Summary
على الرغم من التقدم في الكيمياء المناعية المتعددة والتصوير متعدد الأطياف ، فإن توصيف كثافة وتتجمع الخلايا المناعية الرئيسية في وقت واحد في بطانة الرحم لا يزال يشكل تحديا. تصف هذه الورقة بروتوكول تلطيخ متعدد المضاعفات مفصل وتصوير للتوطين المتزامن لأربعة أنواع من الخلايا المناعية في بطانة الرحم.
Abstract
الكيمياء المناعية هي الطريقة الأكثر استخداما لتحديد وتصور مستضدات الأنسجة في البحوث البيولوجية والتشخيص السريري. ويمكن استخدامه لوصف العمليات البيولوجية المختلفة أو الأمراض، مثل التئام الجروح، والاستجابة المناعية، ورفض الأنسجة، والتفاعلات بين الأنسجة والمواد الحيوية. ومع ذلك، فإن تصور وتكميم المستضدات المتعددة (خاصة للخلايا المناعية) في قسم واحد من الأنسجة باستخدام تلطيخ المناعة الكيميائية التقليدية (IHC) لا يزال غير مرض. ومن ثم، تم إدخال تقنيات متعددة العينات في السنوات الأخيرة لتحديد علامات بيولوجية متعددة في عينة نسيج واحدة أو مجموعة من عينات الأنسجة المختلفة.
يمكن أن تكون هذه التقنيات مفيدة بشكل خاص في التفريق بين التغيرات في التفاعلات بين الخلايا المناعية داخل بطانة الرحم بين النساء الخصبات والنساء اللواتي يجهضن المتكررة أثناء الزرع. تصف هذه الورقة بروتوكولا مفصلا لتلطيخ IHC الفلوري المتعدد الفلور للتحقيق في كثافة وتتجمع أربعة أنواع رئيسية من الخلايا المناعية في وقت واحد في عينات بطانة الرحم في الوقت المحدد بدقة أثناء زرع الجنين. تتضمن الطريقة إعداد العينة ، وتحسين تعدد المضاعفات مع علامات للأنواع الفرعية للخلايا المناعية ، ومسح الشرائح ، تليها تحليل البيانات ، مع إشارة محددة إلى الكشف عن الخلايا المناعية بطانة الرحم.
باستخدام هذه الطريقة، يمكن تحليل كثافة وتتجمع أربعة أنواع رئيسية من الخلايا المناعية في بطانة الرحم في وقت واحد في قسم واحد من الأنسجة. بالإضافة إلى ذلك، ستناقش هذه الورقة العوامل الحرجة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها للتغلب على التداخل المحتمل للفلوروفور بين المسابير الفلورية التي يتم تطبيقها. والأهم من ذلك، يمكن أن تساعد نتائج تقنية تلطيخ متعددة المضاعفات هذه في توفير فهم متعمق للتفاعل المناعي والتنظيم أثناء زرع الجنين.
Introduction
يمكن تعريف الإجهاض المتكرر (RM) بأنه فقدان حملين أو أكثر قبل 24 أسبوعا من الحمل1. هذه الحالة الإنجابية المتكررة تؤثر على ما يصل إلى 1٪ من الأزواج في جميع أنحاء العالم2،3. الفيزيولوجيا المرضية متعددة العوامل ويمكن تقسيمها إلى أسباب مدفوعة جنينيا (ويرجع ذلك أساسا إلى النمط الكاريوتيبي الجنيني غير طبيعي) والأسباب المدفوعة الأمهات التي تؤثر على بطانة الرحم و / أو نمو المشيمة. يمكن أن ينتج هذا المظهر عن التشوهات الوراثية الأبوية ، شذوذ الرحم ، الظروف البروتيمبوتيكية ، عوامل الغدد الصماء ، والاضطرابات المناعية4.
في السنوات الأخيرة، وقد تورط ضعف الخلايا المناعية التأثير في الإمراض من فقدان الحمل المبكر5. وقد ألهم هذا العديد من التحقيقات في توضيح مجموعات محددة من الخلايا المناعية في بطانة الرحم خلال الدورة الشهرية، والزرع، والحمل المبكر، مع أدوار محددة في الحمل المبكر. من بين هذه الخلايا المناعية، تلعب خلايا القاتل الطبيعي الرحمي (uNK) دورا حاسما أثناء زرع الجنين والحمل، لا سيما في عمليات الغزو الأرومي الترموغي وتولد الأوعية6. وقد أظهرت الدراسات زيادة كثافة خلايا UNK في بطانة الرحم للنساء مع RM 7,8, علىالرغممن أن هذه النتيجة لم تكن مرتبطة بزيادة خطر الإجهاض9. ومع ذلك، حفز هذا البحث تقييم كثافة أنواع الخلايا المناعية الأخرى (مثل الضامة، والخلايا التغصن الرحمي) في بطانة الرحم في النساء مع RM10،11. ومع ذلك، فإنه لا يزال من غير المؤكد ما إذا كان هناك تغيير كبير في كثافة الخلايا المناعية في بطانة الرحم المحيطة بالزرع في النساء المصابات بجمهورية مقدونيا.
أحد التفسيرات المحتملة لعدم اليقين هو أن تقييم كثافة الخلايا المناعية بطانة الرحم قد يكون صعبا بسبب التغيرات السريعة في بطانة الرحم أثناء نافذة الزرع. خلال الإطار الزمني 24 ساعة, تغييرات كبيرة في بطانة الرحم تغيير كثافة الخلايا المناعية وإفراز السيتوكين, إدخال مصدر الاختلاف في هذه النتائج12. وبالإضافة إلى ذلك، تعتمد معظم التقارير أساسا على استخدام تلطيخ خلية واحدة (مثل الطرق التقليدية للHHC) التي لا يمكن فحص علامات متعددة على نفس القسم الأنسجة. على الرغم من أن قياس التدفق الخلوي يمكن استخدامه للكشف عن مجموعات خلايا متعددة في عينة واحدة ، إلا أن الكميات الكبيرة من الخلايا المطلوبة والتحسين الذي يستغرق وقتا طويلا يعيق شعبية وكفاءة هذه الطريقة. وبالتالي ، فإن التقدم الأخير في تلطيخ IHC متعددة يمكن أن يحل هذه المشكلة عن طريق وضع علامات متعددة على نفس الشريحة لتقييم معلمات متعددة ، بما في ذلك نسب الخلايا والتوطين النسيجي للتجمعات الفرعية المناعية الفردية. وعلاوة على ذلك، يمكن لهذه التكنولوجيا تعظيم المعلومات التي تم الحصول عليها في حالة محدودية توافر الأنسجة. في نهاية المطاف، يمكن أن تساعد هذه التقنية في توضيح الاختلافات في تفاعلات الخلايا المناعية في بطانة الرحم بين النساء الخصبات والنساء المصابات بجمهورية مقدونيا.
وتم تعيين مجموعتين من النساء من مستشفى أمير ويلز، بما في ذلك نساء مراقبة الخصوبة ونساء أجهضن بشكل متكرر غير مبرر. وعرفت السيطرة على الخصوبة بأنها النساء اللاتي أنجبن ولادة حية واحدة على الأقل دون أي تاريخ من الإجهاض التلقائي، وعرفت نساء جمهورية مقدونيا بأنهن أولئك اللاتي سبقهن أن أجهضن ≥2 حالة متتالية قبل الأسبوع العشرين من الحمل. واستوفيت المواد من المجموعتين معايير الإدراج التالية: (أ) العمر بين 20 و 42 سنة، (ب) غير المدخن، (ج) الدورة الشهرية العادية (25-35 يوما) وبنية الرحم العادية، (د) عدم استخدام أي نظام هرموني لمدة 3 أشهر على الأقل قبل خزعة بطانة الرحم، (ه) عدم وجود هيدروسالبينك عن طريق الهستيرو-سالبينجوغرام. وبالإضافة إلى ذلك، كان جميع المواضيع المعينة karyotyping العادي، طبيعي 3 الأبعاد السونوغرافيا الفائقة hysterosalpingogram، اليوم 2 هرمون تحفيز الجريب < 10 وحدة دولية / لتر، البروجسترون منتصف luteal > 30 نانومول / لتر، وظيفة الغدة الدرقية العادية، واختبار سلبي للذئبة المضادة للتخثر ومضادات الإيغ ديسيلبين IgG وIgM.
لفهم أفضل لأساس المناعة من RM، سيكون من المرغوب فيه للغاية لتحديد وترجمة أنواع الخلايا المناعية الرئيسية الموجودة في بطانة الرحم في وقت الزرع في وقت واحد. تصف هذه الورقة البروتوكول بأكمله من إعداد العينة ، وتحسين تعدد المضاعفات مع علامات للأنواع الفرعية للخلايا المناعية ، ومسح الشرائح ، يليه تحليل البيانات مع إشارة محددة إلى الكشف عن الخلايا المناعية بطانة الرحم. وعلاوة على ذلك، تصف هذه الورقة كيفية تحديد كثافة وتتجمع أنواع الخلايا المناعية في وقت واحد في بطانة الرحم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد وافقت على الدراسة الجامعة الصينية المشتركة بين هونغ كونغ والأقاليم الجديدة لجنة أخلاقيات البحوث السريرية للمجموعة الشرقية. تم الحصول على موافقة مستنيرة من المشاركين قبل جمع خزعات بطانة الرحم. راجع قسم المقدمة لمعايير تضمين مجموعات التحكم و RM.
1. إعداد العينة
- تأكد من أن جميع النساء في هذه الدراسة يخضعن لاختبار عصا تراجع البول اليومية من اليوم 9 من الدورة الشهرية فصاعدا لتحديد ارتفاع هرمون اللوتين (LH) للكشف عن الإباضة، والوقت خزعات بطانة الرحم على وجه التحديد في اليوم7 بعد ارتفاع LH (LH +7).
- الحصول على 0.5 سم2 جزء من خزعة بطانة الرحم باستخدام عينة Pipelle أو بايب ترياق من النساء الخصبات والنساء مع RM غير المبررة. تسمية الحاوية ووضع العينة على الفور في 10٪ محايدة العازلة الفورفورمين (درجة الحموضة 7) لتثبيت بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: يجب أن يكون حجم المثبت 5-10 أضعاف حجم الأنسجة. - ضع الأنسجة في خرطوشة للجفاف في آلة معالجة الأنسجة قبل تضمينها في شمع البارافين المنصهر. تضمين الأنسجة في البارافين في 58-60 درجة مئوية.
- السماح للكتلة البارافين لتبرد بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة. استخدام microtome لتقليم كتل البارافين إلى سمك 3 ميكرومتر.
ملاحظة: استخدام الماء المقطر الإيدز في تركيب الأنسجة السليم والالتزام في جميع أنحاء تلطيخ متعددة. - ضع شريط البارافين في حمام مائي عند 40-45 درجة مئوية لمدة 30 s.
- قم بتركيب المقاطع على شرائح زجاجية مجهرية مغلفة ببولي-إل-ليسين (0.1٪ ث/v). ضع الشرائح مع الأنسجة التي تواجه صعودا والسماح لتجف في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. تخزين الشرائح في مربع الشرائح بعيدا عن درجات الحرارة القصوى حتى مزيد من الاستخدام.
2. تحديد التركيز المثالي للأجسام المضادة لتعدد IHC باستخدام IHC التقليدية.
ملاحظة: هذا مهم لتحديد مستوى التعبير ونمط كل علامة مناعية في عينة بطانة الرحم، وتحديد تسلسل تلطيخ كل علامة وكذلك تضخيم إشارة التيراميد المرتبطة بها (TSA) أزواج الفلوروفور.
- اختبار الأجسام المضادة لملاءمتها لتعدد IHC باستخدام دليل IHCالتقليدية 13.
- استخدم أنسجة بطانة الرحم لاختبار الأجسام المضادة المفردة.
- قم بتضمين عنصر تحكم إيجابي (مثل الطحال) والتحكم السلبي (التحكم في النمط المتساوي) لتحسين حالة تلطيخ كل جهاز مضاد.
- قم بإجراء التلطيخ باستخدام التخفيف الموصى به من قبل ورقة بيانات الأجسام المضادة.
- إجراء تلطيخ إضافية باستخدام تركيزات فوق وتحت تخفيف الموصى بها المستخدمة في الخطوة 2.3.
ملاحظة: يجب على أخصائي علم الأمراض السريري تقييم الشرائح الملطخة بشكل أعمى لتأكيد توطين فحص الأجسام المضادة وسلامة الخلية.
3. طريقة تلطيخ متعددة
- إعداد الشريحة والتثبيت
- وضع الشرائح (من الخطوة 1.6) شقة مع الأنسجة التي تواجه صعودا في الفرن وخبز في 60 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل.
- إزالة الشرائح من الفرن والسماح لهم لتبرد لمدة 20 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة قبل وضعها في رف الشريحة العمودية.
- Dewax وإعادة ترطيب الفورمالين الثابتة ، والشرائح البارافين جزءا لا يتجزأ مع 10 دقيقة المخصصة لكل من الخطوات التالية : xylene (2x) ، 100 ٪ الايثانول (2x) ، 95 ٪ الايثانول (1x) ، 70 ٪ الايثانول (2x) ، والمياه المقطرة (2x).
- ضع حامل الشرائح في صندوق شرائح بلاستيكي واغمرها في محلول ملحي مخزن ب Tris (TBS، درجة الحموضة 7.6).
ملاحظة: يجب أن تظل الشرائح رطبة بدءا من خطوة الإماهة هذه حتى تتصاعد في الخطوة الأخيرة. - إصلاح العينات عن طريق غمر الشرائح في مربع الشريحة البلاستيكية مليئة خليط من الفورمالديهايد المخفف في الميثانول (1:9) لمدة 30 دقيقة في الظلام.
- غسل الشرائح مرتين في الماء deionized لمدة 2 دقيقة ثم انتقل إلى مستضد استرجاع.
- استرجاع Epitope
- ضع حامل الشرائح في صندوق مقاوم للحرارة واملأه بحاجز حمض الستريك (درجة الحموضة 6.0) لتغطية الشرائح.
- ضع الصندوق في الميكروويف، وسخن الشرائح لمدة 50 s في طاقة 100٪ تليها 20 دقيقة في 20٪ من الطاقة للحفاظ على نفس درجة الحرارة.
- السماح للشرائح لتبرد لمدة 15 دقيقة تقريبا في درجة حرارة الغرفة.
- شطف الشرائح في الماء لمدة 2 دقيقة تليها TBS-توين 20 (TBST) لمدة 2 دقيقة.
ملاحظة: TBST يتكون من 25 mM تريس-HCl (pH 7.5) و 150 mM NaCl و 0.05٪ توين 20 (v/v).
- حظر
- منع نشاط البيروكسيديز الذاتية في الأنسجة عن طريق غمر الشريحة على جرة تحتوي على محلول حجب البيروكسيداز (انظر جدول المواد)لمدة 10 دقائق.
- اغسل الشرائح باستخدام TBST لمدة 5 دقائق.
- استخدم قلم حاجز مسعور لوضع علامة على حدود حول قسم الأنسجة على الشريحة.
- تغطية أقسام الأنسجة مع عازلة حجب (انظر جدول المواد)أو الألبومين مصل البقري (5٪، ث / الخامس)، واحتضان الشرائح في غرفة رطبة لمدة 15 دقيقة.
- الأجسام المضادة وتطبيق الإشارة
- إزالة الكواشف الحجب.
- احتضان مع الأجسام المضادة الأولية ذات الفائدة (على سبيل المثال، CD3، 1:100 تخفيف في مخفف الأجسام المضادة، انظر الجدول 1)في غرفة رطبة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
- إزالة الأجسام المضادة الأساسية. اغسل 3x مع TBST لمدة 5 دقائق في كل مرة.
- احتضان مع البوليمر الفجل peroxidase (HRP) المسمى الأجسام المضادة الثانوية (الجدول 1) لمدة 15 دقيقة في غرفة رطبة في درجة حرارة الغرفة. اغسل 3x مع TBST لمدة 5 دقائق في كل مرة.
- تطبيق محلول العمل أوبال فلوروفور TSA (1:100 في التضخيم الذوبان) واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة للسماح اقتران الفلوروفوري لعينة الأنسجة في المواقع الأساسية ملزمة الأجسام المضادة. يغسل مع TBST في ثلاثة ملاعق لمدة 5 دقائق في كل مرة.
- تجريد قائم على الميكروويف
- شطف مع المخزن المؤقت استرداد مستضد (محلول العازلة سيترات، pH 6.0).
- إجراء تجريد قائم على الميكروويف لإزالة مجمع HRP الثانوي الأولي لإدخال الأجسام المضادة الأولية التالية (على سبيل المثال، CD20).
- ضع الشرائح في مخزن استرجاع المستضد ، وميكروويفها في طاقة 100٪ لمدة 50 s تليها طاقة 20٪ لمدة 20 دقيقة في حاويات آمنة بالميكروويف ، وتبريدها في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
- كرر الخطوات 3.2.4 إلى 3.5.2 حتى يتم فحص عينات الأنسجة مع جميع الأجسام المضادة الأولية.
- مكافحةوstain وتصاعد
- بعد تجريد الميكروويف والتبريد من العازلة استرجاع مستضد، شطف الشرائح في الماء المقطر وTBST.
- احتضان مع 4'، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) حل (1.0 ميكروغرام / مل) لمدة 5 دقائق في غرفة رطبة في درجة حرارة الغرفة.
- اغسل 3x مع TBST لمدة 5 دقائق في كل مرة. يغسل بالماء مرة واحدة لمدة 5 دقائق.
- الهواء الجاف الشريحة وجبل مع المتوسطة تركيب المناسبة (انظر جدول المواد).
ملاحظة: لن تكون مطلوبة مكافحة الاحتواء لشرائح أحادية اللون لاستخدامها لتطوير مكتبة الطيفية.
4. الصورة والتحليل
- إعداد شرائح المكتبة الطيفية
- إنشاء شرائح المكتبة (صور مرجعية أحادية البقعة) لكل مضان، DAPI، وفلورسينس التلقائي مع نفس نسيج التحكم لتحليل الصور متعددة الأطياف.
- باستخدام الشرائح من عينات خزعة بطانة الرحم من النساء مع جمهورية مقدونيا والنساء الخصبة، وتنفيذ الخطوات 1.1 إلى 3.6.4 للكشف عن الأجسام المضادة واحد لكل شريحة (دون مزيد من الأجسام المضادة أو إضافة الفلوروفور).
- لكل اكتشاف الأجسام المضادة، وصمة عار واحدة من الشرائح مع DAPI (كما هو الحال في الخطوة 3.6.2) وترك شريحة واحدة غير ملطخة للكشف عن أي أنسجة ممكنة السيارات مضان في الطيف.
- استخدم عوامل التصفية المناسبة في محطة العمل للحصول على صورة لهذه المجموعة من الشرائح لكل جهاز مضاد وتحميلها في مكتبة تحليل الصور (كما هو موضح في الخطوة 4.2).
- بمجرد التقاط الصورة، حدد inForm كمصدر مكتبة طيفية وبناء المكتبة الطيفية.
- كما يتم استخدام الفلوروفوريس، حدد البقع / الفلور... من القائمة.
- أثناء اختيار البقع أو الفلوروفوريس، قم بتضييق الخيارات عن طريق اختيار مجموعة واحدة أو أكثر. حدد الكل لإظهار جميع الأطياف المتوافقة مع الصور.
- التصوير الطيفي
ملاحظة: تم التقاط الصور باستخدام محطة عمل Mantra مع مكتبة طيفية تم إنشاؤها باستخدام برنامج inForm Image Analysis.- التقط صورة الشرائح ذات اللون الواحد الملون بالأجسام المضادة باستخدام مرشحات الفلورسينس المناسبة كما هو مقترح في الجدول 2 (على سبيل المثال، DAPI وفلوريسسين إيزوثيوسيانات [FITC] وCY3 وتكساس ريد وCY5) باستخدام محطة العمل.
ملاحظة: يتم عرض الفلاتر الموصى بها للفلوروفوريس المحدد المستخدم في هذا البروتوكول في الجدول 2. - تحديد وقت التعرض المناسب للإشارة المثلى من خلال فحص كل علامة في قناة الفلورسينس المقابلة لها.
ملاحظة: يتم تحديد الإشارة المثلى وفقا للرجوع إلى الإيجابية والتوطين التي تم الحصول عليها في تلطيخ الأجسام المضادة المفردة. - تحديد وقت التعرض الثابت لكل تحليل (تركيبة الفلوروفور المضادة) لتوحيد المقارنة بين العينة.
ملاحظة: يعتمد تحديد التعرض الثابت على كثافة عينة المصالح. - مسح الشرائح الملون متعددة في وضع المسح الضوئي المناسب باستخدام خوارزمية التركيز البؤري التلقائي المضمنة.
ملاحظة: ستستخدم المكتبة الطيفية المنشأة لتمييز مكعب الصور متعدد الأطياف إلى مكونات فردية واحدة (الطيز الطيفي). وهذا من شأنه أن يسمح بمعالجة التعريف المستند إلى اللون لجميع العلامات ذات الأهمية باستخدام الخطوتين الرئيسيتين التاليتين: دورة تدريبية وجلسة تحليل للصور.
- التقط صورة الشرائح ذات اللون الواحد الملون بالأجسام المضادة باستخدام مرشحات الفلورسينس المناسبة كما هو مقترح في الجدول 2 (على سبيل المثال، DAPI وفلوريسسين إيزوثيوسيانات [FITC] وCY3 وتكساس ريد وCY5) باستخدام محطة العمل.
- تحليل الصور
- عد الخلايا لأنواع مختارة من الخلايا المناعية في بطانة الرحم
- التقاط ما لا يقل عن 10 حقول للتحليل تحت التكبير 200x.
ملاحظة: تم التقاط الحقول بواسطة مسح المقطع بأكمله دون أي تحديد. وهذا يمكن أن يضمن التقاط المتزامنة لجميع مكونات الخلية من بطانة الرحم, على سبيل المثال, الحدود الظهارية مضيئة, ستروما, والغدد. - لحساب الخلايا، انقر فوق الزر عدد الكائنات في شريط الخطوات لعرض لوحة إعدادات عد الكائنات.
- تحقق من المربع تجاهل الكائن إذا لمس حافة لاستبعاد أي كائنات لمس حافة الصورة أو منطقة العملية أو منطقة الأنسجة.
- إذا تم تقسيم الأنسجة، حدد فئة الأنسجة التي توجد فيها الكائنات. لا تحسب الكائنات خارج فئة الأنسجة المحددة.
- حدد النهج المطلوب لتعريف الكائنات: كائن-يستند أو بكسل-أساس (عتبة).
ملاحظة: يجب تحديد نهج المستندة إلى بكسل (عتبة) في حالة وصمة عار موثوقة أو متناسقة لتطبيق عتبة بسيطة سوف تسفر عن بكسل الكائن. يوصى بالنهج القائم على الكائن عندما تكون هناك حاجة إلى نهج أكثر تقدما تستند إلى علم المورفوميتريا في حالة عدم الاتساق وخصوصية تلطيخ الكائنات. - حدد تحجيم الإشارةالمطلوب: مقياس تلقائي أو مقياس ثابت.
ملاحظة: سيؤدي اختيار المقياس التلقائي إلى التحجيم التلقائي لكل مستوى مكون قبل إجراء تجزئة الكائن. يوصى بخيار المقياس الثابت عند الحاجة إلى أداء تجزئة أفضل، كما أن إشارات البقع متسقة وموثوقة. - حدد المكون الأساسي لتقسيم الكائن من القائمة المنسدلة.
- ضبط قيمة الإشارة الدنيا للمكون الأساسي إلى قيمة العتبة المطلوبة.
- لملء الثقوب تلقائيا في الكائنات، حدد ملء الثقوب.
- للكشف عن الكائنات التي تلمس كائنات أخرى ككائنات فردية، بدلا من كائن واحد، حدد خانة الاختيار تحسين التقسيم بعد تحديد خانة الاختيار الحد الأقصى للحجم (بكسل).
- لاستبعاد الكائنات استنادا إلى استدارة الكائن، تحقق من المربع Roundness وحدد الحد الأدنىالمطلوب من التعميم .
- عد جميع الخلايا السترومالية (CD3-/ CD20-/ CD68-/ CD56-، وDAPI+) ، بما في ذلك الخلايا المحيطة بالأوعية الدموية.
- عد الخلايا المناعية بشكل منفصل، بما في ذلك الخلايا التائية (CD3+ و DAPI+)، الخلايا B (CD20+ و DAPI+)، الضامة (CD68+ و DAPI+)، وخلايا UNK (CD56+ و DAPI+).
- التعبير عن البيانات كنسب مئوية من الخلايا المناعية بالنسبة إلى العدد الإجمالي للخلايا سترومال لكل صورة تم التقاطها، والإبلاغ عن عدد الخلايا النهائي كمتوسط لجميع المجالات.
- استخدم محرر طريقة العرض لعرض معالجة ترحيل جداول البيانات الناتجة. تصدير جدول "بيانات العد".
- القياس الكمي للتوزيع المكاني للخلايا المناعية بطانة الرحم
- تحت التكبير 200x، وتقدير وظيفة L باستخدام برنامج R لنطاق من 0-20 ميكرومتر تعتبر اتصال الخلية الخلية القصوى المسافة14.
ملاحظة: تم استخدام مربع أدوات اللغة R 'spatstat' لقياس الدالة L.- تشير إلى مستوى تجمع أزواج مختلفة من الخلايا المناعية على أساس المنطقة تحت منحنى (AUC) من وظيفة L بهم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تظهر العملية التخطيطية الشاملة لإجراء فحص متعدد الألوان من 4 ألوان للكشف عن 4 أنواع من الخلايا المناعية بطانة الرحم في الشكل 1. باختصار، يتطلب بروتوكول تلطيخ المناعة المتعدد هذا 8 خطوات رئيسية: 1. إعداد الشريحة، 2. استرجاع Epitope، 3. الحجب، 4. تطبيق الأجسام المضادة الأولية، 5. تطبيق الأجسام المضادة الثانوية، 6. تضخيم الإشارات، 7. إزالة الأجسام المضادة، و 8. مضاد للنضد وتركيب. ثم تم إجراء تقديم الصور وتحليلها باستخدام محطة عمل Mantra مع المكتبة الطيفية التي تم إنشاؤها باستخدام برنامج تحليل الصور inForm للتمييز بين أنواع الخلايا المناعية 4 في عينة بطانة الرحم(الشكل 2).
يمكن تحديد أربعة أنواع من الخلايا المناعية بطانة الرحم في عينات بطانة الرحم البشرية باستخدام تقنية تلطيخ متعددة المضاعفات هذه: خلايا CD3 + T ، خلايا CD20 + B ، الضامة CD68 + ، وخلايا CD56 + uNK (الشكل 3). ومع ذلك، يجب النظر بعناية في تداخل الفلوروفور للحصول على صورة واضحة وقابلة للاستخدام. على الرغم من أن هذه التكنولوجيا متعددة الأطياف باستخدام محطة عمل مانترا يمكن أن تدعم ما يصل إلى 8-plex المقايسات، وتطبيق 4 الفلوروفوريس المستخدمة في هذا البروتوكول أظهرت الأداء الأمثل دون تدخل الفلوروفور بسبب الاختلافات في أطياف الانبعاثات من الفلوروفوريس. وعلى النقيض من ذلك، فإن تلطيخ المضاعفات المتعددة الذي ينطوي على 5-8 فلوروفوريس غالبا ما يتطلب المزيد من الاهتمام تجاه تداخل الفلوروفور الناتج عن الانبعاثات من الأطوال الموجية المشتركة.
للتغلب على هذا العيب، سيكون من الضروري تلطيخ أحادية لتحديد ترتيب كل الأجسام المضادة في تعدد وتحديد مستوى التعبير ونمط كل علامة المناعة في عينة بطانة الرحم. وهذا يمكن أن يساعد على تحديد تسلسل تلطيخ علامات وأزواج الفلوروفور TSA المرتبطة بها. بمجرد الانتهاء من فحص monoplex لتحديد ترتيب الأجسام المضادة التي سيتم تطبيقها ، ستكون الخطوة التالية هي اختيار الفلوروفور للكشف عنه بعد تلطيخ متعدد المضاعفات. يجب اختيار الفلوروفور الفريد لكل شخص مضاد مهم. وسيكون العدد المتعلق بكل فلوروفور تقريبا الطول الموجي الفلوري المنبعث أثناء الإثارة(الجدول 1 والجدول 2). أحد النهج لمنع تداخل الفلوروفور هو اختيار أزواج الفلوروفور ذات الأطوال الموجية بعيدا عن بعضها البعض قدر الإمكان (خاصة بالنسبة للأجسام المضادة المشاركة في التوطين). وهذا يمكن أن يساعد في الحد من التداخل الطيفي الزائد وتوفير صورة هشة وphenotyping أكثر موثوقية. وعلاوة على ذلك، فإن التقييم الدقيق عن طريق تشغيل وإيقاف أشعة الليزر من الصورة المركبة متعددة المضاعفات في برنامج inForm يمكن أن يساعد أيضا في التعرف على أنماط التلطيخ لتقليل تشبع الفلوروفوري(الشكل 4).
لتحليل الصور، يمكن حساب عدد خلايا CD3+ T وCD20+ B والخلايا CD68+ الضامة وCD56+ خلايا uNK والخلايا النجمية في ستروما بطانة الرحم (CD3-/ CD20-/ CD68−/ CD56- وDAPI-stained) تلقائيا باستخدام برنامج الباحث عن الأنسجة في 14.0 (الشكل 5). تم التعبير عن كل كثافة نوع الخلية المناعية كنسبة مئوية بالنسبة إلى العدد الإجمالي للخلايا سترومال(الشكل 5). وبالمثل، استند القياس الكمي للتوزيع المكاني للخلايا المناعية بطانة الرحم على موقف X و Y من كل خلية مناعية واحدة تم الحصول عليها من نظام InForm (الشكل 6). باستخدام R-اللغة، يمكن بعد ذلك تمييز مستوى التجمع من أزواج مختلفة من الخلايا المناعية على أساس AUC.
الشكل 1: رسم تخطيطي لسير العمل تلطيخ. المختصرات: BSA = ألبوم مصل البقر؛ HRP = الفجل البيروكسيداز. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: محطة عمل لالتقاط الصور وتحليلها. (أ) محطة عمل التصوير تعويذة، (ب) صورة الطيفية غير المجهزة،(C)صورة مركبة،(D)تجزئة الأنسجة (المقصورات الظهارية والسترومال)،(ه) صورة مركبة من أنسجة بطانة الرحم تظهر أربع علامات ملونة لتحديد مجموعات الخلايا المختلفة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: التصوير الطيفي. تم إجراء متعددة المناعة من 4 أنواع مختلفة من الخلايا المناعية على خزعات بطانة الرحم من (أ) امرأة التحكم الخصبة و (ب) امرأة مع RM غير المبررة كما قدم التصوير متعدد الأطياف واحد. بعد إنتاج مكتبة واحدة ملطخة، يمكن أن تكشف الطيفية unmixing التصوير من الفلوروفوريس واحد يمثل (C) CD3، (D) CD56، (E) CD68، (F) CD20، (G) DAPI. ثم تم إنشاء صورة مركبة عن طريق دمج جميع الفلوروفوريس بعد التصوير متعدد الأطياف (H). أشرطة المقياس = 50 ميكرومتر(A، B). المختصرات: LE = ظهارة مضيئة؛ DAPI = 4′,6-دياميدينو-2-فينيليندول; RM = الإجهاض المتكرر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: أداة العد InForm. يتم تنشيط أداة تعداد البرامج inForm عن طريق تحديد رمز المربع البيج (المشار إليه من قبل ↓ ). (أ) إعداد الصورة ، (ب ، ج) تقسيم الأنسجة للتدريب باليد والأتمتة ،(د)تقسيم الخلايا الفردية ،(ه)phenotyping الخلايا على أساس كثافة الفلوروفور ،(واو)تحليل لكثافة الفلوروفور (المربع الأحمر تبين عدد الخلايا الإيجابية في كثافة الفلوروفورية المختارة) ، و (G) تصدير النتائج للاستخدام (المربع الأحمر يشير إلى خيارات التصدير). اختصار: IHC = الكيميائي المناعي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: عدد الخلايا . (أ) Phenotyping من الخلايا لحساب الخلايا التلقائي و (ب) إخراج الخلايا الملطخة إيجابيا في المنطقة المجزأة (على سبيل المثال، سترومال) لمزيد من المقارنة والتحليل الإحصائي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: قياس الكثافة المكانية. (أ) الكشف التلقائي عن موضع الخلايا المناعية الملطخة بشكل إيجابي في المنطقة المجزأة (على سبيل المثال، سترومال)،(ب)عرض إخراج تنسيق كل CD20 + الخلية المناعية الملطخة بشكل إيجابي، و (C) تحديد الكثافة المكانية والتوطين بين CD20+ الخلايا والخلايا المناعية الأخرى في مناطق الأنسجة المجزأة باستخدام سباستات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| ترتيب | جسم | استنساخ | كلونالييتي | عامل تمييع الأجسام المضادة | أوبال | عامل تمييع أوبال |
| 1 | CD3 | SP7 | أحادي النسيلة | 1 في 100 | أوبال 620 | 0.111111111 |
| 2 | CD20 | L26 | أحادي النسيلة | 1 في 100 | أوبال 650 | 0.215277778 |
| 3 | CD68 | SP251 | أحادي النسيلة | 1 في 100 | أوبال 520 | 0.111111111 |
| 4 | CD56 | CD564 | أحادي النسيلة | 1 في 100 | أوبال 690 | 0.111111111 |
الجدول 1: قائمة بالأجسام المضادة والحيوانات المستنسخة والتركيزات المستخدمة.
| صبغ | الحد الأقصى للإثارة (نانومتر) | الحد الأقصى للانبعاثات (نانومتر) | الكشف المتوقع في مجموعة عوامل التصفية (الاسم) | اللون المتوقع |
| DAPI | 350 | 470 | DAPI | أزرق |
| أوبال 520 | 494 | 525 | FITC | أخضر |
| أوبال 620 | 588 | 616 | Cy3 وتكساس الأحمر | كهرمان |
| أوبال 650 | 627 | 650 | تكساس ريد وCy5 | برتقالي |
| أوبال 690 | 676 | 694 | تكساس ريد وCy5 | واضح |
الجدول 2: قائمة الفلوروفوريس بأطوالها الموجية القصوى للإثارة والانبعاثات، والكشف المتوقع في مجموعات المرشحات المناسبة، والألوان التي يمكن ملاحظتها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الخطوات الهامة داخل البروتوكول
من المهم ملاحظة أن تلطيخ متعددة يتطلب التحسين الدؤوب. يتطلب استرجاع المستضد ، باستخدام تقنية التخزين المؤقت والميكروويف ، التحسين لضمان تجريد الأجسام المضادة الكاملة والحفاظ على صلاحية الأنسجة. كما الكواشف TSA ربط بشكل متناقض إلى المواقع المحيطة مستضد، فإنها يمكن أن تمنع يحتمل أن تمنع ربط الأجسام المضادة الأولية اللاحقة من خلال عائق steric (المعروف أيضا باسم "تأثير مظلة"). هذا يميل إلى أن يحدث عندما علامات المناعة متعددة يقيمون في مقصورة خلية واحدة وتسبب تدخل الفلوروفور. لتحديد ما إذا كان سيكون هناك تأثير، سيكون من الأهمية بمكان إجراء أحادية المستوى IHC/IF مسبقا لتحديد أي تداخل في توطين الخلايا المناعية. وبما أن تلطيخ عينة واحدة سيكون مطلوبا لتوليد المكتبة الطيفية، يمكن لمكتبات الأطياف التي تم التحقق من صحتها أن تسهل التمييز بين الإشارات الفردية لزيادة منع تداخل الفلوروفور. إذا لزم الأمر، يمكن تعديل تركيزات الأجسام المضادة الأولية وأوقات الحضانة، والاقتران بين الفلوروفوري والأجسام المضادة، وتركيزات الفلوروفور TSA، وترتيب التلطيخ لتقليل تداخل الفلوروفور. وبالمثل، من المهم تحقيق التوازن الصحيح بين تركيزات HRP من أجل منع تشكيل TSA dimer. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق المعايرة من الأجسام المضادة الأولية والثانوية. وعلاوة على ذلك، من الأهمية بمكان أن نتذكر أن تركيزات وأوقات حضانة الأجسام المضادة الأولية المستخدمة لتلطيخ متعدد قد تختلف عن تلك المستخدمة في تلطيخ واحد كروموجينيك التقليدية. وبالتالي ، ينبغي أن يتم تحديد تركيز وترتيب الأجسام المضادة للتقدم بطلب للحصول على تلطيخ متعدد مسبقا.
التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها
في هذه الدراسة، قمنا بتوظيف تلطيخ الخلايا المناعية الكهستوية متعددة الفلورسينست للكشف في وقت واحد عن تفاعل أربعة أنواع رئيسية من الخلايا المناعية في خزعات بطانة الرحم من النساء مع وبدون جمهورية مقدونيا. تستخدم هذه التقنية الأجسام المضادة ضد CD3 للخلايا التائية، وCD20 للخلايا B، وCD68 لل الضامة، وCD56 لخلايا uNK للتمييز بين أنواع الخلايا هذه. وبناء على هذه الطريقة، وجدنا أن متوسط CD3+، CD68+، و CD56+ قيم كثافة الخلية في النساء جمهورية مقدونيا كانت أعلى بكثير من تلك التي من الضوابطالخصبة 15. كان التجمع بين خلايا CD56+ uNK وCD68+ الضامة أعلى بكثير في مجموعة RM منه في عناصر التحكم الخصبة. وبالإضافة إلى ذلك، كشف استخدام هذه الطريقة أن خلايا CD56+ uNK يبدو أن لها ارتباط عددي ومكاني مع الضامة CD68+ في كلتا المجموعتين من النساء. في المقابل، خلايا CD56+ uNK لها ارتباط عددي كبير ولكن ليس المكاني مع خلايا CD3+ T في النساء مع RM15. تحدد هذه الطريقة أيضا العلاقة المكانية لأنواع متعددة من الخلايا المناعية في بطانة الرحم. ومع ذلك، الإيجابية لعلامة محددة يمكن أن تكون الحد في بعض الحالات. للتغلب على هذه المشكلة، فمن المستحسن أن تشمل السيطرة الإيجابية والسيطرة السلبية لتحديد عتبة الإيجابية عند بناء المكتبة الطيفية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يساعد التقييم الدقيق عن طريق تشغيل الليزر وإيقافه من الصورة المركبة المتعددة في برنامج inForm أيضا في التعرف على أنماط التلطيخ لتقليل تشبع الفلوروفور.
قيود هذه التقنية
تحديد التداخل الفلوري أثناء تفسير البيانات أمر ضروري للتمييز بين التكبر الحقيقي للعلامات والتحف غير المطلقة. تستخدم منهجية تلطيخ متعددة المضاعفات هذه الكواشف المستندة إلى TSA مدفوعة بالتضخيم الأنزيمي ، مما قد يعزز كثافة علامة المستضد بمقدار 10-100 مرة مقارنة بأساليب IF التقليدية غير المباشرة. وهذا يولد خطر ترسب التيراميد مفرط النشاط، مما قد يؤدي إلى تأثير مظلة و / أو إشارة نزيف من خلال. لتحديد الإفراط في الاحتواء، يمكن تقييم مستويات الإشارة بصريا من خلال الصور غير المهولة في شكل وتحوم المؤشر فوق مناطق مشرقة وإيجابية في صورة أنسجة متعددة. وينبغي أن تظل مستويات الإشارة عادة أقل من 30 وبشكل مثالي ضمن عامل 3 من بعضها البعض، وخاصة بالنسبة للفلوروفورات المجاورة الطيفية. يمكن أن تؤدي الاختلافات التي تزيد عن 5 أضعاف في الإشارات للفلوروفورات المجاورة الطيفية إلى تداخل الفلوروفور وتسبب قطعا أثرية لا تفوت. إذا أظهرت مستويات الإشارة لأي فلوروفور أكثر من 3 أضعاف الفرق من الفلوروفور المجاور، يجب تعديل تركيزات فلوروفور TSA لتحقيق توازن الإشارة. وبمجرد التأكد من أن الإشارة في النطاق الصحيح، ينبغي الحفاظ على نسبة الإشارة إلى الخلفية عند <1:10 لضمان عدم الكشف عن التلطيخ الإيجابي زورا من الخلفية غير المحددة.
وبما أن الحديث الطيفي المتبادل يمكن أن يخلق أيضا تداخلا كبيرا في الفلوروفور، يجب تعديل ترتيب التلطيخ لفصل الأصباغ المتاخمة الطيفية في كل من التسلسل والتعبير عن العلامات. على الرغم من أن هذه التكنولوجيا متعددة الأطياف باستخدام محطة عمل مانترا تدعم ما يصل إلى 8-plex المقايسات، وتطبيق 4 الفلوروفوريس، وهي أوبال 520، 540، 620، و 690، يدل على أفضل أداء دون تدخل الفلوروفور. غالبا ما يتطلب استخدام الفلوروفور ≥5 المزيد من التحسين والتحقق لتجنب الكلام الطيفي المتقاطع بسبب الملامح الطيفية للفلوروفوريس التي تشترك في أطوال موجية قريبة. وبعبارة أخرى، فإن عدد الأهداف التي يمكن اكتشافها في وقت واحد من خلال هذا النهج محدود فقط بعدد نطاقات الطول الموجي ومجموعات مرشح الإثارة/الانبعاثات المتاحة. وبالتالي ، لاستبعاد احتمال الإفراط في فلوروفور TSA الذي يمنع المزيد من تطبيق الفلوروهورات TSA الأخرى و / أو لتحديد إشارة تبادلية ، فمن الضروري أن تكون دقيقة عن طريق تشغيل وإيقاف طبقات من الصورة المركبة متعددة في برنامج inForm ؛ تفسير أنماط تلطيخ من تلطيخ IHC واحد بشكل صحيح؛ وتبحث عن خسارة واضحة، كسب، أو إشارات متطابقة في مستوى واحد المقابلة لتوطين في طائرة أخرى.
يتطلب التلطيخ متعدد الأطياف أجساما مضادة مقترنة بفلوروفورات محددة للكشف في وقت واحد عن علامات متعددة. يتبع هذا الاقتران بالفلوروفوري-الأجسام المضادة قاعدتين: 1) يجب أن تكون الفلوروفوريس المخصصة للعلامات التي يتم التعبير عنها بشكل مشترك متباعدة بشكل طيفي ، و2) يجب إقران الأهداف الأكثر وفرة بالفلوروفورات ذات السطوع الأقل أو العكس بالعكس. كما يجب ترتيب ترتيب التلطيخ بحيث لا تشارك الأجسام المضادة المتتابعة في التعريض في نفس مقصورات الخلايا في الخلايا الملطخة. لذلك ، بخلاف تركيزات الأجسام المضادة وأوقات الحضانة ، والتي هي عوامل حاسمة في طرق التلطيخ التقليدية ، يجب النظر في المعلمات الإضافية ، مثل الاقتران المناسب بالفلوروفوري والأجسام المضادة ، وتركيزات الفلوروفوري TSA ، وتسلسل التلطيخ ، والتعرض لأجسام مضادة محددة لعلاج واحد أو أكثر من علاجات الميكروويف ، لتلطيخ متعدد ناجح. ونظرا للتباين الكبير في عينات الدراسة، قد لا يولد بروتوكول متعدد المضاعفات نفس النتيجة في أنواع أخرى من عينات الدراسة.
يمكن أن تستغرق عملية تلطيخ أوبال المتعددة المتتالية من يوم إلى عدة أيام اعتمادا على عدد العلامات المشاركة في اللوحة وأوقات حضانة الأجسام المضادة الأساسية. في المقابل، تسمح أساليب IF القياسية عادة بتصور علامات 4-5 في جولة واحدة من التلطيخ. وتجدر الإشارة إلى أن الظروف الأمثل باستخدام الطريقة التقليدية IHC تحتاج إلى مزيد من التحسين قبل الشروع في إجراءات تلطيخ متعددة، والتي تنطوي على علاجات إضافية متعددة الميكروويف، وتطبيق الفلوروفوريس TSA التي سوف تؤثر في نهاية المطاف على كثافة تلطيخ كل الأجسام المضادة. وفي الوقت الراهن، قد تتطلب نهج التصوير التي تستخدم تكنولوجيات متعددة الأطياف أجهزة مكلفة ومخصصة. بالإضافة إلى ذلك، قد يقتصر فقط على المناطق التي تم اختيارها بالصور. وبالتالي، قد لا يكون هذا هو الأمثل للمختبرات ذات الموارد المحدودة والكشفية من الأنسجة مع أهداف مستضد غير مؤكد.
الأهمية فيما يتعلق بالأساليب القائمة
قوة خاصة من هذه الطريقة الحالية هي القدرة على قياس كثافة أنواع الخلايا المناعية المتعددة في بطانة الرحم في وقت واحد على عكس طرق IHC التقليدية التي يمكن أن تسمية نوع واحد فقط إلى نوعين من الخلايا في قسم واحد من الأنسجة. قياس التدفق الخلوي هو طريقة أخرى يمكن أن تحلل النسب النسبية لأنواع الخلايا المناعية المختلفة في عينة بطانة الرحم. ومع ذلك، فإنه لن يكون قادرا على توفير المعلومات المكانية بين أنواع مختلفة من الخلايا المناعية والتوزيع المحدد داخل مقصورات بطانة الرحم المختلفة. وعلاوة على ذلك، يشكل استنفاد الأنسجة مصدر قلق بالغ في الممارسة السريرية، وخاصة أثناء التجارب السريرية وعند استخدام عينات الخزعة. تتطلب هاتان الطريقتان التقليديتان عددا كبيرا من العينات (إما أقسام أو خلايا) لتحسين الإجراء والكشف عن أنواع متعددة من الخلايا المناعية في بطانة الرحم للنساء ذوات جمهورية مقدونيا وبدونها.
كما هو موضح في هذا البروتوكول، تم تصميم سير عمل أوبال للكشف عن ما يصل إلى سبع علامات في نفس قسم الأنسجة باستخدام محطة عمل مانترا. بالإضافة إلى ذلك ، فإن التفاعل المتبادل بين الأنواع أثناء اختيار الأجسام المضادة ليس قيدا على هذه التكنولوجيا. في الواقع ، ميزة هذه التكنولوجيا هي أنها تسمح باستخدام الأجسام المضادة التي أثيرت في نفس النوع للكشف عن ما يصل إلى سبع علامات. يتضمن هذا النهج الكشف عن الكواشف الفلورية TSA تليها معالجة الميكروويف لإزالة أي تلطيخ غير محدد. بعد تجريد القائم على الميكروويف، يمكن بعد ذلك إجراء جولة أخرى من تلطيخ للكشف عن هدف إضافي دون خطر التفاعل عبر الأجسام المضادة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن إجراء طريقة الكشف TSA هذه في ما لا يقل عن 3 أيام للجمع بين ما يصل إلى 7 فلوريكروم مع الاستمرار في تحقيق نتائج موثوقة للكشف عن أهداف البروتين منخفضة التعبير. ميزة أخرى من تلطيخ متعددة على الدراسة التقليدية IHC هو تعزيز كفاءته كما هو الآلي القياس، والتي يمكن القضاء على التحيز الذاتي. وتمثل البيانات الكمية التي تم إنشاؤها النتائج النهائية للمقاهى.
التطبيقات المستقبلية
نطاق تطبيق هذا البروتوكول متعدد المضاعفات هائلة. الأهم من ذلك ، هذه هي الورقة الأولى لوصف طريقة الكشف عن التعبير علامة immunofluorescence متعددة المضاعفات باستخدام محطة عمل مانترا وتحليل الصور باستخدام برنامج InForm 2.2.1 لتوفير نتائج دقيقة وقابلة للاستنساخ في التفريق بين مجموعات متعددة من الخلايا المناعية في النساء مع وبدون RM. الأهم من ذلك ، يمكن أن يوفر توطين أهداف متعددة في نفس قسم الأنسجة نظرة فريدة في تفاعلاتها الخلوية. في نهاية المطاف، سيؤدي هذا إلى فهم أفضل للبيئة الدقيقة للخلية المناعية أثناء زرع الجنين لدى النساء المصابات بجمهورية مقدونيا لإنشاء علاج محدد مستهدف.
وعلاوة على ذلك، ساعدت أساليبنا الحالية لإثبات أن العديد من الخلايا المناعية وتفاعلاتها قد تكون مهمة لوظيفة بطانة الرحم. ويظهر ذلك من خلال التغيرات الكبيرة في كثافة ثلاثة من أصل أربعة أنواع من الخلايا المناعية بطانة الرحم وزيادة كبيرة في التجمع بين خلايا CD68 + و CD56 + . على العكس من ذلك ، قد تكون التفاعلات غير الطبيعية لهذه الأنواع من الخلايا المناعية عوامل مهيأة ل RM. الأهم من ذلك ، على عكس الكشف عن نوع فرعي واحد من الخلايا المناعية بطانة الرحم ، يمكن أن يوفر تطبيق هذا التلطيخ متعدد IHC فهما متعمقا للتنظيم المناعي لزرع الجنين. بالإضافة إلى ذلك، قد يساعد القياس الكمي والفهم الإضافي للسمات المكانية في البيئة الدقيقة المناعية في تسليط الضوء على بيولوجيا هذا المرض في سياق العلاجات المناعية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لديهما تضارب في المصالح يكشفان عنه.
Acknowledgments
وقد دعم هذه الدراسة الصندوق الاستئماني لأمراض النساء والتوليد في هونغ كونغ في عام 2018 وصندوق هونغ كونغ للصحة والبحوث الطبية (06170186، 07180226).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amplification Diluent | Perkin Elmer | FP1498 | Fluorophore diluent buffer |
| Antibody diluent | Perkin Elmer | ARD1001EA | Diluting the antibody |
| CD3 | Spring Bioscience | M3072 | Primary antibody |
| CD20 | Biocare Medical | CM004B | Primary antibody |
| CD56 | Leica | NCL-CD56-504 | Primary antibody |
| CD68 | Spring Bioscience | M5510 | Primary antibody |
| Citrate Buffer Solution, pH 6.0 (10x) | Abcam | AB64214 | Antigen retrieval solution |
| EMSURE Xylene (isomeric mixture) | Merck | 108297 | Dewaxing |
| Ethanol absolute | Merck | 107017 | Ethyl alcohol for rehydration |
| HistoCore BIOCUT Manual Rotary Leica Microtome | Leica | RM2125RTS | Sectioning of paraffin-embedded tissue |
| inForm Advanced Image Analysis Software | Perkin Elmer | inForm® Tissue Finder Software 2.2.1 (version 14.0) | Data Analysis software |
| Mantra® Workstation | Akoya Biosciences | CLS140089 | Spectral imaging |
| Microwave | Panasonic | Inverter | Microwave stripping |
| Opal 520 | Perkin Elmer | FP1487A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 620 | Perkin Elmer | FP1495A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 650 | Perkin Elmer | FP1496A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 690 | Perkin Elmer | FP1497A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Oven | Memmert | U10 | Dewaxing |
| Peroxidase Blocking Solution | DAKO | S2023 | Removal of tissue peroxidase activities |
| Poly-L-lysine coated slide | FISHER SCIENTIFIC | 120-550-15 | Slide for routine histological use |
| PolyHRP Broad Spectrum | Perkin Elmer | ARH1001EA | Secondary antibody |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant | ThemoFisher Scientific | P36930 | Mounting |
| Spatstat | / | Version 2.1-0 | Spatial point pattern analysis |
| Spectral DAPI | Perkin Elmer | FP1490A | Nucleic acid staining |
| Tissue Processor | Thermo Fischer | Excelsior ES | Tissue processing for dehydration and paraffination |
| Tris Buffer Saline (TBS), 10x | Cell Signaling Technology | 12498S | Washing solution |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1370-1L | Nonionic detergent |
References
- ESHRE Guideline Group on RPL et al. ESHRE guideline: recurrent pregnancy loss. Human Reproduction Open. 2018 (2), 004 (2018).
- Stirrat, G. M.
- Rai, R., Regan, L.
- Royal College of Obstetricians & Gynaecologists. The investigation and treatment of couples with recurrent first-trimester and second-trimester miscarriage. Green-top Guideline No. 17. Royal College of Obstetricians & Gynaecologists. , (2011).
- King, A.
- Le Bouteiller, P., Piccinni, M. P. Human NK cells in pregnant uterus: why there. American Journal of Reproductive Immunology. 59 (5), 401-406 (2008).
- Lash, G. E., et al. Standardisation of uterine natural killer (uNK) cell measurements in the endometrium of women with recurrent reproductive failure. Journal of Reproductive Immunology. 116, 50-59 (2016).
- Yang, Y., et al. HOXA-10 and E-cadherin expression in the endometrium of women with recurrent implantation failure and recurrent miscarriage. Fertility and Sterility. 107 (1), 136-143 (2017).
- Tuckerman, E., Laird, S. M., Prakash, A., Li, T. C. Prognostic value of the measurement of uterine natural killer cells in the endometrium of women with recurrent miscarriage. Human Reproduction. 22 (8), 2208-2213 (2007).
- Jasper, M. J., et al. Macrophage-derived LIF and IL1B regulate alpha(1,2)fucosyltransferase 2 (Fut2) expression in mouse uterine epithelial cells during early pregnancy. Biology of Reproduction. 84 (1), 179-188 (2011).
- Kopcow, H. D., et al. T cell apoptosis at the maternal-fetal interface in early human pregnancy, involvement of galectin-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (47), 18472-18477 (2008).
- Johnson, P. M., Christmas, S. E., Vince, G. S. Immunological aspects of implantation and implantation failure. Human Reproduction. 14, Suppl 2 26-36 (1999).
- Hong, G., et al. Multiplexed fluorescent immunohistochemical staining, imaging, and analysis in histological samples of lymphoma. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58711 (2019).
- Carstens, J. L., et al. Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer. Nature Communications. 8, 15095 (2017).
- Zhao, Y., et al. The use of multiplex staining to measure the density and clustering of four endometrial immune cells around the implantation period in women with recurrent miscarriage: comparison with fertile controls. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 593-603 (2020).
