Summary
למרות ההתקדמות באימונוהיסטוכימיה מולטיפלקס והדמיה רב ספקטרלית, אפיון הצפיפות וההקבצות של תאי מערכת החיסון העיקריים בו זמנית באנדומטריום נותר אתגר. מאמר זה מתאר פרוטוקול מכתים מולטיפלקס מפורט והדמיה עבור לוקליזציה בו זמנית של ארבעה סוגי תאי מערכת החיסון באנדומטריום.
Abstract
אימונוהיסטוכימיה היא השיטה הנפוצה ביותר לזיהוי והדמיה של אנטיגנים רקמה במחקר ביולוגי ואבחון קליני. זה יכול לשמש כדי לאפיין תהליכים ביולוגיים שונים או פתולוגיות, כגון ריפוי פצעים, תגובה חיסונית, דחיית רקמות, ואינטראקציות רקמות-biomaterial. עם זאת, ההדמיה וכימות של אנטיגנים מרובים (במיוחד עבור תאי מערכת החיסון) בסעיף רקמה אחת באמצעות כתמים אימונוהיסטוכימיים קונבנציונליים (IHC) נותר לא משביע רצון. לפיכך, טכנולוגיות מולטיפלקס הוצגו בשנים האחרונות כדי לזהות סמנים ביולוגיים מרובים בדגימת רקמה אחת או הרכב של דגימות רקמות שונות.
טכנולוגיות אלה יכולות להיות שימושיות במיוחד בהבחנה בין השינויים באינטראקציות בין תאים בתוך רירית הרחם בין נשים פוריות ונשים עם הפלות חוזרות ונשנות במהלך ההשתלה. מאמר זה מתאר פרוטוקול מפורט להכתמת IHC פלואורסצנטיות מרובת-קסים כדי לחקור את הצפיפות וההקבצות של ארבעה סוגי תאי חיסון עיקריים בו זמנית בדגימות רירית הרחם המתוזמנות במדויק במהלך השתלת העובר. השיטה כוללת הכנת מדגם, אופטימיזציה מולטיפלקס עם סמנים עבור תת-סוגים של תאי מערכת החיסון, ואת הסריקה של השקופיות, ואחריו ניתוח נתונים, עם התייחסות ספציפית לזיהוי תאי מערכת החיסון רירית הרחם.
בשיטה זו, ניתן לנתח בו זמנית את הצפיפות והאשכול של ארבעה סוגי תאי מערכת החיסון העיקריים באנדומטריום בסעיף רקמה אחת. בנוסף, מאמר זה ידון בגורמים הקריטיים ובפתרון בעיות כדי להתגבר על הפרעות פלואורופור אפשריות בין הבדיקות הפלואורסצנטיות המיושמות. חשוב לציין, התוצאות מטכניקת הכתמת מולטיפלקס זו יכולות לסייע בהבנה מעמיקה של האינטראקציה והוויסות האימונולוגיים במהלך השתלת העובר.
Introduction
הפלה חוזרת (RM) יכולה להיות מוגדרת כהפסד של שני הריונות או יותר לפני 24 שבועות של הריון1. מצב פוריות תכוף זה משפיע על עד 1% מהזוגות ברחבי העולם2,3. הפתופיזיולוגיה היא רב-גורמית וניתן לחלקה לגורמים עובריים (בעיקר בשל קריוטיפ עוברי חריג) וגורמים מונעים אימהית המשפיעים על רירית הרחם ו/או התפתחות השליה. ביטוי זה יכול לנבוע מפגמים גנטיים הוריים, אנומליות ברחם, מצבים פרותרומבוטיים, גורמים אנדוקרינולוגיים והפרעות אימונולוגיות4.
בשנים האחרונות, תפקוד לקוי של תאי המחולל החיסוני היה מעורב בפתוגנזה של אובדן הריון מוקדם5. זה השראה חקירות רבות לתוך לפרט את האוכלוסיות הספציפיות של תאי מערכת החיסון באנדומטריום במהלך המחזור החודשי, ההשתלה, והריון מוקדם, עם תפקידים ספציפיים בתחילת ההריון. בין תאי מערכת החיסון האלה, תאי הרוצח הטבעי הרחם (uNK) ממלאים תפקיד קריטי במהלך השתלת העובר וההריון, במיוחד בתהליכי פלישה trophoblastic ו אנגיוגנזה6. מחקרים הראו צפיפות תאי uNK מוגברת באנדומטריום של נשים עם RM7,8, אם כי ממצא זה לא היה קשור לסיכון מוגבר להפלה9. עם זאת, מחקר זה עורר הערכת הצפיפות של סוגי תאי חיסון אחרים (כגון מקרופאגים, תאים דנדריטיים ברחם) באנדומטריום אצל נשים עם RM10,11. עם זאת, עדיין לא ברור אם יש שינוי משמעותי בצפיפות תאי החיסון באנדומטריום פרי-השתלה אצל נשים עם RM.
הסבר אפשרי אחד לאי הוודאות הוא שהערכת צפיפות תאי החיסון רירית הרחם עשויה להיות קשה בשל השינויים המהירים באנדומטריום במהלך חלון ההשתלה. במהלך מסגרת הזמן של 24 שעות, שינויים משמעותיים רירית הרחם לשנות את צפיפות תאי החיסון הפרשת ציטוקינים, הצגת מקור של וריאציה בתוצאות אלה12. בנוסף, רוב הדיווחים מסתמכים בעיקר על השימוש בהכתמה של תא יחיד (למשל, שיטות IHC מסורתיות) שלא יכלו לבחון סמנים מרובים באותו מקטע רקמות. למרות ציטומטריית זרימה יכול לשמש לאיתור אוכלוסיות תאים מרובים במדגם אחד, כמויות גדולות של תאים הנדרשים ואת אופטימיזציה זמן רב לעכב את הפופולריות והיעילות של שיטה זו. לפיכך, ההתקדמות האחרונה בהכתמת IHC מולטיפלקס יכולה לפתור בעיה זו על ידי חיסון סמנים מרובים באותה שקופית כדי להעריך פרמטרים מרובים, כולל שושלת תאים ולוקליזציה היסתולוגית של תת-אוכלוסיות חיסוניות בודדות. יתר על כן, טכנולוגיה זו יכולה למקסם את המידע המתקבל במקרה של זמינות רקמות מוגבלת. בסופו של דבר, טכניקה זו יכולה לעזור לברוח את ההבדלים באינטראקציות תאי החיסון באנדומטריום בין נשים פוריות ונשים עם RM.
שתי קבוצות של נשים גויסו מבית החולים הנסיך מוויילס, כולל נשים פוריות (FC) ונשים עם הפלה חוזרת בלתי מוסברת (RM). שליטה פורייה הוגדרה כנשים שלפחות לידה חיה אחת ללא כל היסטוריה של הפלה ספונטנית, ונשות RM הוגדרו כמי שהיו להם היסטוריה של ≥2 הפלות רצופות לפני 20 שבועות ההריון. הנבדקים משתי הקבוצות עמדו בקריטריוני ההכללה הבאים: (א) גיל בין 20 ל -42 שנים, (ב) לא מעשן, (ג) מחזור וסת רגיל (25-35 ימים) ומבנה הרחם הרגיל, (ד) אין שימוש בכל משטר הורמונלי לפחות 3 חודשים לפני הביופסיה רירית הרחם, (ה) ללא הידרוסלפינקס על ידי היסטרו-salpingogram. בנוסף, כל הנבדקים שגויסו היו קריוטיפינג רגיל, אולטרה-סאונד נורמלי 3 ממדים היסטרוזלפינוגרמה, יום 2 הורמון מגרה זקיק < 10 IU / L, פרוגסטרון באמצע luteal > 30 נמול / L, תפקוד בלוטת התריס נורמלי, ונבדק שלילי עבור זאבת נוגדן קרישה ו נוגדני Iticardioliping ו- IgM.
כדי להבין טוב יותר את הבסיס החיסוני של RM, רצוי ביותר לכמת ולמקם בו זמנית את סוגי תאי החיסון העיקריים הקיימים באנדומטריום בזמן ההשתלה. מאמר זה מתאר את הפרוטוקול כולו מהכנת מדגם, את אופטימיזציית מולטיפלקס עם סמנים עבור תת-סוגים של תאי מערכת החיסון, ואת הסריקה של השקופיות, ואחריו ניתוח נתונים עם התייחסות ספציפית לזיהוי תאי מערכת החיסון רירית הרחם. יתר על כן, מאמר זה מתאר כיצד לקבוע את הצפיפות ואת קיבוץ של סוגי תאי החיסון בו זמנית באנדומטריום.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
המחקר אושר על ידי האוניברסיטה הסינית המשותפת של הונג קונג טריטוריות חדשות מזרח אשכול ועדת האתיקה מחקר קליני. הסכמה מדעת התקבלה מהמשתתפים לפני איסוף הביופסיות רירית הרחם. עיין במקטע המבוא עבור קריטריוני הכללה של קבוצות הפקד וה- RM.
1. הכנת מדגם
- ודא כי כל הנשים במחקר זה לעבור בדיקת dipstick שתן יומית מהיום 9 של המחזור החודשי ואילך כדי לזהות את ההורמון מחלמן (LH) נחשול לזהות ביוץ, וזמן ביופסיות רירית הרחם בדיוקביום 7 לאחר נחשול LH (LH +7).
- השג שבר 0.5 ס"מ2 של ביופסיה רירית הרחם באמצעות סמפלר פיפל או פיפט קורט מנשים ונשים פוריות עם RM בלתי מוסבר. סמן את המיכל והניח את הדגימה מיד בפורמלין ניטרלי של 10% חוצץ נייטרלי (pH 7) לקיבעון לילה בטמפרטורת החדר.
הערה: נפח הקיבעון צריך להיות פי 5-10 מזה של הרקמה. - מניחים את הרקמה במחסנית להתייבשות במכונת עיבוד רקמות לפני הטמעתה בשעווה פרפין מותכת. הטמע את הרקמות בפרפין ב 58-60 °C (58 °F).
- אפשר לבלוק הפרפין להתקרר בלילה בטמפרטורת החדר. השתמש microtome כדי לקצץ את בלוקים פרפין לעובי של 3 מיקרומטר.
הערה: השימוש במים מזוקקים מסייע בהרכבה נכונה של רקמות ודבקות לאורך כתמי מולטיפלקס. - מניחים את סרט הפרפין באמבט מים ב 40-45 מעלות צלזיוס במשך 30 מעלות צלזיוס.
- התקן את המקטעים על שקופיות זכוכית מיקרוסקופ מצופות פולי-L-0.1% עם ציפוי. מניחים את השקופיות עם הרקמה הפונה כלפי מעלה ומאפשרים להתייבש ב 37 °C (50 °F) לילה. אחסן את השקופיות בתיבת שקופיות הרחק מטמפרטורות קיצוניות עד לשימוש נוסף.
2. לקבוע את הריכוז האידיאלי של נוגדנים עבור IHC מולטיפלקס באמצעות IHC קונבנציונאלי.
הערה: זה חשוב לזיהוי רמת הביטוי ואת התבנית של כל סמן חיסוני במדגם רירית הרחם, ולקבוע את רצף הכתמים של כל סמן, כמו גם את זיווגי פלואורופור אות טיירמיד הקשורים שלהם."
- בדוק את הנוגדנים להתאמתם ל- IHC מולטיפלקס באמצעות IHC קונבנציונלי ידני13.
- השתמש ברקמות רירית הרחם לבדיקת נוגדנים בודדים.
- כלול שליטה חיובית (למשל, טחול) ושליטה שלילית (בקרת איזוטיפ) למיטוב מצב הכתמים של כל נוגדן.
- בצע את הכתמים באמצעות הדילול המומלץ על-ידי גליון הנתונים של הנוגדן.
- בצע כתמים נוספים באמצעות ריכוזים מעל ומתחת לדילול המומלץ המשמש בשלב 2.3.
הערה: פתולוג קליני צריך להעריך את השקופיות המוכתמות בעיוורון כדי לאשר את לוקליזציה של בדיקת הנוגדנים ואת שלמות התא.
3. שיטת הכתמת מולטיפלקס
- הכנת שקופיות קיבוע
- מניחים את השקופיות (בשלב 1.6) שטוחות עם הרקמה הפונה כלפי מעלה בתנור ואופים ב 60 °C לפחות 1 שעה.
- מוציאים את השקופיות מהתנור ומאפשרים להן להתקרר לפחות 20 דקות בטמפרטורת החדר לפני שמניחים אותן בארון שקופיות אנכי.
- Dewax rehydrate המגלשות הפורמלין קבוע, פרפין מוטבע עם 10 דקות שהוקצו לכל אחד מהצעדים הבאים: קסילן (2x), 100% אתנול (2x), 95% אתנול (1x), 70% אתנול (2x), ומים מזוקקים (2x).
- מקם את מדף השקופיות בקופסת שקופיות מפלסטיק והטביע אותן בתמיסת מלח עם חציית טריס (TBS, pH 7.6).
הערה: השקופיות חייבות להישאר לחות החל בשלב התייבשות זה ועד להרכבה בשלב הסופי. - תקן את הדגימות על ידי טביעת השקופיות בקופסת שקופיות פלסטיק מלאה בתערובת של פורמלדהיד מדולל במתנול (1:9) במשך 30 דקות בחושך.
- לשטוף את המגלשות פעמיים במים deionized במשך 2 דקות ולאחר מכן להמשיך לאחזור אנטיגן.
- אחזור אפיטופה
- מניחים את מתלה השקופיות בקופסה עמידה בחום וממלאים אותו במאגר חומצת לימון (pH 6.0) כדי לכסות את השקופיות.
- מניחים את הקופסה במיקרוגל, ומחממים את השקופיות במשך 50 s ב 100% כוח ואחריו 20 דקות ב 20% כוח כדי לשמור על אותה טמפרטורה.
- אפשר לשקופיות להתקרר כ-15 דקות בטמפרטורת החדר.
- לשטוף את המגלשות במים במשך 2 דקות ואחריו TBS-Tween 20 (TBST) במשך 2 דקות.
הערה: TBST מורכב 25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, ו 0.05% Tween 20 (v/v).
- חסימת
- לחסום פעילות peroxidase אנדוגני ברקמה על ידי טבילת השקופית על צנצנת המכילה פתרון חסימת peroxidase (ראה טבלת החומרים) במשך 10 דקות.
- לשטוף את השקופיות עם TBST במשך 5 דקות.
- השתמש בעט מחסום הידרופובי כדי לסמן גבול סביב קטע הרקמה בשקופית.
- לכסות את מקטעי הרקמה עם חוצץ חסימה (ראה טבלה של חומרים) או אלבומין סרום בקר (5%, w / v), ודגרה את השקופיות בתא לח במשך 15 דקות.
- יישום נוגדנים ואות
- הסר את ריאגנטים חוסמים.
- דגירה עם הנוגדן העיקרי של עניין (למשל, CD3, 1:100 דילול בדלל נוגדנים, ראה טבלה 1) בתא לח בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.
- הסר את הנוגדן העיקרי. לשטוף 3x עם TBST במשך 5 דקות בכל פעם.
- דגירה עם פרוקסידאז חזרת פולימר (HRP) שכותרתו נוגדן משני(טבלה 1)במשך 15 דקות בתא לח בטמפרטורת החדר. לשטוף 3x עם TBST במשך 5 דקות בכל פעם.
- החל את פתרון העבודה TSA פלואורופור אופל (1:100 בדלל הגברה) ודגר בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות כדי לאפשר הטיות פלואורופור לדגימת הרקמה באתרי כריכת הנוגדנים העיקריים. לשטוף עם TBST משולש במשך 5 דקות בכל פעם.
- הפשטה מבוססת מיקרוגל
- יש לשטוף עם מאגר אחזור האנטיגן (פתרון מאגר ציטוטים, pH 6.0).
- בצע הפשטה מבוססת מיקרוגל כדי להסיר את קומפלקס HRP הראשי-משני כדי להציג את הנוגדן הראשי הבא (למשל, CD20).
- מניחים את השקופיות במאגר אחזור אנטיגן, מחממים אותן במיקרוגל ב-100% חשמל למשך 50 s ואחריהן 20% חשמל למשך 20 דקות במיכלים בטוחים למיקרוגל, ומצננים אותן בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
- חזור על שלבים 3.2.4 עד 3.5.2 עד שדגימות הרקמה נבדקו עם כל הנוגדנים העיקריים.
- הפעלה נגדית והרכבה
- לאחר הפשטה וקירור מבוססי מיקרוגל של מאגר אחזור האנטיגן, יש לשטוף את השקופיות במים מזוקקים וב-TBST.
- דגירה עם פתרון 4', 6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI) (1.0 מיקרוגרם/מ"ל) למשך 5 דקות בתא לח בטמפרטורת החדר.
- לשטוף 3x עם TBST במשך 5 דקות בכל פעם. לשטוף עם מים פעם אחת במשך 5 דקות.
- יבש את המגלשה והרכב עם מדיום ההרכבה המתאים (ראה טבלת החומרים).
הערה: לא תידרש סטייה נגדית כדי שישמשו לפיתוח ספריה ספקטרלית.
4. תמונה וניתוח
- הכנת שקופיות ספרייה ספקטרליות
- צור שקופיות ספריה (תמונות ייחוס של כתם יחיד) עבור כל פלואורופור, DAPI ופלואורסצנטיות אוטומטית עם אותה רקמת בקרה לניתוח תמונה רב-ספקטרלית.
- באמצעות השקופיות של דגימות ביופסיה רירית הרחם מנשים עם RM ונשים פוריות, לבצע שלבים 1.1 עד 3.6.4 לגילוי נוגדנים בודדים עבור כל שקופית (ללא תוספת נוגדן או פלואורופור נוספת).
- עבור כל זיהוי נוגדנים, הכתים את אחת השקופיות ב- DAPI (כמו בשלב 3.6.2) והותיר שקופית אחת לא מוכתמת לאיתור פלואורסצנטיות אוטומטית אפשרית של רקמות בספקטרום.
- השתמש במסננים המתאימים בתחנת העבודה כדי להשיג את התמונה עבור קבוצה זו של שקופיות עבור כל נוגדן ולהעלות אותם לספריית ניתוח התמונות (כמתואר בשלב 4.2).
- לאחר לכידת התמונה, בחר ב- inForm כמקור הספריה הספקטרלי ובנה את הספריה הספקטרלית.
- כמו פלואורופורים משמשים, בחר כתמים / פלואורים ... מהתפריט.
- בעת בחירת הכתמים או הפלורופורים, צמצם את האפשרויות על-ידי בחירת קבוצה אחת או יותר. בחר הכל כדי להציג את כל הספקטרום התואם לתמונות.
- הדמיה ספקטרלית
הערה: תמונות צולמו באמצעות תחנת העבודה מנטרה עם הספריה הספקטרלית שהוקמה באמצעות התוכנה לניתוח תמונות InForm.- לכוד את התמונה של השקופיות המוכתמות בנוגדן יחיד עם מסנני האפינפילואורסצנטיות המתאימים כפי שהוצע בטבלה 2 (למשל, DAPI, פלואורסין איסותיוצינאט [FITC], CY3, טקסס אדום ו- CY5) באמצעות תחנת העבודה.
הערה: מסננים מומלצים עבור הפלורופורים הספציפיים המשמשים בפרוטוקול זה מוצגים בטבלה 2. - זהה זמן חשיפה מתאים לאות אופטימלי על ידי בחינת כל סמן בערוץ הפלואורסצנטיות המתאים לו.
הערה: האות האופטימלי נקבע על פי ההתייחסות על החיוביות והלוקוליזציה המתקבלת בהכתמת הנוגדנים הבודדת. - קבע זמן חשיפה קבוע עבור כל ניתוח (שילוב של נוגדנים-פלואורופור) כדי לתקנן השוואה בין מדגמים.
הערה: קביעת החשיפה הקבועה תלויה בעוצמת המדגם של תחומי העניין. - סרוק את השקופיות המוכתמות במולטיפלקס במצב הסריקה המתאים באמצעות אלגוריתם מיקוד אוטומטי מוטבע.
הערה: הספרייה הספקטרלית שהוקמה תשמש להבחנה בין קוביית התמונה הרב-ספקטרלית לרכיבים בודדים בודדים (ביטול ספקטרלי). פעולה זו תאפשר לעבד את הזיהוי מבוסס הצבע עבור כל סמני העניין באמצעות שני השלבים העיקריים הבאים: אימון וניתוח תמונה.
- לכוד את התמונה של השקופיות המוכתמות בנוגדן יחיד עם מסנני האפינפילואורסצנטיות המתאימים כפי שהוצע בטבלה 2 (למשל, DAPI, פלואורסין איסותיוצינאט [FITC], CY3, טקסס אדום ו- CY5) באמצעות תחנת העבודה.
- ניתוח תמונה
- ספירת תאים של סוגי תאי מערכת החיסון שנבחרו באנדומטריום
- לכוד לפחות 10 שדות לניתוח תחת הגדלה של פי 200.
הערה: השדות נלכדו על-ידי סריקת המקטע כולו ללא כל בחירה. זה יכול להבטיח לכידה בו זמנית של כל רכיבי התא של רירית הרחם, למשל, גבול אפיתל זוהר, סטרומה, ובלוטות. - לספירת התאים, לחצו על הלחצן 'ספירת עצמים' בסרגל השלבים כדי להציג את החלונית 'קביעות ספירת אובייקטים'.
- סמן את התיבה בטל אובייקט אם הוא נוגע בקצה לקבלת אי-הכללה של אובייקטים כלשהם שנוגעים בקצה התמונה, אזור התהליך או אזור הרקמה.
- אם הרקמה פולחו, בחר את קטגוריית הרקמה שבה ניתן למצוא את האובייקטים. אל תספור אובייקטים מחוץ לקטגוריית הרקמה שנבחרה.
- בחרו בגישה הרצויה לזיהוי עצמים: מבוססי אובייקטים או מבוססי פיקסלים (סף).
הערה: יש לבחור את הגישה המבוססת על פיקסלים (Threshold) במקרה של כתם אמין או עקבי שעבורו היישום של סף פשוט יניב את פיקסלי האובייקט. הגישה המבוססת על אובייקט מומלצת כאשר נדרשות גישות מתקדמות יותר המבוססות על מורפומטריה במקרה של חוסר עקביות וספציפיות של הכתמת חפצים. - בחר את קנה המידההרצוי של האות : שינוי קנה מידה אוטומטי או קנה מידה קבוע.
הערה: בחירה בשינוי גודל אוטומטי תגרום לשינוי קנה מידה אוטומטי של כל מישור רכיב לפני ביצוע פילוח אובייקטים. האפשרות קנה מידה קבוע מומלצת כאשר נדרשים ביצועי פילוח טובים יותר, ואותות כתמים עקביים ואמינים. - בחר את הרכיב הראשי עבור פילוח אובייקטים מהרשימה הנפתחת.
- התאם את ערך האות המינימלי עבור הרכיב הראשי לערך הסף הרצוי.
- למילוי אוטומטי של חורים באובייקטים, בחרו 'מלא חורים'.
- כדי לזהות אובייקטים שנוגעים באובייקטים אחרים כאובייקטים בודדים, במקום כאובייקט אחד, בחר בתיבת הסימון מקד פיצול לאחר בחירה בתיבת הסימון גודל מרבי (פיקסלים).
- כדי לא לכלול אובייקטים בהתבסס על העגולות של האובייקט, סמן את התיבה עיגול וציין את מעגליות המינימום הרצויה.
- ספירת כל התאים הסטרומליים (CD3−/CD20−/CD68−/CD56−ו- DAPI+), כולל התאים המקיפים את כלי הדם.
- ספירת תאי החיסון בנפרד, כולל תאי T (CD3+ ו- DAPI+), תאי B (CD20+ ו- DAPI+), מקרופאגים (CD68+ ו- DAPI+) ותאי uNK (CD56+ ו- DAPI+).
- לבטא את הנתונים כאחוזי תאי החיסון ביחס למספר הכולל של תאי סטרומליים עבור כל תמונה שנלכדה, ולדווח על ספירת התאים הסופיים כממוצע של כל השדות.
- השתמש בעורך התצוגה כדי להציג את עיבוד הטבלאות שהתקבלו. יצא את הטבלה נתוני ספירה.
- כימות של התפלגות מרחבית של תאי מערכת החיסון רירית הרחם
- תחת הגדלה של 200x, להעריך את הפונקציה L באמצעות תוכנית R לטווח של 0-20 מיקרומטר נחשב קשר תא מרחק מרבי14.
הערה: ארגז הכלים 'spatstat' של שפת R שימש למדידת הפונקציה L.- ציין את רמת קיבוץ הקבצות של זוגות שונים של תאי מערכת החיסון בהתבסס על האזור שמתחת לעקומה (AUC) של הפונקציה L שלהם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התהליך הסכמטי הכולל של ביצוע בדיקת מולטיפלקס בת 4 צבעים לזיהוי 4 סוגי תאי מערכת החיסון רירית הרחם מוצג באיור 1. בקצרה, הפרוטוקול של מכתם אימונופלואורסצנטיות מולטיפלקס זה נדרש 8 צעדים עיקריים: 1. הכנת שקופית, 2. אחזור Epitope, 3. חסימה, 4. יישום נוגדנים ראשי, 5. יישום נוגדנים משני, 6. הגברת אותות, 7. הסרת נוגדנים, ו 8. נגד והרה. עיבוד וניתוח תמונה נערכו לאחר מכן באמצעות תחנת העבודה מנטרה עם הספרייה הספקטרלית שנוצרה באמצעות תוכנת inForm Image Analysis להבחנה בין 4 סוגי תאי החיסון במדגם רירית הרחם (איור 2).
ניתן לזהות ארבעה סוגי תאי מערכת החיסון רירית הרחם בדגימות רירית הרחם האנושיות באמצעות טכניקת הכתמת מולטיפלקס זו: תאי CD3+ T, תאי CD20+ B, מקרופאגים CD68+ ותאי CD56+ uNK(איור 3). עם זאת, הפרעות פלואורופור יש לשקול בזהירות כדי לקבל תמונה ברורה ושימושית. למרות שטכנולוגיה רב-ספקטרלית זו באמצעות תחנת העבודה מנטרה יכולה לתמוך עד 8-plex assays, היישום של 4 פלואורופורים המשמשים בפרוטוקול זה הפגין ביצועים אופטימליים ללא הפרעות פלואורופור בשל ההבדלים בספקטרום הפליטה של הפלורופורים. לעומת זאת, כתמי מולטיפלקס הכוללים פלואורופורים 5-8 דורשים לעתים קרובות תשומת לב רבה יותר להפרעות פלואורופור הנובעות מפלט מאורכי הגל המשותפים.
כדי להתגבר על חיסרון זה, כתמי מונופלקס יהיה צורך לקבוע את הסדר של כל נוגדן במולטיפלקס ולזהות את רמת הביטוי ואת התבנית של כל סמן חיסוני במדגם רירית הרחם. זה יכול לעזור לקבוע את רצף הכתמים של הסמנים ואת זיווגי פלואורופור TSA הקשורים שלהם. לאחר בדיקת מונופלקס הושלמה לקביעת סדר הנוגדנים שיש ליישם, השלב הבא יהיה לבחור את הפלורופור לגילוי לאחר כתמי מולטיפלקס. פלואורופור ייחודי חייב להיבחר עבור כל נוגדן של עניין. המספר הקשור לכל פלואורופור יהיה בערך אורך הגל הפלואורסצנטי הנפלט במהלך העירור(טבלה 1 וטבלה 2). גישה אחת למניעת הפרעות פלואורופור היא לבחור זוגות פלואורופור עם אורכי גל רחוקים אחד מהשני ככל האפשר (במיוחד עבור נוגדנים לוקליזציה משותפת). זה יכול לעזור להפחית חפיפה ספקטרלית עודפת ולספק תמונה חדה פנוטיפינג אמין יותר. יתר על כן, ההערכה הקפדנית על ידי הפעלת ולכביית לייזרים מהתמונה המורכבת מולטיפלקס בתוכנת inForm יכולה גם לסייע בזיהוי דפוסי הכתמים כדי למזער את רוויית הפלואורופור (איור 4).
לניתוח תמונה, ניתן לספור באופן אוטומטי את מספר תאי CD3+ T, CD20+ B, CD68+ מקרופאגים, CD56+ תאי uNK ותאי סטרומה בסטרומה רירית הרחם (CD3−/CD20−/CD68−/ CD56− ו- DAPI מוכתמים) באופן אוטומטי באמצעות תוכנת Finder הרקמות InForm 14.0 (איור 5). כל סוג של תאי מערכת החיסון בא לידי ביטוי כאחוז ביחס למספר הכולל של תאי הסטרומיים(איור 5). באופן דומה, כימות ההתפלגות המרחבית של תאי החיסון רירית הרחם התבסס על מיקום X ו- Y של כל תא חיסוני שהתקבל ממערכת InForm (איור 6). באמצעות שפת ה- R, ניתן להבחין ברמת קיבוץ של זוגות שונים של תאי מערכת החיסון המבוססים על AUC.
איור 1: הכתמת דיאגרמת זרימת עבודה. קיצורים: BSA = אלבומין סרום בקר; HRP = פרוקסידז חזרת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תחנת עבודה ללכידת תמונה וניתוח. (A) תחנת עבודה להדמיית מנטרה, (B) תמונה ספקטרלית לא מעובדת, (C) תמונה מורכבת, (D) פילוח רקמות (תאים אפיתל וסטרומליים), (E) תמונה מורכבת של רקמת רירית הרחם המציגה ארבעה סמנים צבעוניים לזיהוי אוכלוסיות תאים שונות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הדמיה ספקטרלית. חיסון מולטיפלקס של 4 סוגי תאי חיסון שונים בוצע על ביופסיות רירית הרחם מ -A) אשת בקרה פורייה ו -( B) אישה עם RM בלתי מוסבר שהוצג כהדמיה רב ספקטרלית אחת. לאחר ייצור ספריה מוכתמת אחת, ביטול ספקטרלי עלול לחשוף הדמיה של פלואורופור יחיד המייצגים (C) CD3, (D) CD56, (E) CD68, (F) CD20 , (G) DAPI. תמונה מורכבת נוצרה אז על ידי שילוב כל הפלורופורים לאחר הדמיה רב-ספקטרלית (H). סרגלי קנה מידה = 50 מיקרומטר(A, B). קיצורים: LE = אפיתל זוהר; DAPI = 4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול; RM = הפלה חוזרת ונשנית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: הכלי ספירת צורות. הכלי ספירת תוכנות inForm מופעל על-ידי בחירת סמל התיבה בז' (המצוין על-ידי ↓). (A)הכנת תמונה, (B, C) פילוח רקמה עבור אימון מצויר ביד ואוטומציה, (D) פילוח תאים בודדים, (E) פנוטיפינג התאים בהתבסס על עוצמת הפלורופור, (F) ניתוח לעוצמת פלואורופור (התיבה האדומה המציגה את מספר התאים החיוביים בעוצמת הפלורופור שנבחרה), ו - (G) ייצוא התוצאות לשימוש (התיבה האדומה מציינת את אפשרויות הייצוא). קיצור: IHC = אימונוהיסטוכימי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: ספירת תאים. (A) פנוטיפינג של התאים לספירת תאים אוטומטית ופלט(B)של התאים המוכתמים חיוביים באזור המפולח (לדוגמה, סטרומי) להשוואה נוספת וניתוח סטטיסטי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: מדידת צפיפות מרחבית. (A) זיהוי אוטומטי של מיקום תאי החיסון המוכתמים באופן חיובי באזור המפולח (למשל, סטרומלי), (B) תצוגת פלט של הקואורדינטות של כל CD20+ תא חיסוני מוכתם חיובית, ו - (C) קביעת הצפיפות המרחבית והלוקוליזציה בין CD20+ תאים ותאי חיסון אחרים באזורי הרקמה המפולחים באמצעות Spatstat. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| הזמנה | נוגדן | שיבוט | קלוניאליות | גורם דילול נוגדנים | לשם | גורם דילול אופל |
| 1 | CD3 | SP7 | חד שבטי | 1 ל-100 | אופל 620 | 0.111111111 |
| 2 | CD20 | L26 | חד שבטי | 1 ל-100 | אופל 650 | 0.215277778 |
| 3 | CD68 | SP251 | חד שבטי | 1 ל-100 | אופל 520 | 0.111111111 |
| 4 | CD56 | CD564 | חד שבטי | 1 ל-100 | אופל 690 | 0.111111111 |
טבלה 1: רשימת נוגדנים, שיבוטים וריכוזים בהם נעשה שימוש.
| צבע | מקסימום עירור (nm) | מקסימום פליטה (nm) | זיהוי צפוי בערכת מסננים (שם) | צבע צפוי |
| DAPI | 350 | 470 | DAPI | כחול |
| אופל 520 | 494 | 525 | FITC | ירוק |
| אופל 620 | 588 | 616 | סיי-3 וטקסס רד | ענבר |
| אופל 650 | 627 | 650 | טקסס אדום וסיי-5 | כתום |
| אופל 690 | 676 | 694 | טקסס אדום וסיי-5 | צלול |
טבלה 2: רשימת פלואורופורים עם אורכי הגל המרביים שלהם, זיהוי צפוי בערכות מסננים מתאימות וצבעים נצפים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שלבים קריטיים בפרוטוקול
חשוב לציין כי כתמי מולטיפלקס דורשים אופטימיזציה שקדנית. אחזור אנטיגן, באמצעות טכנולוגיית חיץ סיטראט ומיקרוגל, דורש אופטימיזציה כדי להבטיח הפשטת נוגדנים מלאה ולשמור על כדאיות רקמות. כמו ריאגנטים TSA covalently לאגד לאתרים המקיפים את האנטיגן, הם יכולים לעכב את הכריכה של נוגדן ראשוני לאחר מכן באמצעות מכשול סטרי (הידוע גם בשם "אפקט מטריה"). זה נוטה להתרחש כאשר סמנים חיסוניים מרובים שוכנים בתא תא אחד וגורמים להפרעות פלואורופור. כדי לזהות אם תהיה השפעה, זה יהיה קריטי לבצע מונופלקס IHC / אם מראש כדי לזהות כל חפיפה לוקליזציה של תאי החיסון. כמו כתמים מדגם יחיד יידרש ליצירת הספרייה הספקטרלית, ספריות ספקטרה מאומתות יכולות להקל על אפליית אותות בודדים כדי למנוע עוד יותר הפרעות פלואורופור. במידת הצורך, ריכוזי נוגדנים ראשוניים ודגירה, זיווג פלואורופור-נוגדנים, ריכוזי פלואורופור TSA וסדר כתמים עשויים להשתנות כדי למזער הפרעות פלואורופור. כמו כן, חשוב לאזן כראוי את ריכוזי HRP על מנת למנוע היווצרות עמעום TSA. זה יכול להיות מושגת על ידי titration של נוגדנים ראשוניים ומשניים. יתר על כן, יש חשיבות חיונית לזכור כי הריכוזים ואת זמני הדגירה של נוגדנים ראשוניים המשמשים כתמי מולטיפלקס עשוי להשתנות מאלה המשמשים כרום כרומוגניים הכתמה אחת קונבנציונאלי. לפיכך, קביעת הריכוז ואת סדר הנוגדנים להגיש בקשה להכתמה מולטיפלקס צריך להתבצע מראש.
שינויים ופתרון בעיות
במחקר זה, השתמשנו בהכתמה חיסונית פלואורסצנטית מרובה כדי לזהות בו זמנית את האינטראקציה של ארבעה סוגי תאי חיסון עיקריים בביופסיות רירית הרחם מנשים עם ובלי RM. טכניקה זו משתמשת בנוגדנים נגד CD3 עבור תאי T, CD20 עבור תאי B, CD68 עבור מקרופאגים ו- CD56 עבור תאי uNK כדי להבחין בין סוגי תאים אלה. בהתבסס על שיטה זו, מצאנו כי CD3 החציוני+, CD68+, ו CD56+ ערכי צפיפות התא אצל נשים RM היו גבוהים באופן משמעותי מאלה של פקדים פוריים15. קיבוץ האשכולות בין תאי CD56+ uNK לבין CD68+ מקרופאגים היה גבוה משמעותית בקבוצת RM מאשר בפקדים הפוריים. בנוסף, השימוש בשיטה זו גילה כי תאי CD56+ uNK נראה שיש מתאם מספרי ומרחבי עם CD68+ מקרופאגים בשתי קבוצות הנשים. לעומת זאת, לתאי CD56+ uNK יש מתאם מספרי משמעותי אך לא מרחבי עם תאי CD3+ T אצל נשים עם RM15. שיטה זו קובעת גם את הקשר המרחבי של סוגי תאי מערכת החיסון מרובים באנדומטריום. עם זאת, החיוביות עבור סמן מסוים יכול להיות גבולי במקרים מסוימים. כדי להתגבר על בעיה זו, מומלץ לכלול שליטה חיובית ושליטה שלילית כדי לקבוע את סף החיוביות בעת בניית הספרייה הספקטרלית. בנוסף, ההערכה הקפדנית על ידי הפעלת וביטול של לייזרים מהתמונה המורכבת מולטיפלקס בתוכנת inForm יכולה גם לסייע בזיהוי דפוסי הכתמים כדי למזער את רוויית הפלואורופור.
מגבלות הטכניקה
זיהוי הפרעות פלואורופור במהלך פרשנות נתונים חיוני כדי להבדיל בין colocalization אמיתי של סמנים וחפצים unmixing. מתודולוגיית הכתמת מולטיפלקס זו משתמשת בריאגנטים מבוססי TSA המונעים על ידי הגברה אנזימטית, אשר עשוי להגביר את עוצמת סמן האנטיגן על ידי פי 10-100 בהשוואה לשיטות IF עקיפות קונבנציונליות. זה יוצר סיכון של תצהיר טירמיד הפרוע, פוטנציאל וכתוצאה מכך אפקט מטריה ו / או אות לדמם דרך. כדי לזהות עודף, ניתן להעריך את רמות האות באופן חזותי על-ידי ביטול ההדבקה של תמונות ב- inForm ורחף הסמן מעל אזורים בהירים וחיוביים בתמונת רקמת מולטיפלקס. רמות האות בדרך כלל צריך להישאר מתחת 30 באופן אידיאלי בתוך גורם 3 אחד של השני, במיוחד עבור פלואורופורים סמוכים ספקטרלית. יותר מפי 5 הבדלים באותות עבור פלואורופורים סמוכים ספקטרלית יכול להוביל להפרעות פלואורופור ולגרום לחפצים unmixing. אם רמות האות של כל פלואורופור להראות מעל 3 פעמים את ההבדל מן פלואורופור הסמוך, ריכוזי פלואורופור TSA צריך להיות מותאם כדי להשיג איזון האות. לאחר אישור האות להיות בטווח הנכון, יחס האות לרקע צריך להישמר בשעה <1:10 כדי להבטיח כי הכתמים החיוביים לא מזוהים באופן כוזב מהרקע הלא-מדעי.
כמו צליבה ספקטרלית יכול גם ליצור הפרעות פלואורופור משמעותיות, סדר הכתמים חייב להיות מותאם להפריד צבעים סמוכים ספקטרלית הן ברצף והן בביטוי של סמנים. למרות שטכנולוגיה רב-ספקטרלית זו באמצעות תחנת העבודה מנטרה תומכת עד 8-plex assviss, היישום של 4 פלואורופורים, כלומר אופל 520, 540, 620, ו 690, מדגים את הביצועים הטובים ביותר ללא הפרעות פלואורופור. השימוש ≥5 פלואורופורים דורש לעתים קרובות יותר אופטימיזציה ואימות כדי למנוע crosstalk ספקטרלי בשל הפרופילים הספקטרליים של פלואורופורים החולקים אורכי גל קרובים. במילים אחרות, מספר היעדים שניתן לזהות בו זמנית על ידי גישה זו מוגבל רק על ידי מספר רצועות אורך הגל וערכות מסנן עירור/פליטה הזמינות. לפיכך, כדי לשלול הגנה יתר פוטנציאלית של פלואורופור TSA שחוסם יישום נוסף של פלואורופורים אחרים TSA ו / או כדי לזהות אותות צולבים, זה חיוני כדי להיות קפדני על ידי הפעלת וכיבוי שכבות מן התמונה המשולב מולטיפלקס בתוכנת inForm; לפרש את דפוסי הכתמים מן הכתם IHC יחיד כראוי; ומחפשים אותות ברורים של אובדן, רווח או זהה במישור אחד המתאימים לוקליזציה במישור אחר.
כתמים רב-ספקטרליים דורשים נוגדנים בשילוב עם פלואורופורים ספציפיים כדי לזהות בו זמנית סמנים מרובים. זיווג פלואורופור-נוגדנים זה עוקב אחר שני כללים: i) פלואורופורים שהוקצו לסמנים משותפים צריכים להיות מופרדים באופן ספקטרטי, ו - ii) מטרות שופעות יותר צריכות להיות מזווגות עם פלואורופורים עם בהירות נמוכה יותר או להיפך. יש גם לסדר את סדר הכתמים כך שנוגדים רציפים לא ישתלבו באותם תאי תאים בתאים המוכתמים. לכן, מלבד ריכוזי הנוגדנים וצימני הדגירה, שהם גורמים קריטיים בשיטות הכתמה קונבנציונליות, יש לשקול פרמטרים נוספים, כגון זיווג פלואורופור-נוגדנים מתאים, ריכוזי פלואורופור TSA, רצף הכתמים וחשיפה של נוגדן ספציפי לטיפול מיקרוגל אחד או יותר, יש לקחת בחשבון להכתמת מולטיפלקס מוצלחת. בשל שונות גבוהה בדגימות המחקר, פרוטוקול מולטיפלקס נתון לא יכול ליצור את אותה תוצאה בסוגים אחרים של דגימות המחקר.
כל תהליך הכתמת מולטיפלקס אופל רצף יכול לקחת בין יום אחד למספר ימים בהתאם למספר הסמנים המעורבים בלוח ואת זמני הדגירה נוגדן העיקרי. לעומת זאת, שיטות IF סטנדרטיות מאפשרות בדרך כלל הדמיה של 4-5 סמנים בסיבוב אחד של כתמים. יש לציין כי התנאים הממוטבים בשיטת IHC הקונבנציונלית זקוקים לאופטימיזציה נוספת לפני שתמשיכו להליכי הכתמת מולטיפלקס, הכוללים טיפולים נוספים, מרובים במיקרוגל, ויישום פלואורופורים TSA שישפיעו בסופו של דבר על עוצמת הכתמים של כל נוגדן. נכון לעכשיו, גישות הדמיה המשתמשות בטכנולוגיות רב-ספקטרליות עשויות לדרוש מכשור יקר וייעודי. בנוסף, הוא עשוי להיות מוגבל רק לאזורי עניין שנבחרו בתמונה. לפיכך, זה לא יכול להיות אופטימלי עבור מעבדות עם משאבים מוגבלים וסקאוט של רקמות עם מטרות אנטיגן לא בטוח.
משמעות ביחס לשיטות קיימות
חוזק מסוים של שיטה נוכחית זו היא היכולת למדוד את הצפיפות של סוגי תאי מערכת החיסון מרובים באנדומטריום בו זמנית בניגוד לשיטות IHC קונבנציונליות שיכולות לסמן רק סוג תא אחד עד שניים במקטע רקמה אחת. ציטומטריית זרימה היא שיטה נוספת שיכולה לנתח את הפרופורציות היחסיות של סוגי תאי מערכת החיסון השונים בדגימה רירית הרחם; עם זאת, הוא לא יוכל לספק מידע מרחבי בין סוגי תאי מערכת החיסון השונים לבין ההתפלגות הספציפית בתוך תאי רירית הרחם השונים. יתר על כן, דלדול רקמות הוא דאגה רצינית בפועל קליני, במיוחד במהלך ניסויים קליניים בעת שימוש בדגימות ביופסיה. שתי שיטות קונבנציונליות אלה ידרשו מספר רב של דגימות (מקטעים או תאים) לאופטימיזציה של ההליך ולזיהוי סוגי תאי מערכת החיסון מרובים באנדומטריום של נשים עם ובלי RM.
כפי שמתואר בפרוטוקול זה, זרימת העבודה של אופל מיועדת לזיהוי של עד שבעה סמנים באותו מקטע רקמה באמצעות תחנת העבודה מנטרה. בנוסף, מינים תגובה צולבת במהלך בחירת נוגדנים אינה מגבלה של טכנולוגיה זו. ואכן, היתרון של טכנולוגיה זו הוא שהיא מאפשרת שימוש בנוגדנים שגדלו באותו מין לאיתור עד שבעה סמנים. גישה זו כוללת זיהוי עם ריאגנטים TSA פלואורסצנטי ואחריו טיפול במיקרוגל כדי להסיר כל כתמים לא מדעיים. לאחר הפשטה מבוססת מיקרוגל, ניתן לבצע סבב נוסף של כתמים לגילוי מטרות נוספות ללא סיכון לתגובה צולבת של נוגדנים. בנוסף, שיטת זיהוי TSA זו יכולה להתבצע במינימום של 3 ימים כדי לשלב עד 7 פלואורכרום תוך הפקת תוצאות אמינות לאיתור מטרות חלבון בביטוי נמוך. יתרון נוסף של כתמי מולטיפלקס על המחקר המסורתי IHC הוא היעילות המשופרת שלה כמו המדידה היא אוטומטית, אשר יכול לחסל הטיה סובייקטיבית. הנתונים הכמותיים שנוצרו מייצגים את התוצאות הסופיות של ה- assay.
יישומים עתידיים
טווח היישום של פרוטוקול מולטיפלקס זה הוא עצום. חשוב לציין, זהו המאמר הראשון המתאר את השיטה לזיהוי ביטוי סמן אימונופלואורסצנטיות מרובות משתמש בתחנת העבודה מנטרה וניתוח תמונה באמצעות תוכנת InForm 2.2.1 למתן תוצאות מדויקות וניתן לשחזור בהבחנה בין אוכלוסיות תאי חיסון מרובות אצל נשים עם ובלי RM. חשוב לציין, לוקליזציה של מטרות מרובות באותו מקטע רקמות יכולה לספק תובנה ייחודית על האינטראקציות התאיות שלהן. בסופו של דבר, זה יוביל להבנה טובה יותר של microenvironment התא החיסוני במהלך השתלת עובר אצל נשים עם RM להקמת טיפול ממוקד ספציפי.
יתר על כן, השיטות הנוכחיות שלנו עזרו להוכיח כי מספר תאים חיסוניים ואינטראקציות שלהם עשוי להיות חשוב לתפקוד של רירית הרחם. זה מוצג על ידי השינויים המשמעותיים בצפיפות של שלושה מתוך ארבעה סוגי תאי מערכת החיסון רירית הרחם ועלייה משמעותית באשכולות בין CD68+ ו CD56+ תאים. לעומת זאת, האינטראקציות החריגות של סוגי תאי מערכת החיסון הללו עשויות להיות גורמים נוטים ל- RM. חשוב לציין, בניגוד לגילוי תת-סוג אחד של תאי מערכת החיסון רירית הרחם, היישום של מכתים IHC מולטיפלקס זה יכול לספק הבנה מעמיקה של הוויסות האימונולוגי של השתלת העובר. בנוסף, כימות והבנה נוספת של תכונות מרחביות במיקרו-סביבה החיסונית עשויות לסייע לשפוך אור על הביולוגיה של מחלה זו בהקשר של אימונותרפיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי קרן הנאמנות המיילדות והינקולוגית של הונג קונג בשנת 2018 וקרן הבריאות והמחקר הרפואי של הונג קונג (06170186, 07180226).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amplification Diluent | Perkin Elmer | FP1498 | Fluorophore diluent buffer |
| Antibody diluent | Perkin Elmer | ARD1001EA | Diluting the antibody |
| CD3 | Spring Bioscience | M3072 | Primary antibody |
| CD20 | Biocare Medical | CM004B | Primary antibody |
| CD56 | Leica | NCL-CD56-504 | Primary antibody |
| CD68 | Spring Bioscience | M5510 | Primary antibody |
| Citrate Buffer Solution, pH 6.0 (10x) | Abcam | AB64214 | Antigen retrieval solution |
| EMSURE Xylene (isomeric mixture) | Merck | 108297 | Dewaxing |
| Ethanol absolute | Merck | 107017 | Ethyl alcohol for rehydration |
| HistoCore BIOCUT Manual Rotary Leica Microtome | Leica | RM2125RTS | Sectioning of paraffin-embedded tissue |
| inForm Advanced Image Analysis Software | Perkin Elmer | inForm® Tissue Finder Software 2.2.1 (version 14.0) | Data Analysis software |
| Mantra® Workstation | Akoya Biosciences | CLS140089 | Spectral imaging |
| Microwave | Panasonic | Inverter | Microwave stripping |
| Opal 520 | Perkin Elmer | FP1487A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 620 | Perkin Elmer | FP1495A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 650 | Perkin Elmer | FP1496A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 690 | Perkin Elmer | FP1497A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Oven | Memmert | U10 | Dewaxing |
| Peroxidase Blocking Solution | DAKO | S2023 | Removal of tissue peroxidase activities |
| Poly-L-lysine coated slide | FISHER SCIENTIFIC | 120-550-15 | Slide for routine histological use |
| PolyHRP Broad Spectrum | Perkin Elmer | ARH1001EA | Secondary antibody |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant | ThemoFisher Scientific | P36930 | Mounting |
| Spatstat | / | Version 2.1-0 | Spatial point pattern analysis |
| Spectral DAPI | Perkin Elmer | FP1490A | Nucleic acid staining |
| Tissue Processor | Thermo Fischer | Excelsior ES | Tissue processing for dehydration and paraffination |
| Tris Buffer Saline (TBS), 10x | Cell Signaling Technology | 12498S | Washing solution |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1370-1L | Nonionic detergent |
References
- ESHRE Guideline Group on RPL et al. ESHRE guideline: recurrent pregnancy loss. Human Reproduction Open. 2018 (2), 004 (2018).
- Stirrat, G. M.
- Rai, R., Regan, L.
- Royal College of Obstetricians & Gynaecologists. The investigation and treatment of couples with recurrent first-trimester and second-trimester miscarriage. Green-top Guideline No. 17. Royal College of Obstetricians & Gynaecologists. , (2011).
- King, A.
- Le Bouteiller, P., Piccinni, M. P. Human NK cells in pregnant uterus: why there. American Journal of Reproductive Immunology. 59 (5), 401-406 (2008).
- Lash, G. E., et al. Standardisation of uterine natural killer (uNK) cell measurements in the endometrium of women with recurrent reproductive failure. Journal of Reproductive Immunology. 116, 50-59 (2016).
- Yang, Y., et al. HOXA-10 and E-cadherin expression in the endometrium of women with recurrent implantation failure and recurrent miscarriage. Fertility and Sterility. 107 (1), 136-143 (2017).
- Tuckerman, E., Laird, S. M., Prakash, A., Li, T. C. Prognostic value of the measurement of uterine natural killer cells in the endometrium of women with recurrent miscarriage. Human Reproduction. 22 (8), 2208-2213 (2007).
- Jasper, M. J., et al. Macrophage-derived LIF and IL1B regulate alpha(1,2)fucosyltransferase 2 (Fut2) expression in mouse uterine epithelial cells during early pregnancy. Biology of Reproduction. 84 (1), 179-188 (2011).
- Kopcow, H. D., et al. T cell apoptosis at the maternal-fetal interface in early human pregnancy, involvement of galectin-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (47), 18472-18477 (2008).
- Johnson, P. M., Christmas, S. E., Vince, G. S. Immunological aspects of implantation and implantation failure. Human Reproduction. 14, Suppl 2 26-36 (1999).
- Hong, G., et al. Multiplexed fluorescent immunohistochemical staining, imaging, and analysis in histological samples of lymphoma. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58711 (2019).
- Carstens, J. L., et al. Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer. Nature Communications. 8, 15095 (2017).
- Zhao, Y., et al. The use of multiplex staining to measure the density and clustering of four endometrial immune cells around the implantation period in women with recurrent miscarriage: comparison with fertile controls. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 593-603 (2020).
