Summary
Malgré les progrès de l’immunohistochimie multiplexe et de l’imagerie multispectrale, caractériser la densité et le regroupement simultané des principales cellules immunitaires dans l’endomètre reste un défi. Cet article décrit un protocole de coloration multiplex détaillé et une imagerie pour la localisation simultanée de quatre types de cellules immunitaires dans l’endomètre.
Abstract
L’immunohistochimie est la méthode la plus couramment utilisée pour l’identification et la visualisation des antigènes tissulaires dans la recherche biologique et le diagnostic clinique. Il peut être utilisé pour caractériser divers processus biologiques ou pathologies, tels que la cicatrisation des plaies, la réponse immunitaire, le rejet tissulaire et les interactions tissu-biomatériau. Cependant, la visualisation et la quantification de plusieurs antigènes (en particulier pour les cellules immunitaires) dans une seule section de tissu à l’aide d’une coloration immunohistochimique conventionnelle (IHC) restent insatisfaisantes. Par conséquent, des technologies multiplexées ont été introduites ces dernières années pour identifier plusieurs marqueurs biologiques dans un seul échantillon de tissu ou un ensemble d’échantillons de tissus différents.
Ces technologies peuvent être particulièrement utiles pour différencier les changements dans les interactions cellules-à-cellule immunitaires dans l’endomètre entre les femmes fertiles et les femmes ayant des fausses couches récurrentes pendant l’implantation. Cet article décrit un protocole détaillé pour la coloration IHC par fluorescence multiplexée afin d’étudier la densité et le regroupement simultanément de quatre principaux types de cellules immunitaires dans des échantillons d’endomètre chronométrés avec précision lors de l’implantation d’embryons. La méthode comprend la préparation des échantillons, l’optimisation du multiplexe avec des marqueurs pour les sous-types de cellules immunitaires et le balayage des lames, suivi de l’analyse des données, avec une référence spécifique à la détection des cellules immunitaires de l’endomètre.
En utilisant cette méthode, la densité et le regroupement de quatre principaux types de cellules immunitaires dans l’endomètre peuvent être analysés simultanément dans une seule section de tissu. En outre, cet article traitera des facteurs critiques et du dépannage pour surmonter les interférences possibles de fluorophores entre les sondes fluorescentes appliquées. Il est important de noter que les résultats de cette technique de coloration multiplex peuvent aider à fournir une compréhension approfondie de l’interaction immunologique et de la régulation lors de l’implantation embryonnaire.
Introduction
Une fausse couche récurrente (RM) peut être définie comme la perte de deux grossesses ou plus avant 24 semaines de gestation1. Cette condition de reproduction fréquente affecte jusqu’à 1% des couples dans le monde2,3. La physiopathologie est multifactorielle et peut être divisée en causes embryologiques (principalement dues à un caryotype embryonnaire anormal) et causes maternelles qui affectent l’endomètre et / ou le développement placentaire. Cette manifestation peut résulter d’anomalies génétiques parentales, d’anomalies utérines, de conditions prothrombotiques, de facteurs endocrinologiques et de troubles immunologiques4.
Ces dernières années, un dysfonctionnement des cellules effectrices immunitaires a été impliqué dans la pathogenèse de la perte de grossesse précoce5. Cela a inspiré de nombreuses recherches pour élucider les populations spécifiques de cellules immunitaires dans l’endomètre pendant le cycle menstruel, l’implantation et le début de la grossesse, avec des rôles spécifiques en début de grossesse. Parmi ces cellules immunitaires, les cellules tueuses naturelles utérines (uNK) jouent un rôle essentiel lors de l’implantation embryonnaire et de la grossesse, en particulier dans les processus d’invasion trophoblastique et d’angiogenèse6. Des études ont montré une augmentation de la densité cellulaire uNK dans l’endomètre des femmes atteintes de RM7,8, bien que cette découverte n’ait pas été associée à un risque accru de fausse couche9. Cependant, cela a stimulé la recherche évaluant la densité d’autres types de cellules immunitaires (telles que les macrophages, les cellules dendritiques utérines) dans l’endomètre chez les femmes atteintes de RM10,11. Néanmoins, il n’est pas certain qu’il y ait une altération significative de la densité des cellules immunitaires dans l’endomètre péri-implantatoire chez les femmes atteintes de RM.
Une explication possible de l’incertitude est que l’évaluation de la densité des cellules immunitaires de l’endomètre pourrait être difficile en raison des changements rapides dans l’endomètre pendant la fenêtre d’implantation. Au cours de la période de 24 heures, des changements importants dans l’endomètre modifient la densité des cellules immunitaires et la sécrétion de cytokines, introduisant une source de variation dans ces résultats12. De plus, la plupart des rapports reposent principalement sur l’utilisation de la coloration unicellulaire (p. ex., les méthodes traditionnelles de LSI) qui ne pouvaient pas examiner plusieurs marqueurs sur la même section de tissu. Bien que la cytométrie en flux puisse être utilisée pour détecter plusieurs populations cellulaires dans un seul échantillon, les grandes quantités de cellules nécessaires et l’optimisation fastidieuse entravent la popularité et l’efficacité de cette méthode. Par conséquent, les progrès récents dans la coloration multiplexE de l’IHC pourraient résoudre ce problème en immunocolorant plusieurs marqueurs sur la même diapositive pour évaluer plusieurs paramètres, y compris la lignée cellulaire et la localisation histologique de sous-populations immunitaires individuelles. De plus, cette technologie peut maximiser les informations obtenues en cas de disponibilité limitée des tissus. En fin de compte, cette technique peut aider à élucider les différences dans les interactions des cellules immunitaires dans l’endomètre entre les femmes fertiles et les femmes atteintes de RM.
Deux groupes de femmes ont été recrutés à l’Hôpital Prince of Wales, y compris les femmes témoins fertiles (FC) et les femmes ayant une fausse couche récurrente inexpliquée (RM). Le contrôle fertile a été défini comme les femmes qui avaient au moins une naissance vivante sans antécédents de fausse couche spontanée, et les femmes RM ont été définies comme celles qui avaient des antécédents de ≥2 fausses couches consécutives avant 20 semaines de gestation. Les sujets des deux groupes répondaient aux critères d’inclusion suivants : (a) âge entre 20 et 42 ans, (b) non-fumeur, (c) cycle menstruel régulier (25-35 jours) et structure utérine normale, (d) pas d’utilisation d’un régime hormonal pendant au moins 3 mois avant la biopsie de l’endomètre, (e) pas d’hydrosalpinx par hystéro-salpingogramme. En outre, tous les sujets recrutés avaient un caryotypage normal, une échographie 3 dimensions normale, un hystérosalpingographie en 3 dimensions, une hormone folliculo-stimulante du jour 2 < 10 UI / L, une progestérone mi-lutéale > 30 nmol / L, une fonction thyroïdienne normale et des anticorps anticoagulants lupiques et anticorps IgG et IgM anticardiolipine.
Pour mieux comprendre la base immunologique de la RM, il serait plus souhaitable de quantifier et de localiser simultanément les principaux types de cellules immunitaires présentes dans l’endomètre au moment de l’implantation. Cet article décrit l’ensemble du protocole, de la préparation des échantillons à l’optimisation du multiplexe avec des marqueurs pour les sous-types de cellules immunitaires et au balayage des lames, suivi de l’analyse des données avec une référence spécifique à la détection des cellules immunitaires de l’endomètre. De plus, cet article décrit comment déterminer la densité et le regroupement des types de cellules immunitaires simultanément dans l’endomètre.
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Protocol
L’étude a été approuvée par le Comité d’éthique de la recherche clinique du cluster Co chinese University of Hong Kong-New Territories East Cluster. Le consentement éclairé des participants a été obtenu avant de prélever les biopsies de l’endomètre. Reportez-vous à la section d’introduction pour connaître les critères d’inclusion des groupes témoin et RM.
1. Préparation de l’échantillon
- Assurez-vous que toutes les femmes de cette étude subissent un test quotidien de jauge d’urine à partir du jour 9 du cycle menstruel pour identifier la poussée d’hormone lutéinisante (LH) afin de détecter l’ovulation et chronométrer les biopsies de l’endomètre précisément le7 e jour après la poussée de LH (LH + 7).
- Obtenez un fragment de biopsie de l’endomètre de0,5 cm 2 à l’aide d’un échantillonneur Pipelle ou d’un curet pipet de femmes fertiles et de femmes atteintes de RM inexpliqué. Étiquetez le récipient et placez immédiatement l’échantillon dans du formol tamponné neutre à 10% (pH 7) pour une fixation pendant la nuit à température ambiante.
REMARQUE: Le volume du fixateur doit être 5 à 10 fois supérieur à celui du tissu. - Placez le tissu dans une cartouche pour la déshydratation dans une machine de traitement des tissus avant de l’incorporer dans de la cire de paraffine fondue. Incorporer les tissus dans de la paraffine à 58-60 °C.
- Laissez le bloc de paraffine refroidir pendant la nuit à température ambiante. Utilisez un microtome pour couper les blocs de paraffine à une épaisseur de 3 μm.
REMARQUE: L’utilisation d’eau distillée aide au montage et à l’adhérence appropriés des tissus tout au long de la coloration multiplex. - Placez le ruban de paraffine dans un bain-marie à 40-45 °C pendant 30 s.
- Montez les sections sur des lames de verre de microscope revêtues de poly-L-lysine (0,1 % p/v). Placez les lames avec le tissu tourné vers le haut et laissez sécher à 37 °C pendant la nuit. Rangez les diapositives dans une boîte à glissière à l’abri des températures extrêmes jusqu’à ce qu’elles soient utilisées ultérieurement.
2. Déterminer la concentration idéale d’anticorps pour l’IHC multiplex à l’aide de l’IHC conventionnel.
REMARQUE: Ceci est important pour identifier le niveau d’expression et le modèle de chaque marqueur immunitaire dans l’échantillon d’endomètre, et déterminer la séquence de coloration de chaque marqueur ainsi que leurs appariements de fluorophores associés à l’amplification du signal tyramide (TSA).
- Testez les anticorps pour déterminer s’ils conviennent à l’IHC multiplex en utilisant l’IHC13conventionnel manuel.
- Utilisez des tissus de l’endomètre pour les tests d’anticorps uniques.
- Inclure un contrôle positif (p. ex., rate) et un contrôle négatif (contrôle de l’isotype) pour optimiser l’état de coloration de chaque anticorps.
- Effectuez la coloration en utilisant la dilution recommandée par la fiche technique de l’anticorps.
- Effectuer une coloration supplémentaire en utilisant des concentrations supérieures et inférieures à la dilution recommandée utilisée à l’étape 2.3.
REMARQUE: Un pathologiste clinique doit évaluer les lames colorées à l’aveugle pour confirmer la localisation du sondage des anticorps et l’intégrité cellulaire.
3. Méthode de coloration multiplex
- Préparation et fixation des diapositives
- Déposer les lames (à partir de l’étape 1.6) à plat avec le tissu tourné vers le haut dans un four et cuire au four à 60 °C pendant au moins 1 h.
- Retirez les glissières du four et laissez-les refroidir pendant au moins 20 minutes à température ambiante avant de les placer dans une grille à glissière verticale.
- Déparaffinez et réhydratez les lames fixées au formol et incorporées à la paraffine avec 10 min allouées à chacune des étapes suivantes : xylène (2x), éthanol à 100 % (2x), éthanol à 95 % (1x), éthanol à 70 % (2x) et eau distillée (2x).
- Placez le rack de diapositives dans une boîte à glissière en plastique et immergez-les dans une solution saline tamponnée Tris (TBS, pH 7,6).
REMARQUE: Les lames doivent rester humides à partir de cette étape de réhydratation jusqu’au montage dans la dernière étape. - Fixez les échantillons en immergeant les lames dans une boîte à lames en plastique remplie d’un mélange de formaldéhyde dilué dans du méthanol (1:9) pendant 30 min dans l’obscurité.
- Lavez les lames deux fois dans de l’eau désionisée pendant 2 minutes, puis procédez à la récupération de l’antigène.
- Récupération d’épitopes
- Placez le rack de lames dans une boîte résistante à la chaleur et remplissez-le de tampon d’acide citrique (pH 6,0) pour couvrir les lames.
- Placez la boîte au micro-ondes et chauffez les lames pendant 50 s à 100 % de puissance, puis 20 min à 20 % de puissance pour maintenir la même température.
- Laissez refroidir les glissières pendant environ 15 minutes à température ambiante.
- Rincez les lames à l’eau pendant 2 min, puis TBS-Tween 20 (TBST) pendant 2 min.
REMARQUE : Le TBST est composé de 25 mM de Tris-HCl (pH 7,5), de 150 mM de NaCl et de 0,05 % de Tween 20 (v/v).
- Bloquant
- Bloquer l’activité endogène de la peroxydase dans les tissus en immergeant la lame sur un pot contenant une solution bloquant la peroxydase (voir la table des matériaux)pendant 10 min.
- Lavez les diapositives avec TBST pendant 5 min.
- Utilisez un stylo barrière hydrophobe pour marquer une limite autour de la section de tissu sur la diapositive.
- Couvrir les coupes de tissus avec un tampon bloquant (voir le tableau des matériaux)ou de l’albumine sérique bovine (5%, p /v), et incuber les lames dans une chambre humidifiée pendant 15 min.
- Application d’anticorps et de signaux
- Retirez les réactifs bloquants.
- Incuber avec l’anticorps primaire d’intérêt (p. ex. CD3, dilution 1:100 dans le diluant d’anticorps, voir tableau 1) dans une chambre humidifiée à température ambiante pendant 30 min.
- Retirez l’anticorps primaire. Laver 3x avec TBST pendant 5 min à chaque fois.
- Incuber avec l’anticorps secondaire marqué au polymère peroxydase de raifort (HRP)(tableau 1)pendant 15 min dans une chambre humidifiée à température ambiante. Laver 3x avec TBST pendant 5 min à chaque fois.
- Appliquer la solution de travail Opal fluorophore TSA (1:100 dans le diluant d’amplification) et incuber à température ambiante pendant 10 min pour permettre la conjugaison du fluorophore à l’échantillon de tissu aux sites primaires de liaison des anticorps. Laver avec TBST en triple exemplaire pendant 5 minutes à chaque fois.
- Décapage à base de micro-ondes
- Rincer avec le tampon de récupération d’antigène (solution tampon de citrate, pH 6,0).
- Effectuer un décapage à base de micro-ondes pour éliminer le complexe primaire-secondaire-RRH afin d’introduire l’anticorps primaire suivant (p. ex., CD20).
- Placez les lames dans un tampon de récupération d’antigène, mettez-les au micro-ondes à 100% de puissance pendant 50 s, puis 20% de puissance pendant 20 minutes dans des récipients allant au micro-ondes et refroidissez-les à température ambiante pendant 15 minutes.
- Répétez les étapes 3.2.4 à 3.5.2 jusqu’à ce que les échantillons de tissus aient été sondés avec tous les anticorps primaires.
- Contre-tache et montage
- Après le décapage et le refroidissement par micro-ondes du tampon de récupération de l’antigène, rincez les lames à l’eau distillée et au TBST.
- Incuber avec une solution de 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) (1,0 μg/mL) pendant 5 min dans une chambre humidifiée à température ambiante.
- Laver 3x avec TBST pendant 5 min à chaque fois. Laver à l’eau une fois pendant 5 min.
- Séchez la glissière à l’air libre et montez-la avec le support de montage approprié (voir le Tableau des matériaux).
REMARQUE : Le contre-maintien ne sera pas nécessaire pour que les diapositives monoplex soient utilisées pour le développement de bibliothèques spectrales.
4. Image et analyse
- Préparation des diapositives de la bibliothèque spectrale
- Créez des diapositives de bibliothèque (images de référence à tache unique) pour chaque fluorophore, DAPI et autofluorescence avec le même tissu de contrôle pour l’analyse d’images multispectrales.
- À l’aide des lames des échantillons de biopsie de l’endomètre provenant de femmes atteintes de RM et de femmes fertiles, effectuez les étapes 1.1 à 3.6.4 pour la détection d’anticorps uniques pour chaque lame (sans ajout d’anticorps ou de fluorophores).
- Pour chaque détection d’anticorps, colorez l’une des lames avec DAPI (comme à l’étape 3.6.2) et laissez une lame non colorée pour la détection de toute autofluorescence tissulaire possible dans le spectre.
- Utilisez les filtres appropriés dans le poste de travail pour obtenir l’image de cet ensemble de diapositives pour chaque anticorps et téléchargez-les dans la bibliothèque d’analyse d’images (comme décrit à l’étape 4.2).
- Une fois l’image capturée, sélectionnez inForm comme source de bibliothèque spectrale et créez la bibliothèque spectrale.
- Lorsque des fluorophores sont utilisés, sélectionnez Stains/Fluors... dans le menu.
- Lors du choix des taches ou des fluorophores, affinez les choix en sélectionnant un ou plusieurs groupes. Sélectionnez Tout pour afficher tous les spectres compatibles avec les images.
- Imagerie spectrale
REMARQUE: Les images ont été capturées à l’aide de la station de travail Mantra avec la bibliothèque spectrale établie à l’aide du logiciel inForm Image Analysis.- Capturez l’image des lames colorées à un seul anticorps à l’aide des filtres d’épifluorescérance appropriés, comme proposé dans le tableau 2 (p. ex., DAPI, isothiocyanate de fluorescéine [FITC], CY3, Texas Red et CY5) à l’aide du poste de travail.
REMARQUE: Les filtres recommandés pour les fluorophores spécifiques utilisés dans ce protocole sont présentés dans le tableau 2. - Identifiez un temps d’exposition approprié pour un signal optimal en examinant chaque marqueur dans son canal de fluorescence correspondant.
REMARQUE: Le signal optimal est déterminé en fonction de la référence sur la positivité et la localisation obtenues dans la coloration d’anticorps unique. - Déterminer un temps d’exposition fixe pour chaque analyte (combinaison anticorps-fluorophore) afin de normaliser une comparaison entre échantillons.
NOTE: La détermination de l’exposition fixe dépend de l’intensité dans l’échantillon d’intérêts. - Scannez les diapositives colorées multiplex dans le mode de numérisation approprié avec l’algorithme de mise au point automatique intégré.
REMARQUE: La bibliothèque spectrale établie serait utilisée pour différencier le cube d’image multispectral en composants individuels uniques (démélange spectral). Cela permettrait de traiter l’identification basée sur la couleur de tous les marqueurs d’intérêt en utilisant les deux étapes principales suivantes: session de formation et session d’analyse d’images.
- Capturez l’image des lames colorées à un seul anticorps à l’aide des filtres d’épifluorescérance appropriés, comme proposé dans le tableau 2 (p. ex., DAPI, isothiocyanate de fluorescéine [FITC], CY3, Texas Red et CY5) à l’aide du poste de travail.
- Analyse d’images
- Comptage cellulaire de types de cellules immunitaires sélectionnés dans l’endomètre
- Capturez un minimum de 10 champs pour une analyse sous un grossissement de 200x.
REMARQUE: Les champs ont été capturés en scannant toute la section sans aucune sélection. Cela peut assurer la capture simultanée de tous les composants cellulaires de l’endomètre, par exemple, la bordure épithéliale luminale, le stroma et les glandes. - Pour compter les cellules, cliquez sur le bouton Compter les objets dans la barre d’étapes pour afficher le panneau Paramètres de comptage des objets.
- Cochez la case Ignorer l’objet si vous touchez un bord pour exclure tout objet touchant le bord de l’image, de la région de traitement ou de la région de tissu.
- Si le tissu a été segmenté, sélectionnez la catégorie de tissu dans laquelle les objets se trouvent. Ne comptez pas les objets en dehors de la catégorie de tissu sélectionnée.
- Sélectionnez l’approche souhaitée pour identifier les objets : Basé sur les objets ou basé sur les pixels (Seuil).
REMARQUE: L’approche basée sur les pixels (seuil) doit être sélectionnée dans le cas d’une tache fiable ou cohérente pour laquelle l’application d’un seuil simple donnera les pixels de l’objet. L’approche basée sur les objets est recommandée lorsque des approches plus avancées basées sur la morphométrie sont nécessaires en cas de manque de cohérence et de spécificité de la coloration des objets. - Sélectionnez la mise à l’échelle du signalsouhaitée : Mise à l’échelle automatique ou Échelle fixe.
REMARQUE : Le choix de l’échelle automatique entraînera une mise à l’échelle automatique de chaque plan de composant avant d’effectuer la segmentation d’objet. L’option Échelle fixe est recommandée lorsque de meilleures performances de segmentation sont requises et que les signaux de coloration sont cohérents et fiables. - Sélectionnez le composant principal pour la segmentation des objets dans la liste déroulante.
- Ajustez la valeur du signal minimum pour le composant principal à la valeur de seuil souhaitée.
- Pour remplir automatiquement les trous dans les objets, sélectionnez Remplir les trous.
- Pour détecter les objets qui touchent d’autres objets en tant qu’objets individuels, plutôt qu’en tant qu’objet, activez la case à cocher Affiner le fractionnement après avoir activé la case à cocher Taille maximale (pixels).
- Pour exclure des objets en fonction de l’arrondi de l’objet, cochez la case Arrondi et spécifiez la circularité minimalesouhaitée .
- Compter toutes les cellules stromales (CD3−/CD20−/CD68−/CD56−, et DAPI+), y compris les cellules entourant les vaisseaux sanguins.
- Compter les cellules immunitaires séparément, y compris les cellules T (CD3+ et DAPI+),les cellules B (CD20+ et DAPI+),les macrophages (CD68+ et DAPI+) et les cellules uNK (CD56+ et DAPI+).
- Exprimez les données sous forme de pourcentages de cellules immunitaires par rapport au nombre total de cellules stromales pour chaque image capturée et indiquez le nombre final de cellules en moyenne de tous les champs.
- Utilisez l’éditeur de vue pour afficher les tables de données résultantes après le traitement. Exportez la table Count Data.
- Quantification de la distribution spatiale des cellules immunitaires de l’endomètre
- Sous un grossissement de 200x, estimer la fonction L à l’aide du programme R pour une plage de 0-20 μm considérée comme une distance maximale de contact cellule-cellule14.
REMARQUE: La boîte à outils de langage R 'spatstat' a été utilisée pour mesurer la fonction L.- Indique le niveau de regroupement de différentes paires de cellules immunitaires en fonction de l’aire sous la courbe (ASC) de leur fonction L.
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Representative Results
Le processus schématique global d’exécution d’un test multiplex à 4 couleurs pour la détection de 4 types de cellules immunitaires de l’endomètre est illustré à la figure 1. En bref, le protocole pour cette coloration par immunofluorescence multiplex nécessitait 8 étapes clés: 1. Préparation des lames, 2. Récupération de l’épitope, 3. Blocage, 4. Application d’anticorps primaires, 5. Application d’anticorps secondaires, 6. Amplification du signal, 7. Retrait de l’anticorps et 8. Contre-tache et montage. Le rendu et l’analyse d’images ont ensuite été effectués à l’aide du poste de travail Mantra avec la bibliothèque spectrale générée à l’aide du logiciel inForm Image Analysis pour différencier les 4 types de cellules immunitaires dans l’échantillon d’endomètre (Figure 2).
Quatre types de cellules immunitaires de l’endomètre peuvent être identifiés dans des échantillons d’endomètre humain à l’aide de cette technique de coloration multiplexe : les lymphocytes T CD3+, les lymphocytes B CD20+, les macrophages CD68+ et les cellules uNK CD56+(Figure 3). Cependant, l’interférence fluorophore doit être soigneusement considérée pour obtenir une image claire et utilisable. Bien que cette technologie multispectrale utilisant la station de travail Mantra puisse prendre en charge jusqu’à 8 tests en plex, l’application des 4 fluorophores utilisés dans ce protocole a démontré des performances optimales sans interférence fluorophore en raison des différences dans les spectres d’émission des fluorophores. En revanche, la coloration multiplex impliquant 5 à 8 fluorophores nécessite souvent plus d’attention aux interférences fluorophores résultant de l’émission des longueurs d’onde partagées.
Pour surmonter cet inconvénient, une coloration monoplexe serait nécessaire pour déterminer l’ordre de chaque anticorps dans le multiplex et identifier le niveau d’expression et le motif de chaque marqueur immunitaire dans l’échantillon d’endomètre. Cela peut aider à déterminer la séquence de coloration des marqueurs et leurs appariements de fluorophores TSA associés. Une fois le test monoplex terminé pour déterminer l’ordre des anticorps à appliquer, l’étape suivante consistera à sélectionner le fluorophore à détecter après une coloration multiplexe. Un fluorophore unique doit être choisi pour chaque anticorps d’intérêt. Le nombre lié à chaque fluorophore serait à peu près la longueur d’onde fluorescente émise lors de l’excitation(tableau 1 et tableau 2). Une approche pour prévenir l’interférence des fluorophores consiste à choisir des paires de fluorophores avec des longueurs d’onde aussi éloignées les unes des autres que possible (en particulier pour les anticorps colocalisants). Cela peut aider à réduire le chevauchement spectral excessif et à fournir une image nette et un phénotypage plus fiable. De plus, l’évaluation méticuleuse en allumant et en désactivant les lasers à partir de l’image composite multiplex dans le logiciel inForm peut également aider à reconnaître les motifs de coloration pour minimiser la saturation en fluorophore(Figure 4).
Pour l’analyse d’images, le nombre de lymphocytes T CD3+, de lymphocytes CD20+ B,de macrophages CD68+, de cellules CD56 + uNK et de cellules stromales dans le stroma de l’endomètre (CD3−/CD20−/CD68−/ CD56− et teinté d’UN DAPI) peut être compté automatiquement à l’aide du logiciel inForm Tissue Finder 14.0(Figure 5). Chaque densité de type de cellule immunitaire a été exprimée en pourcentage par rapport au nombre total de cellules stromales (Figure 5). De même, la quantification de la distribution spatiale des cellules immunitaires de l’endomètre était basée sur les positions X et Y de chaque cellule immunitaire obtenue à partir du système InForm (Figure 6). En utilisant le langage R, le niveau de regroupement de différentes paires de cellules immunitaires basées sur l’ASC peut ensuite être distingué.
Figure 1: Diagramme du flux de travail de coloration. Abréviations : BSA = albumine sérique bovine; HRP = peroxydase de raifort. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2: Poste de travail pour la capture et l’analyse d’images. (A) Mantra Imaging Workstation, (B) image spectrale non traitée, (C) image composite, (D) segmentation tissulaire (compartiments épithéliaux et stromaux), (E) image composite de tissu d’endomètre montrant quatre marqueurs colorés pour identifier différentes populations cellulaires. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3: Imagerie spectrale. L’immunocoloration multiplexe de 4 types de cellules immunitaires différents a été réalisée sur les biopsies de l’endomètred’unefemme témoin fertile et(B)d’une femme atteinte de RM inexpliquée présentée sous forme d’imagerie multispectrale unique. Suite à la production d’une bibliothèque à coloration unique, le démélange spectral pourrait révéler l’imagerie de fluorophores simples représentant (C) CD3, (D) CD56, (E) CD68, (F) CD20, (G) DAPI. Une image composite a ensuite été créée en incorporant tous les fluorophores après imagerie multispectrale(H). Barres d’échelle = 50 μm (A, B). Abréviations : LE = épithélium luminal ; DAPI = 4′,6-diamidino-2-phénylindole; RM = fausse couche récurrente. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4: Outil InForm Counts. L’outil de comptage du logiciel inForm est activé en sélectionnant l’icône de la boîte beige (indiquée par ↓). (A) Préparation d’images, (B, C) segmentation de tissus pour l’entraînement et l’automatisation dessinés à la main, (D) segmentation de cellules individuelles, (E) phénotypage des cellules en fonction de l’intensité du fluorophore, (F) analyse de l’intensité du fluorophore (la boîte rouge indiquant le nombre de cellules positives dans l’intensité du fluorophore sélectionnée), et (G) exportation des résultats pour utilisation (la case rouge indique les options d’exportation). Abréviation : IHC = immunohistochimique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5: Comptage cellulaire. (A) Phénotypage des cellules pour le comptage automatique des cellules et (B) sortie des cellules colorées positivement dans la région segmentée (par exemple, stromal) pour une comparaison plus approfondie et une analyse statistique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6: Mesure de la densité spatiale. (A) Détection automatique de la position des cellules immunitaires colorées positivement dans la région segmentée (par exemple, stromale), (B) affichage de sortie de la coordonnée de chaque cellule immunitaire CD20+ colorée positivement, et (C) détermination de la densité spatiale et de la localisation entre les cellules CD20+ et d’autres cellules immunitaires dans les régions tissulaires segmentées à l’aide de Spatstat. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Commande | Anticorps | Clone | Clonalité | Facteur de dilution des anticorps | Opales | Facteur de dilution de l’opale |
| 1 | CD3 | Sp7 | Monoclonal | 1 sur 100 | Opale 620 | 0.111111111 |
| 2 | CD20 | L26 | Monoclonal | 1 sur 100 | Opale 650 | 0.215277778 |
| 3 | CD68 | Sp251 | Monoclonal | 1 sur 100 | Opale 520 | 0.111111111 |
| 4 | CD56 | CD564 | Monoclonal | 1 sur 100 | Opale 690 | 0.111111111 |
Tableau 1 : Liste des anticorps, des clones et des concentrations utilisés.
| Teindre | Excitation maximale (nm) | Émission maximale (nm) | Détection attendue dans l’ensemble de filtres (nom) | Couleur attendue |
| DAPI | 350 | 470 | DAPI | Bleu |
| Opale 520 | 494 | 525 | Le | Vert |
| Opale 620 | 588 | 616 | Cy3 et Texas Red | Ambre |
| Opale 650 | 627 | 650 | Texas Red et Cy5 | Orange |
| Opale 690 | 676 | 694 | Texas Red et Cy5 | Clair |
Tableau 2 : Liste des fluorophores avec leurs longueurs d’onde maximales d’excitation et d’émission, détection attendue dans les ensembles de filtres appropriés et couleurs observables.
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Discussion
Étapes critiques du protocole
Il est important de noter que la coloration multiplex nécessite une optimisation diligente. La récupération d’antigènes, à l’aide de la technologie du tampon de citrate et des micro-ondes, nécessite une optimisation pour assurer un décapage complet des anticorps et maintenir la viabilité des tissus. Comme les réactifs de la TSA se lient de manière covalente aux sites entourant l’antigène, ils peuvent potentiellement inhiber la liaison d’un anticorps primaire ultérieur par le biais d’une entrave stérique (également connu sous le nom d'« effet parapluie »). Cela a tendance à se produire lorsque plusieurs marqueurs immunitaires résident dans un seul compartiment cellulaire et provoquent une interférence fluorophore. Pour déterminer s’il y aura un effet, il serait essentiel d’effectuer au préalable un IHC / IF monoplexe afin d’identifier tout chevauchement dans la localisation des cellules immunitaires. Comme une coloration à échantillon unique serait nécessaire pour générer la bibliothèque spectrale, les bibliothèques de spectres validées peuvent faciliter la discrimination des signaux individuels afin d’empêcher davantage les interférences fluorophores. Si nécessaire, les concentrations d’anticorps primaires et les temps d’incubation, l’appariement fluorophore-anticorps, les concentrations de fluorophores TSA et l’ordre de coloration peuvent être modifiés pour minimiser les interférences fluorophores. De même, il est important d’équilibrer correctement les concentrations de HRP afin de prévenir la formation de dimères de TSA. Ceci peut être réalisé par la titration d’anticorps primaires et secondaires. De plus, il est d’une importance vitale de se rappeler que les concentrations et les temps d’incubation des anticorps primaires utilisés pour la coloration multiplexe peuvent varier de ceux utilisés dans la coloration chromogène chromogène conventionnelle. Par conséquent, la détermination de la concentration et de l’ordre des anticorps à appliquer pour la coloration multiplex doit être effectuée au préalable.
Modifications et dépannage
Dans cette étude, nous avons utilisé la coloration immunohistochimique à fluorescence multiplex pour détecter simultanément l’interaction de quatre principaux types de cellules immunitaires dans les biopsies de l’endomètre chez les femmes avec et sans RM. Cette technique utilise des anticorps contre CD3 pour les lymphocytes T, CD20 pour les lymphocytes B, CD68 pour les macrophages et CD56 pour les cellules uNK afin de distinguer ces types de cellules. Sur la base de cette méthode, nous avons constaté que les valeurs médianes de densité cellulaire CD3+,CD68 + et CD56+ chez les femmes RM étaient significativement plus élevées que celles des témoins fertiles15. Le regroupement entre les cellules CD56+ uNK et les macrophages CD68+ était significativement plus élevé dans le groupe RM que dans les témoins fertiles. En outre, l’utilisation de cette méthode a révélé que les cellules CD56+ uNK semblaient avoir une corrélation numérique et spatiale avec les macrophages CD68+ dans les deux groupes de femmes. En revanche, les cellules CD56+ uNK ont une corrélation numérique significative mais non spatiale avec les cellules T CD3+ chez les femmes atteintes de RM15. Cette méthode détermine également la relation spatiale de plusieurs types de cellules immunitaires dans l’endomètre. Cependant, la positivité pour un marqueur spécifique peut être limite dans certains cas. Pour surmonter ce problème, il est conseillé d’inclure un contrôle positif et un contrôle négatif pour déterminer le seuil de positivité lors de la construction de la bibliothèque spectrale. De plus, l’évaluation méticuleuse en allumant et en désactivant les lasers à partir de l’image composite multiplex dans le logiciel inForm peut également aider à reconnaître les motifs de coloration pour minimiser la saturation en fluorophores.
Limites de la technique
L’identification de l’interférence fluorophore lors de l’interprétation des données est essentielle pour faire la différence entre la véritable colocalisation des marqueurs et le démélange des artefacts. Cette méthodologie de coloration multiplex utilise des réactifs à base de TSA entraînés par l’amplification enzymatique, ce qui peut augmenter l’intensité du marqueur antigénique de 10 à 100 fois par rapport aux méthodes IF indirectes conventionnelles. Cela génère un risque de dépôt de tyramide hyperactif, ce qui peut entraîner un effet parapluie et / ou un saignement du signal. Pour identifier les dépassements, les niveaux de signal peuvent être évalués visuellement en démixant les images dans inForm et en plaçant le curseur sur des zones lumineuses et positives dans une image de tissu multiplex. Les niveaux de signal doivent généralement rester inférieurs à 30 et idéalement dans un facteur 3 les uns des autres, en particulier pour les fluorophores spectralement adjacents. Des différences de plus de 5 fois dans les signaux pour les fluorophores spectralement adjacents peuvent entraîner des interférences fluorophores et provoquer des artefacts de démélange. Si les niveaux de signal d’un fluorophore montrent plus de 3 fois la différence par rapport au fluorophore adjacent, les concentrations de fluorophore de la TSA doivent être ajustées pour atteindre l’équilibre du signal. Une fois que le signal est confirmé dans la plage correcte, le rapport signal/arrière-plan doit être maintenu à <1:10 pour s’assurer que la coloration positive n’est pas faussement détectée à partir du fond non spécifique.
Comme la diaphonie spectrale peut également créer des interférences fluorophores importantes, l’ordre de coloration doit être ajusté pour séparer les colorants spectralement adjacents à la fois dans la séquence et l’expression des marqueurs. Bien que cette technologie multispectrale utilisant la station de travail Mantra prenne en charge jusqu’à 8 tests plex, l’application de 4 fluorophores, à savoir Opal 520, 540, 620 et 690, démontre les meilleures performances sans interférence fluorophore. L’utilisation de fluorophores ≥5 nécessite souvent plus d’optimisation et de validation pour éviter la diaphonie spectrale en raison des profils spectraux des fluorophores qui partagent des longueurs d’onde proches. En d’autres termes, le nombre de cibles pouvant être détectées simultanément par cette approche n’est limité que par le nombre de bandes de longueurs d’onde et d’ensembles de filtres d’excitation/émission disponibles. Par conséquent, pour exclure une éventuelle surspérage d’un fluorophore TSA qui bloque l’application ultérieure d’autres fluorophores TSA et/ou pour identifier la diaphonie du signal, il est essentiel d’être méticuleux en activant et en désactivant les couches de l’image composite multiplex dans le logiciel inForm; interpréter correctement les motifs de coloration de la coloration IHC unique; et la recherche de pertes, de gains ou de signaux identiques évidents dans un plan correspondant à la localisation dans un autre plan.
La coloration multispectrale nécessite des anticorps associés à des fluorophores spécifiques pour détecter simultanément plusieurs marqueurs. Cet appariement fluorophore-anticorps suit deux règles : i) les fluorophores assignés aux marqueurs co-exprimés doivent être spectralement séparés, et ii) les cibles plus abondantes doivent être associées à des fluorophores de luminosité plus faible ou vice versa. L’ordre de coloration doit également être organisé de manière à ce que les anticorps séquentiels ne colocalisent pas dans les mêmes compartiments cellulaires dans les cellules colorées. Par conséquent, outre les concentrations d’anticorps et les temps d’incubation, qui sont des facteurs critiques dans les méthodes de coloration conventionnelles, des paramètres supplémentaires, tels que l’appariement approprié fluorophore-anticorps, les concentrations de fluorophore tSA, la séquence de coloration et l’exposition d’un anticorps spécifique à un ou plusieurs traitements par micro-ondes, doivent être pris en compte pour réussir la coloration multiplexe. En raison de la grande variabilité des échantillons d’étude, un protocole multiplex donné peut ne pas générer le même résultat dans d’autres types d’échantillons d’étude.
L’ensemble du processus de coloration séquentielle du multiplexe Opal peut prendre de un à plusieurs jours en fonction du nombre de marqueurs impliqués dans le panel et des temps d’incubation des anticorps primaires. En revanche, les méthodes IF standard permettent généralement la visualisation de 4 à 5 marqueurs en une seule série de colorations. Il convient de noter que les conditions optimisées à l’aide de la méthode IHC conventionnelle nécessitent une optimisation supplémentaire avant de procéder à des procédures de coloration multiplex, qui impliquent des traitements micro-ondes supplémentaires et multiples, et l’application de fluorophores TSA qui affecteront finalement l’intensité de coloration de chaque anticorps. Actuellement, les approches d’imagerie qui utilisent des technologies multispectrales peuvent nécessiter des instruments coûteux et dédiés. En outre, il ne peut être limité qu’aux régions d’intérêt sélectionnées par l’image. Par conséquent, cela peut ne pas être optimal pour les laboratoires aux ressources limitées et le dépistage de tissus avec des cibles antigéniques incertaines.
Importance par rapport aux méthodes existantes
Une force particulière de cette méthode actuelle est la capacité de mesurer simultanément la densité de plusieurs types de cellules immunitaires dans l’endomètre, contrairement aux méthodes IHC conventionnelles qui ne peuvent étiqueter qu’un à deux types de cellules dans une seule section de tissu. La cytométrie en flux est une autre méthode qui permet d’analyser les proportions relatives de différents types de cellules immunitaires dans l’échantillon de l’endomètre; cependant, il ne serait pas en mesure de fournir des informations spatiales entre les différents types de cellules immunitaires et la distribution spécifique dans les différents compartiments de l’endomètre. En outre, l’épuisement des tissus est une préoccupation sérieuse dans la pratique clinique, en particulier lors des essais cliniques et lors de l’utilisation d’échantillons de biopsie. Ces deux méthodes conventionnelles nécessiteraient un grand nombre d’échantillons (sections ou cellules) pour optimiser la procédure et pour détecter plusieurs types de cellules immunitaires dans l’endomètre des femmes avec et sans RM.
Comme décrit dans ce protocole, le flux de travail Opal est conçu pour la détection de jusqu’à sept marqueurs dans la même section de tissu à l’aide de la station de travail Mantra. De plus, la réactivité croisée des espèces lors de la sélection des anticorps n’est pas une limitation de cette technologie. En effet, un avantage de cette technologie est qu’elle permet l’utilisation d’anticorps élevés chez la même espèce pour détecter jusqu’à sept marqueurs. Cette approche implique la détection avec des réactifs fluorescents TSA suivis d’un traitement par micro-ondes pour éliminer toute coloration non spécifique. Après le décapage par micro-ondes, une autre série de coloration peut ensuite être effectuée pour une détection supplémentaire de la cible sans risque de réactivité croisée des anticorps. De plus, cette méthode de détection de la TSA peut être effectuée en un minimum de 3 jours pour combiner jusqu’à 7 fluorochromes tout en produisant des résultats fiables pour la détection de cibles protéiques à faible expression. Un autre avantage de la coloration multiplex par rapport à l’étude IHC traditionnelle est son efficacité accrue car la mesure est automatisée, ce qui peut éliminer les biais subjectifs. Les données quantitatives générées représentent les résultats finaux de l’essai.
Applications futures
Le champ d’application de ce protocole multiplex est immense. Il est important de noter qu’il s’agit du premier article à décrire la méthode de détection de l’expression de marqueurs d’immunofluorescence multiplexés à l’aide du mantra Workstation et l’analyse d’images à l’aide du logiciel InForm 2.2.1 pour fournir des résultats précis et reproductibles dans la différenciation de plusieurs populations de cellules immunitaires chez les femmes avec et sans RM. Il est important de noter que la localisation de plusieurs cibles dans la même section de tissu peut fournir un aperçu unique de leurs interactions cellulaires. En fin de compte, cela conduira à une meilleure compréhension du microenvironnement des cellules immunitaires lors de l’implantation embryonnaire chez les femmes atteintes de RM pour établir un traitement ciblé spécifique.
De plus, nos méthodes actuelles ont permis de démontrer que plusieurs cellules immunitaires et leurs interactions peuvent être importantes pour la fonction de l’endomètre. Ceci est démontré par les changements significatifs dans la densité de trois des quatre types de cellules immunitaires de l’endomètre et une augmentation significative du regroupement entre les cellules CD68+ et CD56+. Inversement, les interactions anormales de ces types de cellules immunitaires peuvent être des facteurs prédisposants à la RM. Il est important de noter que, contrairement à la détection d’un seul sous-type de cellules immunitaires de l’endomètre, l’application de cette coloration multiplexe de l’IHC peut fournir une compréhension approfondie de la régulation immunologique de l’implantation embryonnaire. De plus, la quantification et la compréhension des caractéristiques spatiales du microenvironnement immunitaire peuvent aider à faire la lumière sur la biologie de cette maladie dans le contexte des immunothérapies.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Cette étude a été soutenue par le Hong Kong Obstetrical and Gynecological Trust Fund en 2018 et le Hong Kong Health and Medical Research Fund (06170186, 07180226).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amplification Diluent | Perkin Elmer | FP1498 | Fluorophore diluent buffer |
| Antibody diluent | Perkin Elmer | ARD1001EA | Diluting the antibody |
| CD3 | Spring Bioscience | M3072 | Primary antibody |
| CD20 | Biocare Medical | CM004B | Primary antibody |
| CD56 | Leica | NCL-CD56-504 | Primary antibody |
| CD68 | Spring Bioscience | M5510 | Primary antibody |
| Citrate Buffer Solution, pH 6.0 (10x) | Abcam | AB64214 | Antigen retrieval solution |
| EMSURE Xylene (isomeric mixture) | Merck | 108297 | Dewaxing |
| Ethanol absolute | Merck | 107017 | Ethyl alcohol for rehydration |
| HistoCore BIOCUT Manual Rotary Leica Microtome | Leica | RM2125RTS | Sectioning of paraffin-embedded tissue |
| inForm Advanced Image Analysis Software | Perkin Elmer | inForm® Tissue Finder Software 2.2.1 (version 14.0) | Data Analysis software |
| Mantra® Workstation | Akoya Biosciences | CLS140089 | Spectral imaging |
| Microwave | Panasonic | Inverter | Microwave stripping |
| Opal 520 | Perkin Elmer | FP1487A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 620 | Perkin Elmer | FP1495A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 650 | Perkin Elmer | FP1496A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 690 | Perkin Elmer | FP1497A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Oven | Memmert | U10 | Dewaxing |
| Peroxidase Blocking Solution | DAKO | S2023 | Removal of tissue peroxidase activities |
| Poly-L-lysine coated slide | FISHER SCIENTIFIC | 120-550-15 | Slide for routine histological use |
| PolyHRP Broad Spectrum | Perkin Elmer | ARH1001EA | Secondary antibody |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant | ThemoFisher Scientific | P36930 | Mounting |
| Spatstat | / | Version 2.1-0 | Spatial point pattern analysis |
| Spectral DAPI | Perkin Elmer | FP1490A | Nucleic acid staining |
| Tissue Processor | Thermo Fischer | Excelsior ES | Tissue processing for dehydration and paraffination |
| Tris Buffer Saline (TBS), 10x | Cell Signaling Technology | 12498S | Washing solution |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1370-1L | Nonionic detergent |
References
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