Summary
这里报道的是使用实时监测受感染细胞的电阻抗来定量感染性病毒颗粒的方案。通过量化甲型流感病毒在模拟环境条件下的不同物理化学参数下的衰变,提出了该方法的实际应用。
Abstract
病毒颗粒定量方法代表了许多病毒学研究的一个关键方面。尽管存在几种可靠的技术,但它们要么耗时,要么无法检测到微小的变化。这里介绍的是一种通过实时分析受感染细胞的电阻抗变化来精确定量病毒滴度的方案。细胞阻抗是通过位于微孔板中细胞下方的金微电极生物传感器测量的,其大小取决于细胞的数量以及它们的大小和形状。该协议允许以增强的灵敏度实时分析细胞增殖,活力,形态和迁移。还提供了一个实际应用示例,通过量化甲型流感病毒(IAV)的衰变,该病毒随时间推移影响病毒感染性的各种物理化学参数(即温度,盐度和pH值)。对于此类应用,该协议减少了所需的工作量,同时还生成了传染性病毒颗粒的精确定量数据。它允许比较不同IAV之间的失活斜率,这反映了它们在给定环境中的持久化能力。该方案易于执行,具有高度可重复性,可应用于细胞培养中产生细胞病变效应的任何病毒。
Introduction
病毒的传播取决于几个因素的组合。对于环境中分泌的病毒,其传播还取决于在宿主以外的条件下持续存在的能力。因此,一般研究病毒灭活是帮助国家卫生当局和政策制定者实施控制和生物安全措施的关键一步。
在过去十年中,关于病毒在自然环境中和实验室环境中的持久性的知识有了相当大的增加。就甲型流感病毒(IAV)而言,其传播途径使病毒颗粒暴露于各种环境条件。具体而言,它们可以通过1)通过水(即禽类病毒)的粪口途径传播,或2)受污染的污染物以及气溶胶和呼吸道飞沫(即家禽和哺乳动物病毒)直接或间接接触1。在任何情况下,IAV都会受到各种物理化学参数(即pH值,盐度,温度和湿度)的影响,这些参数或多或少会迅速影响其传染性2,3,4,5,6,7,8,9。评估环境因素影响病毒动态以及接触和跨物种传播风险的可能性非常重要,特别是在人畜共患和大流行性病毒方面。
到目前为止,传统的病毒学技术(即通过斑块测定或50%组织培养感染剂量估计测定病毒滴度)已被用于评估IAV感染率随时间推移;但这些技术非常耗时,需要大量耗材10、11、12。使用微电极测量受感染细胞阻抗随时间的变化,是监测不同环境条件下IAV存活率以及一般病毒失活的有用工具。这种方法提供了客观的实时数据,取代了人类对细胞病变效应的主观观察。它可用于确定病毒滴定,从而以较低的置信区间取代传统测量,并避免劳动密集型终点测定。
通过测量细胞阻抗获得的滴定结果与经典斑块测定法或TCID50 方法之间存在线性相关性。因此,通过创建连续稀释病毒的标准曲线,可以使用基于阻抗的滴定方法获得的数据可以很容易地转换为TCID50 或pfu值13,14,15,16,17。使用这种实验方法也可以实现血清样品中存在的中和抗体的检测,定量和功效18,19。最近,基于阻抗的细胞测定已被用于筛选和评估针对Equid甲型疱疹病毒的抗病毒化合物20。
该技术已被用于评估IAV在不同温度下盐水中的持久性,并鉴定IAV血凝素中增加或减少IAV在环境中的持久性的突变21。如果使用传统的滴定方法,这种筛选将需要大量的工作。然而,这种方法可用于任何对细胞形态,细胞数量和细胞表面附着强度有影响的病毒。它还可用于监测各种环境条件下(即在空气中、水中或表面上)的持久性。
此处描述的协议以IAV在水中的生存为例。人类流感病毒在较长时间内暴露于不同的物理化学参数。根据以往结果,选择35 °C盐水(35 g/L NaCl)作为环境模型9。通过细胞感染在不同时间点量化暴露病毒的残留传染性。MDCK细胞是用于IAV扩增的参考细胞类型,接种在涂有微电极传感器的16孔微量滴定板上,并在24小时后被暴露的病毒感染。每15分钟测量一次细胞阻抗,并表示为称为细胞指数(CI)的任意单位。由流感病毒诱导的细胞病变效应,其发病率直接取决于接种到细胞培养物中的感染性病毒颗粒的数量,导致CI降低,随后量化为CIT50 值。该值对应于测量从初始CI减少50%所需的时间(即,在病毒添加之前)。针对多个环境暴露时间计算的 CIT50 值允许在 CIT50 值的线性回归后推断出病毒的失活斜率。
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Protocol
根据适当的生物安全水平要求(BSL-2或更高,取决于亚型)处理所有流感病毒。使用具有低传代历史(在MDCK细胞上小于5倍)的IAV菌株来确保实验之间的低变异。
1. 试剂和起始材料的制备
- MDCK细胞和无菌细胞培养基的制备
- 在补充10%热灭活胎儿小腿血清(FCS)和抗生素(100单位/ mL青霉素,100mg / mL链霉素)的改良鹰培养基(MEM)中培养Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞。
- 解冻后,在感染MDCK细胞之前至少传代2次以确保完全恢复(但少于30次传代以避免细胞表型的任何漂移)。
- 种子75 cm 2 组织培养瓶,含有30mL无菌1x MEM与7.5×10 6 个MDCK细胞,并在37°C下在加湿的5%CO 2 培养箱中孵育。
- 阻抗监测设备的准备
- 将仪器置于35°C的培养箱中,并使其预热至少2小时。
- 将其连接到放置在培养箱外部的控制单元。
- 在开始实验的其余部分之前,按照制造商的建议进行清洁程序。
- 在MDCK电池上生产IAV库存
- 为了繁殖和扩增H1N1病毒,在两个75 cm 2的组织培养瓶上接种7.5×106个MDCK细胞,并在37°C下孵育24小时以达到90%-100%汇合。
- 将细胞培养基从细胞单层中倒入75 cm 2 烧瓶中。用5 mL无菌1x PBS洗涤细胞。
- 取出PBS并加入5 mL的1x PBS以再次洗涤细胞。
- 在单层上小心地加入15 mL病毒传播培养基(1x MEM,0%FCS)之前,将一个烧瓶标记为对照并取出PBS。将该烧瓶在保持35°C且CO 2为5%的培养箱中孵育。在传播3天后使用它进行比较。
- 在室温下解冻一小瓶IAV储备液,将病毒稀释到含有病毒传播介质的1.5 mL管中的适当浓度(1x MEM,0%FCS)。
- 从75 cm2 烧瓶中取出1x PBS,并通过向细胞单层中添加1mL稀释的病毒,以每个细胞(pfu /cell)1 x 10-3 或1 x 10-4 个斑块形成单位的多重感染(MOI)感染MDCK细胞。
- 通过每15分钟定期搅拌烧瓶,在室温下将病毒吸附到MDCK细胞45分钟。
- 轻轻取出接种物,每瓶含有1μg/mL TPCK-胰蛋白酶(胰蛋白酶/L-1-甲苯磺酰胺-2-苯乙基氯甲基酮)的病毒繁殖培养基,将病毒血凝素HA0切割成HA1和HA2亚基(HA与内体膜融合和病毒基因组释放所需的事件)22。
- 将烧瓶在35°C和5%CO 2 下孵育至少3天以复制病毒。
- 在显微镜下以40倍放大倍率观察MDCK细胞,并寻找细胞对细胞的细胞病变效应(CPE)(通过与细胞对照瓶进行比较)。如果CPE不完整(即,约80%的细胞从底物中分离),则将烧瓶放回培养箱中再放置24小时。
- 当CPE完成时,倾析细胞培养物上清液并以300 ×g 离心10分钟以沉淀细胞碎片。
- 将澄清的上清液转移到15 mL管中,并将等分子病毒转移到一次性无菌低温小瓶中。立即将冷冻管置于-80°C以冷冻和储存病毒。
2. 测定感染细胞的适当细胞数量
注意:在所有实验过程中,请始终将印版放在非静电表面上,例如包装上的纸包装。按照下面的第2节确定要接种在电子微量滴定板(设计为E板)中的细胞的最合适浓度。
- 在实验前24小时将MDCK细胞制备在75 cm 2 烧瓶中以获得新鲜分裂的细胞(约80%汇合)。
- 用5 mL 1x PBS洗涤细胞,并通过加入3 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液将其分离。
- 加入7 mL新鲜细胞培养基,并使用带有台盼蓝染色的自动细胞计数器对细胞进行计数。
- 用细胞培养基将细胞浓度调节至400,000个细胞/ mL。在额外的试管中进行两倍连续稀释,以获得200,000的细胞密度;100,000;50,000;25,000;12,500;和6,250个细胞/毫升。根据细胞类型及其生长行为调整细胞的稀释范围。
- 将E板(材料表)置于室温下几分钟,并使用多通道移液器向每个孔中加入100μL细胞培养基。请勿触摸电子板的电极。
- 打开底座,将板前端插入阻抗测量仪的底座口袋(材料表)。关闭培养箱的门。
- 打开软件。
- 在"默认实验模式设置"中,选择选定的底座并双击首页,然后输入实验的名称。单击"布局",然后输入板中每个选定孔的必要样品信息;然后,完成后单击"应用"。点击"时间表" | "步骤" | "添加一个步骤"。软件会自动添加1秒的步长来测量背景阻抗(CI)。
- 单击"执行"选项卡中的"开始/继续"。单击"绘图",通过选择适当的孔添加所有样品,并确保CI介于-0.1和0.1之间,然后再进行下一步。
- 从底座上取下板。
- 将步骤2.4中100μL的每个细胞悬浮液一式两份加入适当的孔中,并在用作对照的孔中加入100μL细胞培养基。将E板在室温下在层流罩中放置30分钟,以使细胞均匀分布在孔的底部。
- 将电子板插入底座口袋。点击"时间表" | 在软件中"添加步骤",并输入值以每30分钟监测单元格200次重复。然后,选择"开始/继续"。
- 通过单击软件中的"绘图"按钮检查并绘制CI数据。选择在板上接种24小时后静止期之前的细胞浓度,以获得在病毒感染期间仍处于生长期的细胞。当 CI 处于最大值时,即达到静止相位。
3. CIT50 值与感染多重性之间的相关性
- 在E板的每个孔中加入100μL无菌1x MEM培养基。将电子板插入仪器的底座口袋中,温度为35°C。 按照步骤 2.7 中所述测量背景。
- 从底座上取下电子板。
- 在电子微量滴定板的每个孔上播种3 x 104 新鲜分裂的MDCK细胞,并在35°C下用5%CO 2培养24 小时,使其在IAV感染期间处于复制阶段。
- 使用已知 6 log10 TCID50/mL H1N1 病毒滴度的不同 10 倍稀释液感染 MDCK 细胞,并按照以下步骤进行反向移液以提高可重复性:
- 用100μLMEM冲洗MDCK细胞2x,不含FCS(病毒传播培养基)。注意在第二次洗涤后除去所有培养基,以避免进一步稀释接种物。
- 使用单通道移液管在每个孔中加入100μL病毒悬浮液。为避免污染,请从左到右开始,然后在板中从上到下开始,同时用盖子覆盖剩余的孔。
- 将板插入仪器的底座口袋中,温度为35°C。 要轻柔,以避免可能导致污染的突然运动。
- 按照步骤2.10中所述,在至少100小时内开始每15分钟监测一次电池阻抗。
- 在两个测量周期(即30分钟)之后,通过单击"执行"选项卡中的"暂停"来暂停设备,然后从底座中取出电子板。
- 向病毒传播培养基中加入1μg/mL TPCK-胰蛋白酶,以切割病毒血凝素。
- 将100μL含有TPCK胰蛋白酶的病毒传播培养基加入每个孔中,并将E板插入摇篮口袋。
- 单击"执行"选项卡中的"开始/继续"。
注意:不要忘记通过用病毒传播培养基代替病毒悬浮液来创建对应于模拟感染细胞的阴性对照。
4. IAV生存动力学
- 将IAV暴露于35°C的盐水蒸馏水中,并通过测量细胞阻抗降低来测试其随时间推移的传染性。
- 通过将NaCl加入蒸馏水中至终浓度为35g / L来制备盐水蒸馏水。将900μL生理盐水加入2mL冷冻管中。
- 在盐水中加入100μL病毒储备,并将冷冻管置于培养箱(35°C,5%CO 2)中1小时,24小时或48小时。
- 在16孔微量滴定板上接种100μL(含有3×104)新鲜分裂的MDCK细胞,并在37°C和5%CO 2下生长24小时。
- 使用反向移液方法用100μL暴露的病毒(先前在培养基中稀释10倍)感染细胞,通过重复第3.4节获得可重复性。
- 每15分钟监测电池阻抗至少100小时。
5. 传染性丧失的评估
- 测定CIT50值以量化由于病毒诱导的CIT50 值的细胞病变效应引起的CI降低。
- 单击"绘图",然后单击"全部添加"添加所有示例。通过单击"导出实验信息"将结果导出到电子表格。将初始CI视为暴露病毒感染细胞后5小时(即,在微量滴定E板上接种MDCK细胞后24小时)测量的细胞阻抗值。
- 计算 CIT50 值,该值对应于测量从初始 CI 降低 50% 的必要时间。要计算 CIT50 值,请记下每个样品在 5 hpi 处的 CI 值。然后,使用电子表格中的索引和匹配函数,找到 CI 值等于 5 hpi 时 CI 值的一半的时间点。
- 平均失活斜率的计算
- 确定每种暴露的病毒悬浮液在不同暴露时间(以天为单位)的CIT50 值。
- 根据 CIT50 绘制的值计算线性回归斜率,称为失活斜率,以 CIT50.day-1 表示。
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Representative Results
使用不同浓度的MDCK细胞(每孔15,000至120,000个细胞)在120小时后获得的原始数据如图 1所示。24小时后,CI测量表明,接种有30,000个细胞的孔中的细胞仍处于生长的指数阶段,并且该细胞浓度用于进一步的实验。 图2 显示了CIT50 值与感染的初始多重性之间的线性相关性。MDCK细胞培养24小时,然后在不同的感染多样性下感染A / Paris / 2590 / 2009 H1N1病毒株。初始 CI 在感染后 5 小时测量。
图3 显示了我们实验中使用的实验程序(图A)。图B显示,由于病毒诱导的细胞病变效应导致CI降低的典型结果。这些是软件处理后获得的原始数据。导出数据后使用电子表格计算CIT50 值。在计算不同时间点的CIT50 值后,线性回归分析允许确定斜率(面板C)。因此,获得每种条件下每种病毒的病毒灭活斜率,然后进行比较以确定在研究环境中具有最大稳定性的病毒。
图4 显示了具有属于A/WSN/1933 H1N1病毒株的遗传骨架以及来自A/New Caledonia/20/1999 H1N1病毒(HA-NA/NC99)的HA和NA的IAV重组病毒的失活斜率。引入HA中的非同义突变来研究对盐水中宿主外病毒颗粒持久性的影响。
通过比较一式三份进行的不同实验的平均失活斜率,我们能够鉴定出HA中足以影响宿主外病毒持久性的氨基酸。灭活斜率越低,病毒越稳定。例如,HA-NA/NC99病毒HA-NA/NC99病毒HA中的HA/F453Y取代或HA::K147插入诱导平均灭活斜率分别显著增加至9.8 CIT50/天和9.9 CIT50/天,而野生型HA(平均失活斜率为4.85 CIT50/天),从而产生非常不稳定的突变体。相反,HA / T327A取代不影响盐水中35°C时的病毒稳定性(平均失活斜率为6.6 CIT50 /天)。因此,该方法足够强大,可以鉴定HA糖蛋白中的氨基酸残基,这些残基参与宿主外的IAV存活。
图1:微量滴定仪E板中的细胞滴定。
将MDCK细胞的连续稀释液接种在微量滴定E板上,并监测细胞生长长达100小时(每30分钟200次扫荡)。灰色点表示一式两份测量的 CI 的标准偏差。24小时的垂直线突出显示,在所描述的条件下,3×10 4 个细胞/孔的初始接种允许在感染时培养约70%的汇合度。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 2:CIT50 值与初始感染多重性之间的线性回归。
每个点表示为具有不同感染多样性的细胞的感染计算的CIT50 值。实线表示线性回归斜率 (R2 = 0.99),虚线表示 95% 置信区间。此图已从以前的出版物中修改21。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3:失活斜率的测定。
(A)将病毒颗粒在35°C的盐水中稀释0,1或2天,连续监测CI并绘制为细胞指数。(B) 使用CIT50值量化CI降低,CIT50值在原始数据上用垂直虚线手动表示。每条曲线代表暴露于盐水时间增加的病毒感染后细胞阻抗的演变(红色:未暴露的病毒,黄色:暴露24小时,绿色:暴露48小时,深色:模拟感染的细胞)。感染后5小时测量初始CI(C)CIT50值的线性回归,用于计算失活斜率。请点击此处查看此图的放大版本。
图4:HA中非同义突变对盐水中IAV持久性的影响。
携带来自A/New Caledonia/20/1999的H1N1病毒的HA的重组病毒的失活斜率,伴有(替代或插入)或不具有突变(HAWT)。箱线图显示了围绕平均值(水平线)获得的每种暴露病毒的单一灭活斜率(根据病毒的不同,根据不同的独立实验计算的六个或八个)的分布。使用方差分析检验比较平均失活斜率(ns,p >0.05,****p<0.0001)。Ref 对应于带有野生型 HA 的重配病毒,与其他病毒进行比较。此图已从以前的出版物中修改21。 请点击此处查看此图的放大版本。
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Discussion
RTCA是一种基于阻抗的技术,越来越多地用于实时监测细胞特性,如细胞粘附、增殖、迁移和细胞毒性。在这项研究中,通过测量病毒失活斜率证明了该技术在宿主外评估IAV存活的能力。TCID50 和斑块测定等挑剔的技术被细胞活力的客观实时评估所取代,从而反映了病毒诱导的细胞病变效应。与TCID50 或斑块形成单元(pfu)类似,CIT50 也与感染的多重性呈线性相关(图2)。在这种方法的局限性中,这种方法无法精确监测感染非细胞致病性病毒的细胞。
例如,将新突变引入病毒基因组可以强烈减弱病毒并降低其细胞致病性。相比之下,此处计算的失活斜率与病毒复制和潜在病毒衰减无关,因为该斜率来自在同一病毒灭活的不同时间点后测量的CIT50 值。因此,假设在此灭活方案之后仍然能够感染细胞的病毒颗粒与灭活前的病毒具有相同的复制表型。
尽管成本较高,但使用这种方法的工作量大大减少,当项目需要动力学性能时,这是有利的,并且测量频繁的时间点和很长一段时间。与每个协议一样,某些步骤至关重要,必须谨慎和精确地进行操作。反向移液是确保介质精确分配的关键步骤,必须特别注意避免任何污染。同样,每个实验之间的初始细胞数量必须相同,并且必须使用带有台盼蓝染色的自动细胞计数器进行评估。在通过设备监测CI期间,应尽可能限制培养箱的打开。
如果在运动受限的实验过程中提供护理和关注,则污染风险会降低,并且结果具有高度可重复性。不同病毒之间失活斜率的分布差异显著,因此采用非参数统计检验对病毒持久性进行比较。可以计算在细胞培养中产生细胞病变效应的任何病毒的平均失活斜率,例如肠道病毒,埃博拉病毒或冠状病毒,目前正在研究其在环境条件下的持久性(并且可能使用传统的病毒学方法)。将来,这种方法还可用于比较不同病毒的复制,同时研究几种细胞系的病毒向性,并研究病毒周期的具体步骤。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.25%Trypsin | ThermoFisher | 25200056 | |
75 cm2 tissue culture flask | Falcon | 430641U | |
E-Plate 16 (6 plates) | ACEA Biosciences, Inc | 5469830001 | E-plates are avalible in different packaging |
FCS | Life technologies (gibco) | 10270-106 | |
MEM 1X | Life technologies (gibco) | 31095029 | |
PBS 1X | Life technologies (gibco) | 14040091 | |
Penicillin-Streptomycin | Life technologies (gibco) | 11548876 | |
TPCK-Trypsin | Worthington | LS003740 | |
xCELLigence Real-Time Cell Analysis Instrument S16 | ACEA Biosciences, Inc | 380601310 | The xCELLigence RTCA S16 instruments are available in different formats (16-well, 96-well, single or multi-plate) |
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