Summary
Ondanks de vooruitgang in multiplex immunohistochemie en multispectrale beeldvorming, blijft het karakteriseren van de dichtheid en clustering van belangrijke immuuncellen tegelijkertijd in het endometrium een uitdaging. Dit artikel beschrijft een gedetailleerd multiplexkleuringsprotocol en beeldvorming voor de gelijktijdige lokalisatie van vier immuunceltypen in het endometrium.
Abstract
Immunohistochemie is de meest gebruikte methode voor de identificatie en visualisatie van weefselantigenen in biologisch onderzoek en klinische diagnostiek. Het kan worden gebruikt om verschillende biologische processen of pathologieën te karakteriseren, zoals wondgenezing, immuunrespons, weefselafstoting en weefsel-biomateriaalinteracties. De visualisatie en kwantificering van meerdere antigenen (vooral voor immuuncellen) in een enkele weefselsectie met behulp van conventionele immunohistochemische (IHC) kleuring blijft echter onbevredigend. Vandaar dat de afgelopen jaren multiplextechnologieën zijn geïntroduceerd om meerdere biologische markers te identificeren in een enkel weefselmonster of een ensemble van verschillende weefselmonsters.
Deze technologieën kunnen vooral nuttig zijn bij het differentiëren van de veranderingen in immuuncel-cel-naar-cel interacties binnen het endometrium tussen vruchtbare vrouwen en vrouwen met terugkerende miskramen tijdens implantatie. Dit artikel beschrijft een gedetailleerd protocol voor multiplexed fluorescentie IHC-kleuring om de dichtheid en clustering van vier belangrijke immuunceltypen tegelijkertijd te onderzoeken in nauwkeurig getimede endometriummonsters tijdens embryo-implantatie. De methode omvat monstervoorbereiding, multiplexoptimalisatie met markers voor immuuncelsubtypen en het scannen van de dia's, gevolgd door gegevensanalyse, met specifieke verwijzing naar het detecteren van endometriumimmuuncellen.
Met behulp van deze methode kunnen de dichtheid en clustering van vier belangrijke immuunceltypen in het endometrium tegelijkertijd worden geanalyseerd in een enkele weefselsectie. Daarnaast zal dit artikel de kritieke factoren en probleemoplossing bespreken om mogelijke fluorofoorinterferentie tussen de fluorescerende sondes die worden toegepast te overwinnen. Belangrijk is dat de resultaten van deze multiplexkleuringstechniek kunnen helpen een diepgaand inzicht te krijgen in de immunologische interactie en regulatie tijdens embryo-implantatie.
Introduction
Terugkerende miskraam (RM) kan worden gedefinieerd als het verlies van twee of meer zwangerschappen vóór 24 weken zwangerschap1. Deze frequente reproductieve aandoening treft tot 1% van de paren wereldwijd2,3. De pathofysiologie is multifactorieel en kan worden onderverdeeld in embryologisch gedreven oorzaken (voornamelijk als gevolg van een abnormaal embryonaal karyotype) en maternale oorzaken die het endometrium en / of placenta-ontwikkeling beïnvloeden. Deze manifestatie kan het gevolg zijn van ouderlijke genetische afwijkingen, baarmoederafwijkingen, protrombotische aandoeningen, endocrinologische factoren en immunologische aandoeningen4.
In de afgelopen jaren is immuuneffectorceldisfunctie betrokken geweest bij de pathogenese van vroeg zwangerschapsverlies5. Dit heeft veel onderzoeken geïnspireerd naar het ophelderen van de specifieke populaties van immuuncellen in het baarmoederslijmvlies tijdens de menstruatiecyclus, implantatie en vroege zwangerschap, met specifieke rollen in de vroege zwangerschap. Onder deze immuuncellen spelen baarmoeder natural killer (uNK) cellen een cruciale rol tijdens embryo-implantatie en zwangerschap, met name in de processen van trofoblastische invasie en angiogenese6. Studies hebben een verhoogde uNK-celdichtheid aangetoond in het endometrium van vrouwen met RM7,8, hoewel deze bevinding niet geassocieerd was met een verhoogd risico op een miskraam9. Dit stimuleerde echter onderzoek naar de dichtheid van andere immuunceltypen (zoals macrofagen, baarmoederdendritische cellen) in het endometrium bij vrouwen met RM10,11. Niettemin blijft het onzeker of er een significante verandering is in de immuunceldichtheid in het peri-implantatie endometrium bij vrouwen met RM.
Een mogelijke verklaring voor de onzekerheid is dat evaluatie van de endometrium immuunceldichtheid moeilijk kan zijn vanwege de snelle veranderingen in het endometrium tijdens het venster van implantatie. Gedurende het tijdsbestek van 24 uur veranderen significante veranderingen in het endometrium de immuunceldichtheid en cytokinecretie, waardoor een bron van variatie in deze resultaten wordt geïntroduceerd12. Bovendien vertrouwen de meeste rapporten voornamelijk op het gebruik van eencellige kleuring (bijv. Traditionele IHC-methoden) die niet meerdere markers op hetzelfde weefselgedeelte konden onderzoeken. Hoewel flowcytometrie kan worden gebruikt voor het detecteren van meerdere celpopulaties in een enkel monster, belemmeren de grote hoeveelheden cellen die nodig zijn en de tijdrovende optimalisatie de populariteit en efficiëntie van deze methode. Vandaar dat de recente vooruitgang in multiplex IHC-kleuring dit probleem zou kunnen oplossen door meerdere markers op dezelfde dia te immunostainen om meerdere parameters te evalueren, waaronder cellijn en histologische lokalisatie van individuele immuunsubpopulaties. Verder kan deze technologie de verkregen informatie maximaliseren in geval van beperkte beschikbaarheid van weefsel. Uiteindelijk kan deze techniek helpen bij het ophelderen van de verschillen in immuuncelinteracties in het baarmoederslijmvlies tussen vruchtbare vrouwen en vrouwen met RM.
Twee groepen vrouwen werden gerekruteerd uit het Prince of Wales Hospital, waaronder vruchtbare controlevrouwen (FC) en vrouwen met onverklaarbare terugkerende miskraam (RM). Vruchtbare controle werd gedefinieerd als vrouwen die ten minste één levende geboorte hadden zonder enige geschiedenis van spontane miskraam, en RM-vrouwen werden gedefinieerd als degenen die een voorgeschiedenis hadden van ≥2 opeenvolgende miskramen vóór 20 weken zwangerschap. De proefpersonen uit de twee groepen voldeden aan de volgende inclusiecriteria: (a) leeftijd tussen 20 en 42 jaar oud, (b) niet-roker, (c) regelmatige menstruatiecyclus (25-35 dagen) en normale baarmoederstructuur, (d) geen gebruik van een hormonaal regime gedurende ten minste 3 maanden vóór de endometriumbiopsie, (e) geen hydrosalpinx door hystero-salpingogram. Bovendien hadden alle gerekruteerde proefpersonen normale karyotypering, normaal 3-dimensionaal echografie hysterosalpingogram, dag 2 follikelstimulerend hormoon < 10 IE / L, mid-luteale progesteron > 30 nmol / L, normale schildklierfunctie en negatief getest op lupus anticoagulantia en anticardiolipine IgG- en IgM-antilichamen.
Om de immunologische basis van RM beter te begrijpen, zou het het meest wenselijk zijn om tegelijkertijd de belangrijkste immuunceltypen die aanwezig zijn in het endometrium op het moment van implantatie te kwantificeren en te lokaliseren. Dit artikel beschrijft het volledige protocol van monstervoorbereiding, de multiplexoptimalisatie met markers voor immuuncelsubtypen en het scannen van de dia's, gevolgd door gegevensanalyse met specifieke verwijzing naar het detecteren van endometriumimmuuncellen. Bovendien beschrijft dit artikel hoe de dichtheid en clustering van de immuunceltypen tegelijkertijd in het endometrium kunnen worden bepaald.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De studie werd goedgekeurd door de Joint Chinese University of Hong Kong-New Territories East Cluster Clinical Research Ethics Committee. Geïnformeerde toestemming werd verkregen van de deelnemers voordat de endometriumbiopten werden verzameld. Raadpleeg het introductiegedeelte voor de inclusiecriteria van de controle- en RM-groepen.
1. Monstervoorbereiding
- Zorg ervoor dat alle vrouwen in deze studie een dagelijkse urinepeilstoktest ondergaan vanaf dag 9 van de menstruatiecyclus om de luteïniserende hormoon (LH) -piek te identificeren om ovulatie te detecteren, en time de endometriumbiopten precies op de7e dag na de LH-piek (LH + 7).
- Verkrijg een 0,5 cm2 fragment van de endometriumbiopsie met behulp van een Pipelle sampler of Pipet Curet van vruchtbare vrouwen en vrouwen met onverklaarbare RM. Label de container en plaats het monster onmiddellijk in 10% neutraal gebufferde formaline (pH 7) voor nachtelijke fixatie bij kamertemperatuur.
OPMERKING: Het volume van het fixatief moet 5-10 keer dat van weefsel zijn. - Plaats het weefsel in een patroon voor uitdroging in een weefselverwerkingsmachine voordat u het ingesmolten paraffine insluit. Sluit de weefsels in paraffine in bij 58-60 °C.
- Laat het paraffineblok 's nachts afkoelen bij kamertemperatuur. Gebruik een microtoom om de paraffineblokken te trimmen tot een dikte van 3 μm.
OPMERKING: Het gebruik van gedestilleerd water helpt bij de juiste weefselmontage en hechting tijdens multiplexkleuring. - Plaats het paraffinelint in een waterbad bij 40-45 °C gedurende 30 s.
- Monteer de secties op poly-L-lysine (0,1% w / v) -gecoate microscoopglasglaasjes. Plaats de glaasjes met het weefsel naar boven gericht en laat een nacht drogen bij 37 °C. Bewaar de dia's in een schuifdoos uit de buurt van extreme temperaturen tot verder gebruik.
2. Bepaal de ideale concentratie van antilichamen voor multiplex IHC met behulp van conventionele IHC.
OPMERKING: Dit is belangrijk voor het identificeren van het expressieniveau en het patroon van elke immuunmarker in het endometriummonster en het bepalen van de kleuringsvolgorde van elke marker en hun geassocieerde tyramidesignaalversterking (TSA) fluorofoorparen.
- Test de antilichamen op hun geschiktheid voor multiplex IHC met behulp van handmatige conventionele IHC13.
- Gebruik endometriumweefsels voor het testen van één antilichaam.
- Neem een positieve controle (bijv. Milt) en negatieve controle (isotypecontrole) op voor het optimaliseren van de kleuringsconditie van elk antilichaam.
- Voer de kleuring uit met behulp van de verdunning die wordt aanbevolen door het gegevensblad van het antilichaam.
- Voer extra kleuring uit met concentraties boven en onder de aanbevolen verdunning die in stap 2.3 is gebruikt.
OPMERKING: Een klinisch patholoog moet de bevlekte dia's blindelings beoordelen om de lokalisatie van het antilichaamonderzoek en de cellulaire integriteit te bevestigen.
3. Multiplex kleurmethode
- Diavoorbereiding en fixatie
- Leg de glaasjes (vanaf stap 1.6) plat met het weefsel naar boven gericht in een oven en bak gedurende ten minste 1 uur op 60 °C.
- Haal de platen uit de oven en laat ze minstens 20 minuten afkoelen bij kamertemperatuur voordat je ze in een verticaal schuifrek plaatst.
- Was en rehydrateer de formaline-gefixeerde, paraffine-ingebedde dia's met 10 min toegewezen aan elk van de volgende stappen: xyleen (2x), 100% ethanol (2x), 95% ethanol (1x), 70% ethanol (2x) en gedestilleerd water (2x).
- Plaats het rek met dia's in een plastic schuifdoos en dompel ze onder in Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS, pH 7,6).
OPMERKING: De dia's moeten vochtig blijven vanaf deze rehydratatiestap tot de montage in de laatste stap. - Bevestig de monsters door de dia's gedurende 30 minuten in het donker onder te dompelen in een plastic diadoos gevuld met een mengsel van formaldehyde verdund in methanol (1:9).
- Was de glaasjes twee keer in gedeïoniseerd water gedurende 2 minuten en ga dan verder met het ophalen van antigeen.
- Epitoop ophalen
- Plaats het rek met dia's in een hittebestendige doos en vul deze met citroenzuurbuffer (pH 6,0) om de dia's te bedekken.
- Plaats de doos in de magnetron en verwarm de dia's gedurende 50 s op 100% vermogen gevolgd door 20 minuten op 20% vermogen om dezelfde temperatuur te behouden.
- Laat de glijbanen ongeveer 15 minuten afkoelen bij kamertemperatuur.
- Spoel de glaasjes gedurende 2 minuten in water, gevolgd door TBS-Tween 20 (TBST) gedurende 2 minuten.
OPMERKING: TBST bestaat uit 25 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl en 0,05% Tween 20 (v/v).
- Blokkeren
- Blokkeer de endogene peroxidase-activiteit in het weefsel door de dia gedurende 10 minuten onder te dompelen in een pot met peroxidaseblokkerende oplossing (zie de materiaaltabel).
- Was de dia's met TBST gedurende 5 minuten.
- Gebruik een hydrofobe barrièrepen om een grens rond het weefselgedeelte op de dia te markeren.
- Bedek de weefselsecties met een blokkerende buffer (zie de tabel met materialen)of runderserumalbumine (5%, w/v) en incubeer de dia's gedurende 15 minuten in een bevochtigde kamer.
- Toepassing van antilichamen en signalen
- Verwijder de blokkerende reagentia.
- Incubeer met het primaire antilichaam van belang (bijv. CD3, 1:100 verdunning in antilichaamverdunningsmiddel, zie tabel 1) in een bevochtigde kamer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
- Verwijder het primaire antilichaam. Was 3x met TBST gedurende 5 minuten elke keer.
- Incubeer met het polymeer mierikswortelperoxidase (HRP)-gelabeld secundair antilichaam(tabel 1)gedurende 15 minuten in een bevochtigde kamer bij kamertemperatuur. Was 3x met TBST gedurende 5 minuten elke keer.
- Breng de Opal fluorofoor TSA-werkoplossing (1:100 in amplificatieverdunningsmiddel) aan en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten om fluorofoorconjugatie naar het weefselmonster op primaire antilichaambindingsplaatsen mogelijk te maken. Was met TBST telkens in drievoud gedurende 5 minuten.
- Strippen op basis van magnetron
- Spoel af met de antigeenophaalbuffer (citraatbufferoplossing, pH 6,0).
- Voer microgolfgebaseerde stripping uit om het primair-secundaire HRP-complex te verwijderen om het volgende primaire antilichaam (bijv. CD20) te introduceren.
- Plaats de dia's in de antigeenophaalbuffer, zet ze gedurende 50 s op 100% vermogen, gevolgd door 20% stroom gedurende 20 minuten in magnetronveilige containers en koel ze gedurende 15 minuten op kamertemperatuur.
- Herhaal stap 3.2.4 tot en met 3.5.2 totdat de weefselmonsters zijn onderzocht met alle primaire antilichamen.
- Counterstain en montage
- Na het strippen en koelen van de antigeenophaalbuffer in de magnetron, spoelt u de glaasjes in gedestilleerd water en TBST.
- Incubeer met 4', 6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) oplossing (1,0 μg/ml) gedurende 5 minuten in een bevochtigde kamer bij kamertemperatuur.
- Was 3x met TBST gedurende 5 minuten elke keer. Eenmaal wassen met water gedurende 5 min.
- Droog de schuif aan de lucht en monteer met het juiste montagemedium (zie de tabel met materialen).
OPMERKING: Counterstaining is niet vereist voor monoplex-dia's die worden gebruikt voor de ontwikkeling van spectrale bibliotheken.
4. Beeld en analyse
- Voorbereiding van Spectral bibliotheek dia's
- Maak bibliotheekdia's (referentieafbeeldingen met één kleuring) voor elke fluorofoor, DAPI en autofluorescentie met hetzelfde controleweefsel voor multispectrale beeldanalyse.
- Gebruik de dia's van de endometriumbiopsiemonsters van vrouwen met RM en vruchtbare vrouwen om stappen 1.1 tot 3.6.4 uit te voeren voor detectie van één antilichaam voor elke dia (zonder verdere toevoeging van antilichamen of fluoroforen).
- Voor elke antilichaamdetectie kleurt u een van de dia's met DAPI (zoals in stap 3.6.2) en laat u één dia onbevlekt voor de detectie van mogelijke weefselautofluorescentie in het spectrum.
- Gebruik de juiste filters in het werkstation om de afbeelding voor deze set dia's voor elk antilichaam te verkrijgen en upload deze naar de beeldanalysebibliotheek (zoals beschreven in stap 4.2).
- Zodra de afbeelding is vastgelegd, selecteert u inForm als spectrale bibliotheekbron en bouwt u de spectrale bibliotheek.
- Aangezien fluoroforen worden gebruikt, selecteert u Vlekken/fluors... in het menu.
- Terwijl u de vlekken of fluoroforen kiest, beperkt u de keuzes door een of meer groepen te selecteren. Selecteer Alles om alle spectra weer te geven die compatibel zijn met de afbeeldingen.
- Spectrale beeldvorming
OPMERKING: Beelden zijn vastgelegd met behulp van het Mantra Workstation met de spectrale bibliotheek die is ingesteld met behulp van de inForm Image Analysis-software.- Leg het beeld van de met één antilichaam bevlekte dia's vast met de juiste epifluorescentiefilters zoals voorgesteld in tabel 2 (bijv. DAPI, fluoresceïne-isothiocyanaat [FITC], CY3, Texas Red en CY5) met behulp van het werkstation.
OPMERKING: Aanbevolen filters voor de specifieke fluoroforen die in dit protocol worden gebruikt, zijn weergegeven in tabel 2. - Identificeer een geschikte belichtingstijd voor een optimaal signaal door elke marker in het bijbehorende fluorescentiekanaal te onderzoeken.
OPMERKING: Het optimale signaal wordt bepaald volgens de referentie over de positiviteit en lokalisatie verkregen in de kleuring van het enkele antilichaam. - Bepaal een vaste blootstellingstijd voor elke analyt (antilichaam-fluorofoorcombinatie) om een vergelijking tussen monsters te standaardiseren.
OPMERKING: De bepaling van de vaste blootstelling is afhankelijk van de intensiteit in de steekproef van belangen. - Scan de multiplex bevlekte dia's in de juiste scanmodus met het ingebouwde autofocusalgoritme.
OPMERKING: De gevestigde spectrale bibliotheek zou worden gebruikt om de multispectrale beeldkubus te differentiëren in afzonderlijke afzonderlijke componenten (spectrale ontmenging). Hierdoor zou de op kleur gebaseerde identificatie voor alle markers van belang kunnen worden verwerkt met behulp van de volgende twee hoofdstappen: trainingssessie en beeldanalysesessie.
- Leg het beeld van de met één antilichaam bevlekte dia's vast met de juiste epifluorescentiefilters zoals voorgesteld in tabel 2 (bijv. DAPI, fluoresceïne-isothiocyanaat [FITC], CY3, Texas Red en CY5) met behulp van het werkstation.
- Beeldanalyse
- Celtelling van geselecteerde immuunceltypen in het endometrium
- Leg minimaal 10 velden vast voor analyse onder 200x vergroting.
OPMERKING: De velden zijn vastgelegd door de hele sectie te scannen zonder enige selectie. Dit kan zorgen voor de gelijktijdige opname van alle celcomponenten van het endometrium, bijvoorbeeld de luminale epitheelrand, stroma en klieren. - Als u de cellen wilt tellen, klikt u op de knop Objecten tellen in de stappenbalk om het deelvenster Instellingen voor objecttelling weer te geven.
- Schakel het selectievakje Object verwijderen als u een rand aanraakt in voor de uitsluiting van objecten die de rand van de afbeelding, het procesgebied of het weefselgebied raken.
- Als het weefsel is gesegmenteerd, selecteert u de weefselcategorie waarin de objecten te vinden zijn. Tel geen objecten buiten de geselecteerde weefselcategorie.
- Selecteer de gewenste aanpak om objecten te identificeren: Objectgebaseerd of Pixelgebaseerd (drempelwaarde).
OPMERKING: De pixelgebaseerde (drempel) benadering moet worden geselecteerd in het geval van een betrouwbare of consistente vlek waarvoor de toepassing van een eenvoudige drempel de objectpixels oplevert. De objectgebaseerde benadering wordt aanbevolen wanneer meer geavanceerde op morfometrie gebaseerde benaderingen vereist zijn in geval van gebrek aan consistentie en specificiteit van kleuring van objecten. - Selecteer de gewenste signaalschaling: Automatisch schalen of Vaste schaal.
OPMERKING: Als u Automatisch schalen kiest, wordt elk componentvlak automatisch geschaald voordat objectsegmentatie wordt uitgevoerd. De optie Vaste weegschaal wordt aanbevolen wanneer betere segmentatieprestaties vereist zijn en vleksignalen consistent en betrouwbaar zijn. - Selecteer de component Primair voor objectsegmentatie in de vervolgkeuzelijst.
- Pas de minimumsignaalwaarde voor de primaire component aan op de gewenste drempelwaarde.
- Als u automatisch gaten in objecten wilt opvullen, selecteert u Gaten vullen.
- Als u objecten wilt detecteren die andere objecten als afzonderlijke objecten raken in plaats van als één object, schakelt u het selectievakje Splitsen verfijnen in nadat u het selectievakje Maximale grootte (pixels) hebt ingeschakeld.
- Als u objecten wilt uitsluiten op basis van de ronding van het object, schakelt u het selectievakje Ronding in en geeft u de gewenste minimale circulariteit op.
- Tel alle stromale cellen (CD3−/CD20−/CD68−/CD56−en DAPI+), inclusief de cellen rond de bloedvaten.
- Tel de immuuncellen afzonderlijk, inclusief T-cellen (CD3+ en DAPI+), B-cellen (CD20+ en DAPI+), macrofagen (CD68+ en DAPI+) en uNK-cellen (CD56+ en DAPI+).
- Druk de gegevens uit als de percentages van de immuuncellen ten opzichte van het totale aantal stromale cellen voor elk vastgelegd beeld en rapporteer het uiteindelijke celgetal als een gemiddelde van alle velden.
- Gebruik de weergave-editor om de resulterende gegevenstabellen na verwerking weer te geven. Exporteer de tabel Aantal gegevens.
- Kwantificering van de ruimtelijke verdeling van endometriumimmuuncellen
- Onder 200x vergroting, schat de L-functie met behulp van het R-programma voor een bereik van 0-20 μm beschouwd als een cel-cel contact maximale afstand14.
OPMERKING: De R-taal toolbox 'spatstat' werd gebruikt om de L-functie te meten.- Geef het niveau van clustering van verschillende paren immuuncellen aan op basis van het gebied onder de curve (AUC) van hun L-functie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het algemene schematische proces van het uitvoeren van een 4-kleuren multiplextest voor de detectie van 4 endometriumimmuunceltypen is weergegeven in figuur 1. Kortom, het protocol voor deze multiplex immunofluorescentiekleuring vereiste 8 belangrijke stappen: 1. Diavoorbereiding, 2. Epitoop ophalen, 3. Blokkeren, 4. Primaire antilichaamtoepassing, 5. Secundaire antilichaamtoepassing, 6. Signaalversterking, 7. Verwijdering van antilichamen en 8. Counterstain en mount. Beeldweergave en -analyse werden vervolgens uitgevoerd met behulp van het Mantra Workstation met de spectrale bibliotheek gegenereerd met behulp van de inForm Image Analysis-software voor het differentiëren van de 4 immuunceltypen in het endometriummonster(figuur 2).
Vier endometrium immuunceltypen kunnen worden geïdentificeerd in menselijke endometriummonsters met behulp van deze multiplexkleuringstechniek: CD3 + T-cellen, CD20 + B-cellen, CD68 + macrofagen en CD56 + uNK-cellen (Figuur 3). Fluorofoorinterferentie moet echter zorgvuldig worden overwogen om een duidelijk en bruikbaar beeld te verkrijgen. Hoewel deze multispectrale technologie met behulp van het Mantra Workstation tot 8-plex assays kan ondersteunen, toonde de toepassing van de 4 fluoroforen die in dit protocol worden gebruikt optimale prestaties zonder fluorofoorinterferentie als gevolg van de verschillen in emissiespectra van de fluoroforen. Multiplexkleuring met 5-8 fluoroforen vereist daarentegen vaak meer aandacht voor fluorofoorinterferentie als gevolg van emittantie van de gedeelde golflengten.
Om dit nadeel te ondervangen, zou monoplexkleuring nodig zijn om de volgorde van elk antilichaam in de multiplex te bepalen en het expressieniveau en patroon van elke immuunmarker in het endometriummonster te identificeren. Dit kan helpen om de kleurvolgorde van de markers en hun bijbehorende TSA-fluorofoorparen te bepalen. Zodra de monoplex-test is voltooid voor het bepalen van de volgorde van de toe te passen antilichamen, is de volgende stap het selecteren van de fluorofoor voor detectie na multiplexkleuring. Voor elk interessant antilichaam moet een unieke fluorofoor worden gekozen. Het getal dat gerelateerd is aan elke fluorofoor zou ruwweg de fluorescerende golflengte zijn die wordt uitgezonden tijdens excitatie(tabel 1 en tabel 2). Een benadering om fluorofoorinterferentie te voorkomen, is om fluorofoorparen te kiezen met golflengten zo ver mogelijk van elkaar (vooral voor het co-lokaliseren van antilichamen). Dit kan helpen overtollige spectrale overlap te verminderen en een scherp beeld en betrouwbaardere fenotypering te bieden. Bovendien kan de nauwgezette evaluatie door lasers in en uit te schakelen van het multiplexcomposietbeeld in de inForm-software ook helpen bij het herkennen van de kleuringspatronen om fluorofoorverzadiging te minimaliseren(figuur 4).
Voor beeldanalyse kan het aantal CD3+ T-cellen, CD20+ B-cellen, CD68+ macrofagen, CD56+ uNK-cellen en stromale cellen in het endometriumstroma (CD3−/ CD20−/ CD68−/ CD56− en DAPI-gekleurd) automatisch worden geteld met behulp van de inForm Tissue Finder Software 14.0 (Figuur 5). De dichtheid van elk immuunceltype werd uitgedrukt als een percentage ten opzichte van het totale aantal stromale cellen (figuur 5). Evenzo was de kwantificering van de ruimtelijke verdeling van de endometriumimmuuncellen gebaseerd op de X- en Y-positie van elke afzonderlijke immuuncel verkregen uit het InForm-systeem (figuur 6). Met behulp van de R-taal kan vervolgens het niveau van clustering van verschillende paren immuuncellen op basis van de AUC worden onderscheiden.
Figuur 1: Kleuringsworkflowdiagram. Afkortingen: BSA = bovine serum albumin; HRP = mierikswortelperoxidase. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Werkstation voor beeldopname en -analyse. (A) Mantra Imaging Workstation, (B) onbewerkt Spectraal beeld, (C) samengesteld beeld, (D) weefselsegmentatie (epitheliale en stromale compartimenten), (E) samengesteld beeld van endometriumweefsel met vier gekleurde markers om verschillende celpopulaties te identificeren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Spectrale beeldvorming. Multiplex immunostaining van 4 verschillende immuunceltypen werd uitgevoerd op de endometriumbiopten van (A) een vruchtbare controlevrouw en (B) een vrouw met onverklaarbare RM gepresenteerd als enkele multispectrale beeldvorming. Na de productie van een single-stained bibliotheek, zou spectrale ontmenging beeldvorming kunnen onthullen van enkele fluoroforen die (C) CD3, (D) CD56, (E) CD68, (F) CD20, (G) DAPI vertegenwoordigen. Vervolgens werd een samengesteld beeld gemaakt door alle fluoroforen na multispectrale beeldvorming ( H ) op tenemen. Schaalbalken = 50 μm (A, B). Afkortingen: LE = luminaal epitheel; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindool; RM = recidiverende miskraam. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Gereedschap InForm Counts. De inForm software counts tool wordt geactiveerd door het beige box icoontje te selecteren (aangegeven door ↓). (A) Beeldvoorbereiding, (B, C) segmentering van weefsel voor handgetekende training en automatisering, (D) segmentering van individuele cellen, (E) fenotypering van de cellen op basis van de fluorofoorintensiteit, (F) analyse voor fluorofoorintensiteit (het rode vak met het aantal positieve cellen in de geselecteerde fluorofoorintensiteit) en (G) het exporteren van de resultaten voor gebruik (het rode vak geeft de exportopties aan). Afkorting: IHC = immunohistochemisch. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Celtelling. (A) Fenotypering van de cellen voor automatische celtelling en (B) output van de positief gekleurde cellen in het gesegmenteerde gebied (bijv. stromaal) voor verdere vergelijking en statistische analyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Meting van de ruimtelijke dichtheid. (A) Automatische detectie van de positie van positief gekleurde immuuncellen in het gesegmenteerde gebied (bijv. stromaal), (B) uitvoerweergave van de coördinaat van elke positief gekleurde CD20+ immuuncel, en (C) het bepalen van de ruimtelijke dichtheid en lokalisatie tussen CD20+ cellen en andere immuuncellen in de gesegmenteerde weefselgebieden met behulp van Spatstat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Bevelen | Antistof | Kloon | Klonaliteit | Antilichaam verdunningsfactor | Opalen | Opaal verdunningsfactor |
| 1 | cd3 | Sp7 | Monoclonal | 1 op de 100 | Opaal 620 | 0.111111111 |
| 2 | cd20 | L26 | Monoclonal | 1 op de 100 | Opaal 650 | 0.215277778 |
| 3 | cd68 | Sp251 | Monoclonal | 1 op de 100 | Opaal 520 | 0.111111111 |
| 4 | cd56 | cd564 | Monoclonal | 1 op de 100 | Opaal 690 | 0.111111111 |
Tabel 1: Lijst van gebruikte antilichamen, klonen en concentraties.
| Kleurstof | Excitatie maximum (nm) | Emissiemaximum (nm) | Verwachte detectie in filterset (naam) | Verwachte kleur |
| Dapi | 350 | 470 | Dapi | Blauw |
| Opaal 520 | 494 | 525 | Fitc | Groen |
| Opaal 620 | 588 | 616 | Cy3 en Texas Red | Barnsteen |
| Opaal 650 | 627 | 650 | Texas Rood en Cy5 | Oranje |
| Opaal 690 | 676 | 694 | Texas Rood en Cy5 | Duidelijk |
Tabel 2: Lijst van fluoroforen met hun maximale excitatie- en emissiegolflengten, verwachte detectie in geschikte filtersets en waarneembare kleuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritieke stappen binnen het protocol
Het is belangrijk op te merken dat multiplexkleuring ijverige optimalisatie vereist. Antigeenherstel, met behulp van citraatbuffer- en microgolftechnologie, vereist optimalisatie om volledige antilichaamstripping te garanderen en de levensvatbaarheid van weefsel te behouden. Omdat TSA-reagentia covalent binden aan plaatsen rond het antigeen, kunnen ze mogelijk de binding van een volgend primair antilichaam remmen door sterische belemmering (ook bekend als het "paraplu-effect"). Dit heeft de neiging om op te treden wanneer meerdere immuunmarkers zich in een enkel celcompartiment bevinden en fluorofoorinterferentie veroorzaken. Om te bepalen of er een effect zal zijn, zou het van cruciaal belang zijn om vooraf monoplex IHC / IF uit te voeren om eventuele overlapping in de lokalisatie van de immuuncellen te identificeren. Aangezien kleuring met één monster nodig zou zijn voor het genereren van de spectrale bibliotheek, kunnen gevalideerde spectrabibliotheken de discriminatie van individuele signalen vergemakkelijken om fluorofoorinterferentie verder te voorkomen. Indien nodig kunnen primaire antilichaamconcentraties en incubatietijden, fluorofoor-antilichaamparen, TSA-fluorofoorconcentraties en kleurvolgorde worden gewijzigd om fluorofoorinterferentie te minimaliseren. Evenzo is het belangrijk om HRP-concentraties goed in evenwicht te brengen om TSA-dimeervorming te voorkomen. Dit kan worden bereikt door de titratie van primaire en secundaire antilichamen. Bovendien is het van vitaal belang om te onthouden dat de concentraties en incubatietijden van primaire antilichamen die worden gebruikt voor multiplexkleuring kunnen verschillen van die welke worden gebruikt in conventionele chromogene single-staining. Daarom moet de bepaling van de concentratie en volgorde van antilichamen die moeten worden toegepast voor multiplexkleuring vooraf worden uitgevoerd.
Wijzigingen en probleemoplossing
In deze studie gebruikten we multiplex fluorescentie immunohistochemische kleuring om tegelijkertijd de interactie van vier belangrijke immuunceltypen in endometriumbiopten van vrouwen met en zonder RM te detecteren. Deze techniek maakt gebruik van antilichamen tegen CD3 voor T-cellen, CD20 voor B-cellen, CD68 voor macrofagen en CD56 voor uNK-cellen om onderscheid te maken tussen deze celtypen. Op basis van deze methode vonden we dat de mediane CD3+,CD68+en CD56+ celdichtheidswaarden bij de RM-vrouwen significant hoger waren dan die van de vruchtbare controles15. De clustering tussen CD56+ uNK-cellen en CD68+ macrofagen was significant hoger in de RM-groep dan in de vruchtbare controles. Bovendien bleek uit het gebruik van deze methode dat CD56+ uNK-cellen zowel numerieke als ruimtelijke correlatie leken te hebben met CD68+ macrofagen in beide groepen vrouwen. Daarentegen hebben CD56+ uNK-cellen een significante numerieke maar geen ruimtelijke correlatie met CD3+ T-cellen bij vrouwen met RM15. Deze methode bepaalt ook de ruimtelijke relatie van meerdere immuunceltypen in het baarmoederslijmvlies. De positiviteit voor een specifieke marker kan echter in sommige gevallen borderline zijn. Om dit probleem op te lossen, is het raadzaam om een positieve controle en een negatieve controle op te nemen om de drempel van positiviteit te bepalen bij het construeren van de spectrale bibliotheek. Bovendien kan de nauwgezette evaluatie door lasers in en uit te schakelen van het multiplexcomposietbeeld in de inForm-software ook helpen bij het herkennen van de kleuringspatronen om fluorofoorverzadiging te minimaliseren.
Beperkingen van de techniek
Identificatie van fluorofoorinterferentie tijdens gegevensinterpretatie is essentieel om onderscheid te maken tussen echte colokalisatie van markers en ontmengende artefacten. Deze multiplexkleuringsmethodologie maakt gebruik van TSA-gebaseerde reagentia aangedreven door enzymatische versterking, die de antigeenmarkerintensiteit met 10-100 keer kan verhogen in vergelijking met conventionele indirecte IF-methoden. Dit genereert een risico op overactieve tyramideafzetting, wat mogelijk resulteert in een overkoepelend effect en /of signaaldoorbloeding. Om overstaining te identificeren, kunnen signaalniveaus visueel worden beoordeeld door afbeeldingen in inForm te mengen en de cursor over heldere, positieve gebieden in een multiplexweefselbeeld te bewegen. Signaalniveaus moeten meestal onder de 30 blijven en idealiter binnen een factor 3 van elkaar, met name voor spectraal aangrenzende fluoroforen. Meer dan 5-voudige verschillen in signalen voor spectraal aangrenzende fluoroforen kunnen leiden tot fluorofoorinterferentie en ontmengbare artefacten veroorzaken. Als signaalniveaus van een fluorofoor meer dan 3 keer het verschil vertonen met de aangrenzende fluorofoor, moeten de TSA-fluorofoorconcentraties worden aangepast om signaalbalans te bereiken. Zodra is bevestigd dat het signaal zich in het juiste bereik bevindt, moet de signaal-achtergrondverhouding op < 1:10 worden gehouden om ervoor te zorgen dat de positieve kleuring niet ten onrechte wordt gedetecteerd vanaf de niet-specifieke achtergrond.
Omdat spectrale overspraak ook significante fluorofoorinterferentie kan veroorzaken, moet de volgorde van kleuring worden aangepast om spectraal aangrenzende kleurstoffen te scheiden in zowel volgorde als expressie van markers. Hoewel deze multispectrale technologie met behulp van het Mantra Workstation tot 8-plex assays ondersteunt, toont de toepassing van 4 fluoroforen, namelijk Opal 520, 540, 620 en 690, de beste prestaties zonder fluorofoorinterferentie. Het gebruik van ≥5 fluoroforen vereist vaak meer optimalisatie en validatie om spectrale overspraak te voorkomen vanwege de spectrale profielen van fluoroforen die nabije golflengten delen. Met andere woorden, het aantal doelen dat tegelijkertijd door deze benadering kan worden gedetecteerd, wordt alleen beperkt door het aantal beschikbare golflengtebanden en excitatie- / emissiefiltersets. Om mogelijke overstaining van een TSA-fluorofoor uit te sluiten die verdere toepassing van andere TSA-fluoroforen blokkeert en / of om signaaloverspraak te identificeren, is het daarom essentieel om zorgvuldig te zijn door lagen in en uit te schakelen van het multiplexcomposietbeeld in de inForm-software; het correct interpreteren van de kleuringspatronen van de enkele IHC-kleuring; en op zoek naar duidelijk verlies, winst of identieke signalen in het ene vlak dat overeenkomt met lokalisatie in een ander vlak.
Multispectrale kleuring vereist antilichamen in combinatie met specifieke fluoroforen om tegelijkertijd meerdere markers te detecteren. Deze fluorofoor-antilichaamparen volgen twee regels: i) fluoroforen die zijn toegewezen voor co-tot expressie gebrachte markers moeten spectraal uit elkaar liggen, en ii) meer overvloedige doelen moeten worden gecombineerd met fluoroforen met een lagere helderheid of omgekeerd. De volgorde van kleuring moet ook zo worden gerangschikt dat sequentiële antilichamen niet co-lokaliseren in dezelfde celcompartimenten in de gekleurde cellen. Daarom moeten, afgezien van de antilichaamconcentraties en incubatietijden, die kritieke factoren zijn in conventionele kleuringsmethoden, aanvullende parameters, zoals geschikte fluorofoor-antilichaamparen, TSA-fluorofoorconcentraties, de kleuringssequentie en de blootstelling van een specifiek antilichaam aan een of meer microgolfbehandelingen, worden overwogen voor succesvolle multiplexkleuring. Vanwege de hoge variabiliteit in onderzoeksmonsters kan een bepaald multiplexprotocol niet hetzelfde resultaat genereren in andere soorten onderzoeksmonsters.
Het hele opaal multiplex sequentiële kleuringsproces kan één tot enkele dagen duren, afhankelijk van het aantal markers dat betrokken is bij het paneel en de primaire incubatietijden van antilichamen. Standaard IF-methoden maken daarentegen meestal de visualisatie van 4-5 markers in een enkele kleuringsronde mogelijk. Opgemerkt moet worden dat de omstandigheden die zijn geoptimaliseerd met behulp van de conventionele IHC-methode verdere optimalisatie nodig hebben voordat wordt overgegaan tot multiplexkleuringsprocedures, die aanvullende, meerdere microgolfbehandelingen omvatten, en de toepassing van TSA-fluoroforen die uiteindelijk de kleuringsintensiteit van elk antilichaam zullen beïnvloeden. Momenteel kunnen beeldvormingsbenaderingen die multispectrale technologieën gebruiken, dure en toegewijde instrumentatie vereisen. Bovendien kan het alleen worden beperkt tot door afbeeldingen geselecteerde interessante gebieden. Daarom is dit mogelijk niet optimaal voor laboratoria met beperkte middelen en het scouten van weefsels met onzekere antigeendoelen.
Significantie ten opzichte van bestaande methoden
Een bijzondere kracht van deze huidige methode is het vermogen om de dichtheid van meerdere immuunceltypen in het endometrium tegelijkertijd te meten in tegenstelling tot conventionele IHC-methoden die slechts één tot twee celtypen in een enkele weefselsectie kunnen labelen. Flowcytometrie is een andere methode die de relatieve verhoudingen van verschillende immuunceltypen in het endometriummonster kan analyseren; het zou echter niet in staat zijn om ruimtelijke informatie te verstrekken tussen verschillende immuunceltypen en de specifieke verdeling binnen verschillende endometriumcompartimenten. Bovendien is weefseluitputting een ernstig probleem in de klinische praktijk, vooral tijdens klinische onderzoeken en bij het gebruik van biopsiemonsters. Deze twee conventionele methoden zouden een groot aantal monsters (secties of cellen) vereisen voor het optimaliseren van de procedure en voor het detecteren van meerdere immuunceltypen in het baarmoederslijmvlies van vrouwen met en zonder RM.
Zoals beschreven in dit protocol, is de Opal-workflow ontworpen voor de detectie van maximaal zeven markers in dezelfde weefselsectie met behulp van het Mantra Workstation. Bovendien is kruisreactiviteit van soorten tijdens antilichaamselectie geen beperking van deze technologie. Een voordeel van deze technologie is inderdaad dat het het gebruik van antilichamen in dezelfde soort mogelijk maakt voor het detecteren van maximaal zeven markers. Deze aanpak omvat detectie met fluorescerende TSA-reagentia gevolgd door microgolfbehandeling om niet-specifieke kleuringen te verwijderen. Na het strippen op basis van microgolven kan vervolgens nog een kleuringsronde worden uitgevoerd voor extra doeldetectie zonder het risico van antilichaamkruisreactiviteit. Bovendien kan deze TSA-detectiemethode in minimaal 3 dagen worden uitgevoerd om tot 7 fluorchromen te combineren en toch betrouwbare resultaten te produceren voor het detecteren van eiwitdoelen met een lage expressie. Een ander voordeel van multiplexkleuring ten opzichte van de traditionele IHC-studie is de verbeterde efficiëntie omdat de meting geautomatiseerd is, wat subjectieve vertekening kan elimineren. De gegenereerde kwantitatieve gegevens vertegenwoordigen de eindresultaten van de test.
Toekomstige toepassingen
Het toepassingsgebied van dit multiplexprotocol is immens. Belangrijk is dat dit het eerste artikel is dat de methode beschrijft voor de detectie van multiplexed immunofluorescentiemarkerexpressie met behulp van het Mantra Workstation en beeldanalyse met behulp van de InForm 2.2.1-software voor het leveren van nauwkeurige en reproduceerbare resultaten bij het onderscheiden van meerdere immuuncelpopulaties bij vrouwen met en zonder RM. Belangrijk is dat de lokalisatie van meerdere doelen in dezelfde weefselsectie uniek inzicht kan bieden in hun cellulaire interacties. Uiteindelijk zal dit leiden tot een beter begrip van de micro-omgeving van de immuuncel tijdens embryo-implantatie bij vrouwen met RM voor het vaststellen van een specifieke gerichte behandeling.
Bovendien hebben onze huidige methoden geholpen om aan te tonen dat verschillende immuuncellen en hun interacties belangrijk kunnen zijn voor de functie van het endometrium. Dit blijkt uit de significante veranderingen in de dichtheid van drie van de vier endometriumimmuunceltypen en een significante toename van de clustering tussen CD68+ en CD56+ cellen. Omgekeerd kunnen de abnormale interacties van deze immuunceltypen predisponerende factoren zijn voor RM. Belangrijk is dat, in tegenstelling tot de detectie van een enkel subtype van endometriumimmuuncellen, de toepassing van deze multiplex IHC-kleuring een diepgaand inzicht kan bieden in de immunologische regulatie van embryo-implantatie. Bovendien kan de kwantificering en het verdere begrip van ruimtelijke kenmerken in de immuunmicro-omgeving helpen licht te werpen op de biologie van deze ziekte in de context van immunotherapieën.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben om bekend te maken.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door het Hong Kong Obstetrical and Gynecological Trust Fund in 2018 en het Hong Kong Health and Medical Research Fund (06170186, 07180226).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amplification Diluent | Perkin Elmer | FP1498 | Fluorophore diluent buffer |
| Antibody diluent | Perkin Elmer | ARD1001EA | Diluting the antibody |
| CD3 | Spring Bioscience | M3072 | Primary antibody |
| CD20 | Biocare Medical | CM004B | Primary antibody |
| CD56 | Leica | NCL-CD56-504 | Primary antibody |
| CD68 | Spring Bioscience | M5510 | Primary antibody |
| Citrate Buffer Solution, pH 6.0 (10x) | Abcam | AB64214 | Antigen retrieval solution |
| EMSURE Xylene (isomeric mixture) | Merck | 108297 | Dewaxing |
| Ethanol absolute | Merck | 107017 | Ethyl alcohol for rehydration |
| HistoCore BIOCUT Manual Rotary Leica Microtome | Leica | RM2125RTS | Sectioning of paraffin-embedded tissue |
| inForm Advanced Image Analysis Software | Perkin Elmer | inForm® Tissue Finder Software 2.2.1 (version 14.0) | Data Analysis software |
| Mantra® Workstation | Akoya Biosciences | CLS140089 | Spectral imaging |
| Microwave | Panasonic | Inverter | Microwave stripping |
| Opal 520 | Perkin Elmer | FP1487A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 620 | Perkin Elmer | FP1495A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 650 | Perkin Elmer | FP1496A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 690 | Perkin Elmer | FP1497A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Oven | Memmert | U10 | Dewaxing |
| Peroxidase Blocking Solution | DAKO | S2023 | Removal of tissue peroxidase activities |
| Poly-L-lysine coated slide | FISHER SCIENTIFIC | 120-550-15 | Slide for routine histological use |
| PolyHRP Broad Spectrum | Perkin Elmer | ARH1001EA | Secondary antibody |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant | ThemoFisher Scientific | P36930 | Mounting |
| Spatstat | / | Version 2.1-0 | Spatial point pattern analysis |
| Spectral DAPI | Perkin Elmer | FP1490A | Nucleic acid staining |
| Tissue Processor | Thermo Fischer | Excelsior ES | Tissue processing for dehydration and paraffination |
| Tris Buffer Saline (TBS), 10x | Cell Signaling Technology | 12498S | Washing solution |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1370-1L | Nonionic detergent |
References
- ESHRE Guideline Group on RPL et al. ESHRE guideline: recurrent pregnancy loss. Human Reproduction Open. 2018 (2), 004 (2018).
- Stirrat, G. M.
- Rai, R., Regan, L.
- Royal College of Obstetricians & Gynaecologists. The investigation and treatment of couples with recurrent first-trimester and second-trimester miscarriage. Green-top Guideline No. 17. Royal College of Obstetricians & Gynaecologists. , (2011).
- King, A.
- Le Bouteiller, P., Piccinni, M. P. Human NK cells in pregnant uterus: why there. American Journal of Reproductive Immunology. 59 (5), 401-406 (2008).
- Lash, G. E., et al. Standardisation of uterine natural killer (uNK) cell measurements in the endometrium of women with recurrent reproductive failure. Journal of Reproductive Immunology. 116, 50-59 (2016).
- Yang, Y., et al. HOXA-10 and E-cadherin expression in the endometrium of women with recurrent implantation failure and recurrent miscarriage. Fertility and Sterility. 107 (1), 136-143 (2017).
- Tuckerman, E., Laird, S. M., Prakash, A., Li, T. C. Prognostic value of the measurement of uterine natural killer cells in the endometrium of women with recurrent miscarriage. Human Reproduction. 22 (8), 2208-2213 (2007).
- Jasper, M. J., et al. Macrophage-derived LIF and IL1B regulate alpha(1,2)fucosyltransferase 2 (Fut2) expression in mouse uterine epithelial cells during early pregnancy. Biology of Reproduction. 84 (1), 179-188 (2011).
- Kopcow, H. D., et al. T cell apoptosis at the maternal-fetal interface in early human pregnancy, involvement of galectin-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (47), 18472-18477 (2008).
- Johnson, P. M., Christmas, S. E., Vince, G. S. Immunological aspects of implantation and implantation failure. Human Reproduction. 14, Suppl 2 26-36 (1999).
- Hong, G., et al. Multiplexed fluorescent immunohistochemical staining, imaging, and analysis in histological samples of lymphoma. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58711 (2019).
- Carstens, J. L., et al. Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer. Nature Communications. 8, 15095 (2017).
- Zhao, Y., et al. The use of multiplex staining to measure the density and clustering of four endometrial immune cells around the implantation period in women with recurrent miscarriage: comparison with fertile controls. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 593-603 (2020).
