg
Plastic tweezers Oxford Instrument AGT 5230
RPMI MEDIUM 1640 (ATCC Modification) GIBCO A10491-01 Solution with 4.5 g/L D-glucose, 1.5 g/L Sodium Bicarbonate, 110 mg/L (1 mM) Sodium Pyruvate, 2.388 g/L (10 mM) HEPES buffer and 300 mg/L L-glutamine for research use
Selenium nanoparticles (Se-NPs), BSA coated, 2 mg/mL NANOCS Company, USA Se50-BS-1 BSA stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light.
Selenium nanoparticles (Se-NPs), Chitosan coated, 2 mg/mL NANOCS Company, USA 11. Se50-CS-1 Chitosan stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light.
Sodium metasilicate pentahydrate Sigma-Aldrich 71746 Na2SiO3.5H2O, 22.8 mg/L of milliQ water
Sodium nitrate Sigma-Aldrich S5022 NaNO3, 75 mg/L of milliQ water
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich S5011 NaH2PO4, 15 mg/L of milliQ water
T-75 flasks
Tissue culture hood
Trace metal stock Sigma-Aldrich M5005, Z1001, M1651, C2911, 450243, 451193, 229857 1 mL/L of milliQ water (MnCl2.4H2O 200 mg/L, ZnSO4.7H2O 40 mg/L, Na2MoO4.2H2O 20mg/L, CoCl2.6H2O 14 mg/L, Na3VO4.nH2O 10 mg/L, NiCl2 10 mg/L, H2SeO3 10 mg/L)
Trypan Blue Solution (0.4%) GIBCO 15250061
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red GIBCO 25300-054
Vitamin stock Sigma-Aldrich T1270 for thiamine, B4639 for biotin, V6629 for B12 1 mL/L of milliQ water (thiamine HCl 20 mg/L, biotin 1 mg/L, B12 1 mg/L)
Water bath 37°C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Llorens, I., et al. High energy resolution five-crystal spectrometer for high quality fluorescence and absorption measurements on an x-ray absorption spectroscopy beamline. Review of Scientific Instruments. 83 (6), 063104 (2012).
  2. Proux, O., et al. High Energy Resolution Fluorescence Detected X-ray Absorption Spectroscopy: a new powerful structural tool in environmental biogeochemistry sciences. Journal of Environmental Quality. 46 (6), 1146-1157 (2017).
  3. Bissardon, C., et al. Sub-ppm high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy of selenium in articular cartilage. Analyst. 144 (11), 3488-3493 (2019).
  4. Proux, O., et al. FAME: a new beamline for X-ray absorption investigations of very-diluted systems of environmental, material and biological interests. Physica Scripta. 115, 970-973 (2005).
  5. George, G. N., et al. X-ray-induced photo-chemistry and X-ray absorption spectroscopy of biological samples. Journal of Synchrotron Radiation. 19 (6), 875-886 (2012).
  6. Sarret, G., et al. Use of Synchrotron-Based techniques to Elucidate Metal Uptake and Metabolism in Plants. Advanced in Agronomy. 119, 1-82 (2013).
  7. Porcaro, F., Roudeau, S., Carmona, A., Ortega, R. Advances in element speciation analysis of biomedical samples using synchrotron-based techniques. Trends Analytical Chemistry. 104, 22-41 (2018).
  8. Bissardon, C., et al. Role of selenium nanoparticles to dampen the metastatic potential of aggressive cancer cells. 9th bioMedical Applications of Synchrotron Radiation, Beijing, China. , Available from: https://indico.ihep.ac.cn/event/7794/contribution/7 (2018).
  9. Isaure, M. P. Metals in microorganisms: new insights from nano-scale imaging and X-ray absorption spectroscopy. 102nd Canadian Chemistry Conference and Exhibition Environmental Chemistry. Quebec, Canada. , Available from: http://www.ccce2019.ca/environmental-chemistry (2019).
  10. Weekley, C. M., et al. Speciation of Seleno-amino Acids by Human Cancer Cells: X-ray Absorption and Fluorescence Methods. Biochemistry. 50 (10), 1641-1650 (2011).
  11. Sutak, R., et al. A comparative study of iron uptake mechanisms in marine microalgae: Iron binding at the cell surface is a critical step. Plant Physiology. 160, 2271-2284 (2012).
  12. Asakura, K., Abe, H., Kimura, M. The challenge of constructing an international XAFS database. Journal of Synchrotron Radiation. 25 (4), 967-971 (2018).
  13. Schmitt, B., et al. SSHADE: "Solid Spectroscopy Hosting Architecture of Databases and Expertise" and its databases. OSUG Data Center. Service/Database Infrastructure. , Available from: https://www.sshade.eu/ (2018).
  14. Bissardon, C., et al. Sub-ppm high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy of selenium in articular cartilage. Analyst. 144 (11), 3488-3493 (2019).
  15. Ravel, B., Newville, M. ATHENA, ARTEMIS, HEPHAESTUS: data analysis for X-ray absorption spectroscopy using IFEFFIT. Journal of Synchrotron Radiation. 12 (4), 537-541 (2005).
  16. Webb, S. M. SIXpack: a graphical user interface for XAS analysis using IFEFFIT. Physica Scripta. 115, 1011 (2005).
  17. Klementiev, K. V. VIPER for Windows. Journal of Physics D: Applied Physics. 34 (2), 209-217 (2001).
  18. Newville, M. Fundamental of XAFS. Reviews in Mineralogy & Geochemistry. 78, 33-74 (2014).
  19. Henderson, G. S., de Groot, F. M. F., Moulton, B. J. A. X-ray Absorption Near-Edge Structure (XANES) Spectroscopy. Reviews in Mineralogy & Geochemistry. 78, 75-138 (2014).
  20. Ortega, R., Carmona, A., Llorens, I., Solari, P. L. X-ray absorption spectroscopy of biological samples. A tutorial. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 27, 2054-2065 (2012).
  21. Bissardon, C., Bohic, S., Proux, O. Se K edge XAS HERFD of selenium with various oxidation states at 10K. SSHADE/FAME. , Available from: https://doi.org/10.26302/SSHADE/EXPERIMENT_CB_20190408_001 (2019).
  22. George, G. N., et al. X-ray-induced photo-chemistry and X-ray absorption spectroscopy of biological samples. Journal of Synchrotron Radiation. 19, 875-886 (2012).

Tags

Química Número 183 Espectroscopía de absorción de rayos X especiación selenio hierro células cancerosas fitoplancton sincrotrón espectroscopia de absorción de rayos X detectada por fluorescencia de alta resolución criopreparación
Preparación de muestras biológicas para la especiación a temperatura criogénica mediante espectroscopia de absorción de rayos X de alta resolución
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bissardon, C., Isaure, M. P.,… More

Bissardon, C., Isaure, M. P., Lesuisse, E., Rovezzi, M., Lahera, E., Proux, O., Bohic, S. Biological Samples Preparation for Speciation at Cryogenic Temperature using High-Resolution X-Ray Absorption Spectroscopy. J. Vis. Exp. (183), e60849, doi:10.3791/60849 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter