Summary
Denne artikel rapporterer en in vivo hæmning af CENP-E gennem abdominal kirurgi og testikel injektion af GSK923295, en værdifuld model for mandlig meiotisk deling. Ved hjælp af immunofluorescens-, flowcytometri- og transmissionselektronmikroskopi-assays viser vi, at CENP-E-hæmning resulterer i kromosomforskydning og genomustabilitet i musespermatocytter.
Abstract
I eukaryoter er meiose afgørende for genomstabilitet og genetisk mangfoldighed i seksuel reproduktion. Eksperimentelle analyser af spermatocytter i testikler er afgørende for undersøgelserne af spindelsamling og kromosomadskillelse i mandlig meiotisk division. Musens spermatocyt er en ideel model for mekanistiske undersøgelser af meiose, men de effektive metoder til analyse af spermatocytter mangler. I denne artikel rapporteres en praktisk og effektiv metode til in vivo-hæmning af kinesin-7 CENP-E i musespermatocytter. En detaljeret procedure for testikelinjektion af en specifik hæmmer GSK923295 gennem abdominal kirurgi hos 3 uger gamle mus præsenteres. Desuden er beskrevet her en række protokoller til vævsindsamling og fiksering, hæmatoxylin-eosinfarvning, immunofluorescens, flowcytometri og transmissionselektronmikroskopi. Her præsenterer vi en in vivo hæmningsmodel via abdominal kirurgi og testikelinjektion, der kunne være en kraftfuld teknik til at studere mandlig meiose. Vi demonstrerer også, at CENP-E-hæmning resulterer i kromosomforskydning og metafasestop i primære spermatocytter under meiose I. Vores in vivo-hæmningsmetode vil lette mekanistiske undersøgelser af meiose, tjene som en nyttig metode til genetiske modifikationer af mandlige kønsceller og kaste lys over fremtidige kliniske anvendelser.
Introduction
Meiose er en af de vigtigste, meget stive, evolutionære bevarede begivenheder i eukaryote organismer og er afgørende for gametogenese, seksuel reproduktion, genomintegritet og genetisk mangfoldighed 1,2,3. Hos pattedyr gennemgår kimcellerne to på hinanden følgende celledelinger, meiose I og II, efter en enkelt runde DNA-replikation. I modsætning til søsterkromatider i mitose parres duplikerede homologe kromosomer og adskilles i to datterceller under meiose I 4,5. I meiose II trækker søsterkromatider sig fra hinanden og adskilles for at danne haploide gameter uden DNA-replikation6. Fejl i en af de to meiotiske divisioner, herunder spindelsamlingsfejl og kromosomfejlegregering, kan resultere i tab af kønsceller, sterilitet eller aneuploidisyndromer 7,8,9.
Akkumulerende undersøgelser har vist, at kinesinfamiliemotorer spiller en afgørende rolle i reguleringen af kromosomjustering og adskillelse, spindelsamling, cytokinese og cellecyklusprogression i både mitotiske og meiotiske celler10,11,12. Kinesin-7 CENP-E (Centromere protein E) er en plus-end-rettet kinetochore motor, der kræves til kromosomkongres, kromosomtransport og justering og regulering af spindelsamlingskontrolpunkt i mitose 13,14,15,16,17,18. Under meiose fører CENP-E-hæmning af den specifikke hæmmer GSK923295 til cellecyklusstop, kromosomforskydning, spindeldisorganisering og genomstabilitet i spermatogene celler19. Lokaliseringsmønstrene og dynamikken i CENP-E ved centromererne af delende spermatocytter indikerer, at CENP-E interagerer med kinetochore-proteiner til sekventiel samling af centromerer under meiose I20,21. I oocytter kræves CENP-E til kromosomjustering og afslutning af meiose I13,22,23. Antistoffer eller morpholino injektion af CENP-E resulterer i forkert justerede kromosomer, unormal kinetochore orientering, og meiose jeg arresterer i både mus og Drosophila oocytter23. Sammenlignet med CENP-E's væsentlige roller i mitose forbliver CENP-E's funktioner og mekanismer i meiose stort set ukendte. Detaljerede mekanismer for CENP-E i kromosomkongresion og genomstabilitet i mandlige meiotiske celler mangler stadig at blive afklaret.
Spermatogenese er en kompleks og langvarig fysiologiproces, der involverer sekventiel spermatogonia-proliferation, meiose og spermiogenese. Derfor er hele processen ekstraordinært vanskelig at reproducere in vitro hos pattedyr og andre arter24,25. Det er umuligt at inducere spermatocytter differentiering efter pachytenstadiet in vitro. Undersøgelser af mandlige meiotiske divisioner har generelt været begrænset til eksperimentelle analyser af tidlig meiotisk profase25,26. På trods af mange teknologiske bestræbelser, herunder kortvarig kultur af spermatocytter27,28 og organkulturmetoder25, er der få effektive metoder til at studere mandlig meiotisk opdeling. Desuden resulterer genetisk sletning af essentielle gener normalt i udviklingsstop og embryonal dødelighed. F.eks. undlader museembryoner, der mangler CENP-E, at implantere og kan ikke udvikle sig efter implantation29, hvilket er en hindring i mekanistiske undersøgelser af CENP-E ved meiose. Samlet set kan etablering af et praktisk og gennemførligt system til undersøgelse af mandlig meiotisk opdeling i høj grad fremme forskningsområdet meiose.
Den lille cellegennemtrængelige hæmmer er et kraftfuldt værktøj til at studere kinesinmotorer i celledeling og udviklingsprocesser. Den allosteriske inhibitor, GSK923295, binder specifikt til CENP-E-motordomænet, blokerer frigivelsen af ADP (adenosindiphosphat) og stabiliserer endelig interaktionerne mellem CENP-E og mikrotubuli30. I denne undersøgelse præsenteres en in vivo hæmningsmusemodel gennem abdominal kirurgi og testikelinjektion af GSK923295. CENP-E-hæmning resulterer i kromosomforskydning i metafase I af primære spermatocytter. Desuden fører CENP-E-hæmning til meiotisk anholdelse af spermatocytter og forstyrrelse af spermatogenese. En række protokoller er beskrevet til analyse af spermatocytter og kan anvendes til at observere meiotiske spindelmikrotubuli, homologe kromosomer og subcellulære organeller i spermatocytter. Vores in vivo hæmningsmetode er en effektiv metode til studier af meiotisk deling og spermatogenese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev gennemgået og godkendt af Animal Care and Use Committee ved Fujian Medical University (protokolnummer SYXK 2016-0007). Alle museforsøg blev udført i overensstemmelse med de relevante retningslinjer for pleje og brug af forsøgsdyr fra National Institutes of Health (NIH-publikationer nummer 8023, revideret 1978).
1. Konstruktion af GSK923295-medierede CENP-E hæmningsmusemodeller
- De kirurgiske instrumenter steriliseres ved 121 °C i 30 min. Bestråle det kirurgiske ultrarene arbejdsbord med ultraviolet-C (UVC) i 2 timer. Væg de 3 uger gamle ICR (Institute of Cancer Research) mus, der blev brugt til eksperimenterne, og beregn de nødvendige doser bedøvelse.
- Bedøv mus ved at administrere en kombination af ketamin (100 mg / kg) og xylazin (10 mg / kg) via intraperitoneal injektion. Kontroller dybden af musenes anæstesi gennem en kombination af musehornhinderefleks, nociceptiv refleks, åndedræt samt muskeltonus. Bekræft, at musene er dybt bedøvede.
BEMÆRK: Placer dyret på en varmepude for at yde termisk støtte under operationen. - Bind muselemmerne og fastgør dem på voksbakken. Placer en dråbe dyrlægesalve på musens øjne for at forhindre tørhed under anæstesi. Barber musens abdominale hår fra underlivet til pungen ved hjælp af en eksperimentel dyrebarbermaskine. Fastgør det kirurgiske område med en steril drapering.
- Desinficer den ventrale mave med en Betadine-skrubbe efterfulgt af 75% ethanol tre gange. Åbn bukhulen ved hjælp af en steril skalpel og lav en <5 mm åbning.
- Klem huden med sterile kirurgiske klemmer og træk den epididymale fedtpude med sterile dissekerende tang for at lokalisere testiklerne ved hjælp af en steril pincet. Fastgør testiklerne med sterile tang under et stereoskop, og injicer langsomt 10 μL GSK923295 i seminiferøse tubuli i en slutkoncentration på 10 μM ved hjælp af 10 μL rheodyne30. Til konstruktion af kontrolgruppen injiceres 10 μL 1% DMSO (dimethylsulfoxid)/PBS (fosfatbufret saltvand) opløsning.
BEMÆRK: Opbevar den GSK923295 opløsning i en koncentration på 10 mM ved -80 °C. 0,1 μL 10 mM GSK923295 opløses i 100 μL PBS-opløsning for at fremstille 10 μM GSK923295 opløsning. - Skub forsigtigt testiklerne tilbage i bukhulen med sterile kirurgiske tang. Sutur peritoneum og hud separat med to til fire sting ved hjælp af suturlinjen med en diameter på 0,1 mm.
- Mærk et 3 x 3 mm sted på ryggen af dyret med en permanent markør efter abdominal operation, sæt musen tilbage til fodringsburet og sørg for et rent og patogenfrit miljø med tilstrækkelig mad og vand.
- Hold miljøet i steril tilstand gennem den filtrerede luft, den steriliserede mad og vand. Pas på dyret, indtil det har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystliggende. Ved postoperativ analgesi skal du administrere en dosis buprenorphin (0,1 mg/kg) subkutant hver 12. time i 3 dage. Sørg for, at musen ikke returneres til andre dyrs selskab, før den er helt genoprettet.
BEMÆRK: Musene får postoperativ pleje og giver såret lokalbedøvelse korrekt ved hjælp af 0,5% lidokain for at reducere postoperativ smerte, når det er nødvendigt.
2. Hematoxylin-eosin (HE) farvning og histopatologi
- Fire dage efter abdominal kirurgi aflives musene med CO 2 med en strømningshastighed på 2 l / min i et CO2 -kammer. Bekræft døden ved cervikal dislokation som en bekræftende metode til eutanasi. Brug kirurgisk saks til at åbne pungen og fjerne testiklerne med tang. Saml musetestikler 4 dage efter GSK923295 injektion og fastgør dem i 30 ml 10% formaldehydopløsning ved stuetemperatur i 12 timer.
- Til gradientdehydrering inkuberes prøven sekventielt i 40 ml 70% ethanol i 1 time, i 40 ml 85% ethanol i 1 time, i 40 ml 95% ethanol i 1 time og i 40 ml 100% ethanol i 1 time.
- Prøven inkuberes i 40 ml xylen i 40 minutter og derefter i 40 ml paraffin i 1 time ved 65 °C. Placer vævene i bunden af indlejringsboksen. Tilsæt den smeltede paraffin i indlejringsboksen. Vævene afkøles til fuldstændig størkning ved 4 °C i 6 timer.
- Fastgør prøverne på holderen af ultramikrotomet, hold vinklen mellem prøverne og knivoverfladen ved 5-10 °, og juster skivetykkelsen til 5 μm. De 5 μm tykke sektioner tilberedes ved hjælp af et ultramikrotom, fordeles i vandbad ved 40 °C, og sektionerne tørres i en tørretumbler i 12 timer ved 37 °C.
- Inkuber objektglassene i 200 ml xylen i 40 min, i 200 ml 100% ethanol i 6 min, i 200 ml 95% ethanol i 2 min, i 200 ml 90% ethanol i 2 min, i 200 ml 80% ethanol i 2 minutter og i 200 ml 70% ethanol i 2 min, henholdsvis.
- Skyl diasene i destilleret vand i 5 minutter og pletter dem med Mayers hæmatopylinopløsning i 6 minutter ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Mayers hæmatoxylinopløsning: 0,011 mol / L hæmatoxylin, 6,7% vandfri ethanol, 0,646 mol / L aluminiumkaliumsulfat og 0,003 mol / L natriumiodat. - Skyl rutsjebanerne i rindende vand i 5 min og inkuber med destilleret vand i 2 min.
- Inkuber diasene i 1% ethanolhydrochlorid i 3 s, og skyl dem derefter i rindende vand i 2 min.
- Plet prøven med 1% eosin i 15 s, og inkuber dem derefter med 95% ethanol i 5 s, med 100% ethanol i 2 minutter og i xylen i 40 minutter.
- Forsegl objektglassene med 15 μL neutral gummi og 24 x 50 mm dæksel.
3. Immunofluorescens og konfokal mikroskopi
- De 5 μm tykke paraffinsektioner af musetestikler samles for immunfluorescens. Inkuber objektglassene i xylen i 40 min, i 100% ethanol i 6 min, i 95% ethanol i 2 min, i 90% ethanol i 2 min, i 80% ethanol i 2 min og i 70% ethanol i 2 min. Skyl rutsjeglassene i destilleret vand i 5 min, og skyl glassene med 0,01 M PBS i 5 min.
- Anbring objektglassene i antigenudtagningsopløsningen (0,01 M citratbuffer) og kog under højt tryk ved hjælp af en trykkoger i 4 minutter til antigenudtagning. Afkøl diasene naturligt til stuetemperatur. Skyl med destilleret vand i 5 min to gange og med PBS i 5 min.
BEMÆRK: 0,01 M citratbuffer (pH 6,0): 2,1 mmol / L citronsyre, 11,6 mmol / L trinatriumcitratdihydrat. - Permeabilisere celler ved at inkubere diasene i 500 μL 0,25% TritonX-100/PBS i 10 min. Skyl objektglassene med PBS i 5 min tre gange.
- Til antigenblokering inkuberes prøverne med 300 μL 3% bovint serumalbumin (BSA)/PBST (0,1% Tween-20 i PBS) i 1 time. Prøverne inkuberes med de primære antistoffer i 3 % BSA/PBST i 16 timer ved 4 °C. Sæt diasene i en befugtet kasse for at forhindre, at vævene tørrer ud. Opvarm gliderne naturligt til stuetemperatur i 30 min.
- Kassér det primære antistof, og skyl derefter objektglassene i PBST i 5 minutter tre gange. Fortynd sekundære antistoffer i 3% BSA/PBST. Prøverne inkuberes med sekundære antistoffer i 1-2 timer ved 37 °C. Skyl prøverne i PBST i 5 min fem gange.
- Plet kernerne med 50 μL 4', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) i 5 minutter ved stuetemperatur. Monter dækselen med anti-falme-monteringsmediet, og forsegl dæksedlen med neglelak.
- Observer og registrer fluorescerende signaler i diasene ved hjælp af et fluorescerende mikroskop udstyret med et NA 40x / 0.75-mål.
4. Flow cytometri
- Saml musetestikler i 6 cm petriskåle og skær testiklerne i 1 mm3 stykker ved hjælp af kirurgisk saks.
- Fordøjes testiklerne med 1 ml 1% kollagenase i 1,5 ml centrifugerør i 10 minutter ved 37 °C, og centrifuger derefter prøverne ved 1.000 x g i 5 minutter for at udfælde spermatogene celler.
- Supernatanten kasseres, og derefter tilsættes 1 ml 0,25 % trypsin-EDTA-opløsning (ethylendiamintetraeddikesyre) i 20 minutter ved 37 °C, hvorefter prøverne centrifugeres ved 1 000 x g i 5 minutter.
- Supernatanten kasseres, og de udfældede celler inkuberes derefter med 1 ml 70 % kold ethanol i mere end 8 timer ved 4 °C.
- Centrifuger prøverne ved 1.000 x g i 5 minutter, og opsaml derefter cellesedimenter. Plet de spermatogene celler med 500 μL propidiumiodid (PI) farvningsopløsning (50 μg / ml PI, 100 μg / ml RNase A og 0,2% Triton X-100 i PBS) ved 37 ° C i 30 minutter.
BEMÆRK: Ryst forsigtigt centrifugeslangen hvert 5. minut for at undgå cellesammenlægninger. - Filtrer prøverne ved hjælp af en 300 mesh skærm for at slippe af med celleaffald; Cellerne samles i et flowrør og opbevares ved 4 °C.
- Detekter fluorescenssignaler og lysspredning ved excitationsbølgelængden på 488 nm ved hjælp af et flowcytometer. Analyser DNA-indholdet og lysspredningen ved hjælp af Modfit MFLT32-softwaren.
5. Transmissionselektronmikroskopi
- Skær testiklerne i 1 mm 3 stykker ved hjælp af den skarpe skalpel, og inkuber hurtigt prøverne med3 % glutaraldehyd-1,5% paraformaldehydopløsning i 0,1 M PBS (pH 7,2) i 4 timer ved 4 °C for at undgå ændringer i ultrastrukturen. Skyl prøverne med 0,1 M PBS i 5 min tre gange.
BEMÆRK: Skalpellen og saksen skal være skarpe, og prøv at undgå kunstig klemning og træk. Behandlingen af prøver skal udføres i fikseringsvæsken. - Prøverne fastgøres i 1% osmsyre-1,5% kaliumferrocyanidopløsning ved 4 °C i 1,5 timer. Tør vandet med filterpapir og skyl prøverne med 0,1 M PBS i 5 min tre gange.
- Prøverne dehydreres i 40 ml 50% ethanol i 10 minutter ved 4 °C. Prøverne inkuberes i 40 ml 70 % ethanolmættet uranacetatfarvestof ved 4 °C i 12 timer, i 40 ml 90 % ethanol i 10 minutter ved 4 °C, i 40 ml 90 % ethanolacetone i 10 minutter ved stuetemperatur og i 40 ml vandfri acetone i 10 minutter tre gange ved stuetemperatur.
- Inkuber prøverne i vandfri acetone-epoxyharpiks 618 indlejringsmidler (v / v = 1: 1) blanding i 1,5 timer, og indlejr derefter prøverne i epoxyharpiks 618 indlejringsmidler ved 35 ° C i 3 timer.
- Til harpikspolymerisation inkuberes prøverne i epoxyharpiks 618-indlejringsmidler ved 35 °C i 12 timer, ved 45 °C i 12 timer og derefter ved 60 °C i 24 timer.
- Installer prøverne og glaskniven, og juster derefter afstanden mellem prøverne og kniven. Forbered de 90 nm tykke ultratynde sektioner ved hjælp af et ultratyndt mikrotom. Skær prøverne i skiver med konstant hastighed, og placer derefter diasene på et nikkelnet. Læg diasene i en petriskål ved stuetemperatur.
- Plet objektglassene med 2% uranylacetat i 10 min, og pletter derefter prøverne med 2% blycitrat i 10 min. Skyl diasene med destilleret vand. Tør diasene i 24 timer ved stuetemperatur.
- Overhold diasene og optag elektronbilleder ved 70-100 kV ved hjælp af et transmissionselektronmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har med succes konstrueret en in vivo CENP-E hæmningsmodel af musetestikler gennem abdominal kirurgi og testikelinjektion afGSK923295 19. De vigtigste tekniske trin i denne metode blev vist i figur 1. Efter testikelinjektion af GSK923295 i 4 dage blev testiklerne høstet til yderligere analyser. I kontrolgruppen var den spermatogene bølge i de seminiferøse tubuli regelmæssig og organiseret (figur 2A). I GSK923295-gruppen blev den spermatogene bølge imidlertid ændret i de seminiferøse tubuli, og metafasearresterede primære spermatocytter blev signifikant øget efter CENP-E-hæmning (figur 2B-D). Det er vigtigt, at flere homologe kromosomer ikke blev justeret ved ækvatorialpladen efter CENP-E-hæmning (figur 2B-D). Desuden førte CENP-E-hæmning også til stigningen i metafase I-spermatocytter i seminiferøse tubuli (figur 2E, F, G). Samlet set resulterer CENP-E-hæmning i kromosomforskydning i primære spermatocytter under meiose I, hvilket tyder på, at CENP-E er ansvarlig for kromosomkongresion og justering af spermatocytter i meiose.
For yderligere at validere disse resultater udførte vi immunofluorescensassays for at detektere spermatogene celler i seminiferøse tubuli. Vi fandt, at den regelmæssige spermatogene bølge vist i kontrolgruppen tydeligvis blev ændret og blev uregelmæssig i GSK923295-gruppen (figur 3). Den meiotiske spindel af delende spermatocytter blev mærket med anti-α-tubulin-antistof, og det tværgående filament af synaptonemale komplekser i spermatocytterne blev mærket med anti-synaptonemal komplekst protein 3 (SYCP3) antistof (figur 3A). De SYCP3-positive celler pr. seminiferøs tubuli faldt efter CENP-E-hæmning (figur 3B). I mellemtiden blev SYCP3-prikkerne pr. metafasecelle ikke forstyrret efter CENP-E-hæmning (figur 3C). Derudover blev SYCP3-strækningerne pr. celle heller ikke påvirket i de GSK92395 grupper (figur 3D). Påfaldende fandt vi, at afstandene af spindelpoler i metafase I-spermatocytter blev øget efter CENP-E-hæmning (figur 3E, F). Disse immunofluorescerende resultater tyder på, at CENP-E er nødvendig for kromosomforskydning og spermatogeneseprocesserne og er uundværlig for vedligeholdelsen af bipolær spindel og organiseringen af den meiotiske spindel.
For at undersøge cellepopulationer i musetestikler fordøjede vi testiklerne og udførte PI-farvning og flowcytometriassays (figur 4). De vigtige tekniske procedurer blev vist i figur 4A-C. De spermatogene celler består af flere cellepopulationer, herunder spermatogonia, primære spermatocytter, sekundære spermatocytter, spermatider og spermatozoer. DNA-indholdet af disse spermatogene celler blev vist i figur 4A. Vi viste, at CENP-E-hæmning resulterede i faldet i haploide celler fra 42,95 ± 1,09% i kontrolgruppen til 38,26 ± 1,86% i GSK923295 gruppen (figur 4B-D). Forholdet mellem de diploide celler og aneuploidicellerne blev ikke signifikant påvirket efter CENP-E-hæmning (figur 4E,F). Desuden øges forholdet mellem de tetraploide celler fra 17,76 ± 1,52% i kontrolgruppen til 28,88 ± 2,05% i GSK923295-gruppen (figur 4G). Samlet set finder vi, at cellepopulationerne af de spermatogene celler ændres lidt efter CENP-E-hæmning. CENP-E-hæmning resulterer i faldet i de haploide celler og stigningen i tetraploide celler, hvilket indikerer, at CENP-E-hæmning er forbundet med metafasearrest i de delende spermatocytter.
Desuden observerede vi den submikroskopiske struktur af de spermatogene celler ved hjælp af transmissionselektronmikroskopi (figur 5). Kromatinorganisationen, endoplasmatisk retikulum og mitokondrier af spermatocytter blev vist i figur 5. Vi fandt, at organiseringen af spermatogene celler blev lidt forstyrret i GSK923295-gruppen (figur 5).
Figur 1: Etablering af en in vivo hæmningsmodel af musetestikler gennem abdominal kirurgi og testikeladministration. (A) Alle kirurgiske instrumenter, der anvendes i abdominal kirurgi. 1) dissekere saks, 2) nålepincet, 3) lige pincet, 4) pincett, 5) reodyn, 6) 1 ml sprøjte, 7) skalpel med nr. 3 håndtag og nr. 11 blad, 8) stylolit, 9) runde syningnåle, 1/2 0,6 x 14 mm, 1/2 0,7 x 17 mm, 10) ethanolvatpinde. (B) Efter anæstesi blev musene anbragt i liggende stilling på en voksbakke, underlivet blev forberedt og desinficeret med 75% ethanol. (C) Der blev lavet en åbning på <5 mm midt i underlivet. (D) Den epididymale fedtpude blev trukket med steril dissekerende tang for at lokalisere testiklerne. Testiklerne blev injiceret med 10 μL GSK923295 under anvendelse af en 10 μL reodyn. (E) Bughinden og huden blev samtidig sutureret med to sting. (F) Såret blev desinficeret med 75% ethanol. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: CENP-E-hæmning resulterede i anholdelse af meiose I og kromosomforskydning i musespermatocytter . (A) HE-farvning af spermatogene celler i kontrolgruppen. Pilene angiver spermatocytterne. B) HE-farvning af spermatogene celler i den GSK923295 gruppe. Testiklerne blev injiceret med GSK923295 i 4 dage ved en slutkoncentration på 10 μM. Pilene indikerer kromosomforskydning i spermatocytterne. For alle billeder, skalabjælke, 10 μm. (C) Forholdet mellem metafasespermatocytter i seminiferøse tubuli. kontrol, 13,43 ± 1,68%; GSK923295 ± 42,29 3,94%. N = 1308 celler blev analyseret. Gruppe = 4. Elevens t-test. Fejlbjælker, betyder ± SEM. * **, P < 0,001 . (D) Forholdet mellem seminiferøse tubuli og delende spermatocytter. kontrol, 5,38 ± 2,64%; GSK923295, 33,96 ± 3,87%. N = 151 seminiferøse tubuli blev analyseret. Gruppe = 4. E) Immunofluorescensbilleder af histon H3 (phospho Ser 10) og TUBA4A i kontrol- og GSK923295 grupperne. TUBA4A, rød; Histon H3 (phospho Ser 10), grøn; DAPI, blå. Vægtstang, 10 μm. Der zoomes ind på den forstørrede boks. F) Kvantificering af antallet af metafaseceller i seminiferøse tubuli. kontrol, 11,45 ± 1,55; GSK923295, 18,91 ± 2,36. N = 11. (G,H) Line-scan analyser af fluorescerende intensiteter af histon H3 og TUBA4A i metafase I spermatocytter i kontrolgruppen (G) og GSK923295 gruppen (H). TUBA4A, rød; Histon H3 (phospho Ser 10), grøn; DAPI, blå. X-aksen angiver den relative afstand. Y-aksen angiver fluorescerende intensiteter. Elevens t-test. Fejlbjælker, gennemsnit ± SEM. *, P < 0,05 ; ** *, P < 0,001 . Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: CENP-E-hæmning ved GSK923295 førte til desorganisering af seminiferøse tubuli og forstyrrelse af spermatogenese . A) Repræsentative immunfluorescensbilleder af SYCP3 og TUBA4A i kontrol- og GSK923295 grupperne. SYCP3, rød; TUBA4A, grøn; DAPI, blå. Skalabjælke, 10 μm. (B) SYCP3-positive celler pr. seminiferøs tubuli i kontrol- og GSK923295-grupperne. kontrol, 56,00 ± 5,43%; GSK923295, 39,00 ± 1,73%. N = 10. C) Kvantificeringerne af SYCP3-punkter pr. metafasecelle. kontrol, 10.00 ± 1.02; GSK923295, 9, 71 ± 0, 86, N = 7. (D) Kvantificeringerne af SYCP3-strækninger pr. celle i kontrol- og GSK923295-grupperne. kontrol, 8,63 ± 0,22; GSK923295, 8,21 ± 0,21. N = 19. E) Analyser af spindelpolernes afstand i metafase I-spermatocytterne. Kontrol, 8,20 ± 0,28 μm; GSK923295, 9,30 ± 0,29 μm. N = 30. F) Immunofluorescensbilleder af seminiferøse tubuli i kontrolgrupperne og GSK923295 grupperne. Pilene angiver spermatocytterne. DAPI, grøn; β-tubulin, grøn. De forstørrede billeder af den stiplede boks blev vist i zoom. For alle billeder, skalalinje, 10 μm. Elevens t-test. Fejlbjælker, gennemsnit ± SEM. ns, P > 0,05 ; * *, P < 0,01 . Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Flowcytometrianalyse af spermatogene celler i musetestikler . (A) Skematiske illustrationer af de vigtigste trin i cellecyklusanalyse af musespermatogene celler. De diploide spermatocytter gennemgår meiose I og II for at danne de haploide spermatider. C-værdien angiver DNA-indholdet. N-værdien (ploidi) angiver antallet af sæt kromosomer. (B,C) Flowcytometrianalyse af spermatogene celler i kontrolgruppen (B) og den GSK923295 gruppe (C). Til in vivo CENP-E-hæmning blev GSK923295 injiceret i 3 uger gamle ICR-musetestikler hos hankøn i en slutkoncentration på 10 μM i 4 dage. Til cellecyklusanalyse blev n = 3.000 celler målt og analyseret. P4, de haploide celler (1C). P5, de diploide celler (2C). P6, de tetraploide celler (4C). D) Forholdet mellem haploide celler i kontrol- og GSK923295 grupperne. kontrol, 42,95 ± 1,09%; GSK923295 ± 38,26 1,86%. N = 8. E) Forholdet mellem de diploide celler i kontrolgrupperne og GSK923295 grupperne. kontrol, 20,10 ± 0,91%; GSK923295 ± 17,95 0,81%. N = 8. (F) Forholdet mellem de aneuploide celler (2C ~ 4C) i kontrol- og GSK923295 grupperne. kontrol, 3,41 ± 0,23%; GSK923295, 3,39 ± 0,25%. N = 8. G) Forholdet mellem tetraploide celler i kontrolgrupperne og GSK923295 grupperne. kontrol, 17,76 ± 1,52%; GSK923295, 28,88 ± 2,05%. N = 8. For alle grafer, elevens ikke test. Fejlbjælker, gennemsnit ± SEM. ns, P > 0,05; *, P < 0,05; , P < 0,001. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Elektronmikroskopi analyse af spermatogene celler i kontrol- og GSK923295 gruppe . (A) Repræsentative billeder af seminiferøse tubuli i kontrolgruppen. Skalabjælke, 5 μm. (B) Det forstørrede billede af spermatocytens kerne. Pilene angiver homologt kromatin af spermatocytterne. Skalabjælke, 1 μm. (C) Det forstørrede billede af spermatocytternes cytoplasma. Skalabjælke, 1 μm. (D) Repræsentative billeder af seminiferøse tubuli i GSK923295-gruppen. Testiklerne blev behandlet med 10 μM GSK923295 i 4 dage. Skalabjælke, 5 μm. (E) Det forstørrede billede af kernen i spermatocytten i GSK923295-gruppen. Skalastang, 1 μm. (F) Det forstørrede billede af cytoplasmaet af spermatocytterne i GSK923295-gruppen. Vægtstang, 1 μm. For alle grafer, sc, spermatocyt; SD, spermatid. ER, endoplasmatisk retikulum; MT, mitokondrier. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dette studie har vi etableret en in vivo CENP-E hæmningsmodel af musetestikler ved hjælp af abdominal kirurgi og mikroinjektion af GSK923295. Den abdominale kirurgi og testikelinjektionsmetode, der anvendes i denne undersøgelse, har følgende fordele. For det første er det ikke begrænset til musens alder. Eksperimenter kan udføre testikelinjektion på et tidligt stadium, for eksempel hos 3 uger gamle eller yngre mus. For det andet har GSK923295 en specifik og fremragende hæmmende virkning på CENP-E. For det tredje er denne metode enkel at betjene og meget reproducerbar. Derudover opretholdes testiklernes integritet, hvilket er egnet til undersøgelser af intakte væv i forbindelse med organerne.
Der er flere kritiske trin i denne protokol. For eksempel er det vigtigt at opretholde et sterilt miljø under abdominal kirurgi til forebyggelse af postoperative infektioner31. For mus i forskellige aldre eller forskellige forsøgsdyr bør injektionsmængderne justeres passende i henhold til testiklernes størrelse og lægemidlets effektivitet19,32. Derudover kræves den korrekte fordøjelsestid og mikroskopisk observation til bestemmelse af enkeltceller og efterfølgende cellepopulationstest under flowcytometri. Der er dog flere begrænsninger i disse protokoller. Det er svært at bruge abdominal kirurgi til at konstruere en musemodel, når musens alder er mindre end 2 uger gammel. Hovedårsagerne er, at musene er for unge, den postoperative diæt er vanskelig, og overlevelsesraten er lav. De lægemidler, der anvendes i dyremodeller, er flydende og har egenskaberne ved let penetrerende cellemembraner 19,32,33, som er egnede til anvendelser af denne administrationsmetode.
Forståelse af meiose stimuleres af in vitro-cellekultur og gen-knockout-undersøgelser, men det er ikke let anvendeligt i pattedyrspermatocytter28. Hindringen for de mekanistiske undersøgelser af mandlig meiose har været manglen på et passende system til manipulation og observation af deling af spermatocytter i meiose27. Musen er en fremragende modelorganisme i forskningen af cellulære og molekylære mekanismer for meiose under spermatogenese. Den første bølge af musespermatocytter starter meiose på dag 10 postpartum (dpp) og udvikler sig til modne sædceller ved 35 dpp, hvilket giver et udviklingstidsvindue for undersøgelserne af meiotisk deling og spermatogenese34.
Testisinjektion, herunder direkte injektion gennem pungen og mikroinjektion via abdominal kirurgi, er en nyttig teknik til undersøgelser af spermatogenese35,36. Direkte injektion gennem pungen er hurtig og enkel og forårsager kun et mindre kirurgisk traume, som er velegnet til mus på 4 uger eller ældre med testiklerne ned til pungen. Det er imidlertid umuligt at injicere de nedsunkne testikler hos de 3 uger gamle eller yngre mus. Mikroinjektion gennem intraperitoneal kirurgi eller pungkirurgi er egnet til injektion af nedsunkne testikler, hvilket kræver dygtige kirurgiske færdigheder hos eksperimentelle operatører, et stereomikroskop og kirurgisk udstyr og laboratorieudstyr. Ifølge injektionsstederne kan mikroinjektion klassificeres i seminiferøs tubulusinjektion, testikulær nettoinjektion og testikulær interstitiel injektion. Sammenlignet med andre injektionsbaserede testismodeller kan injektion af inhibitorer gennem abdominal kirurgi effektivt hæmme proteinernes funktioner og have fordelene ved cellemembranpenetration, lette procedurer og langvarig hæmning19,32. Metoderne, der anvender siRNA'er, antisense oligonukleotider eller lentivirus, har større begrænsninger i cellemembraners lave penetrationseffektivitet, bivirkninger uden for målet og let nedbrydning af siRNA eller oligonukleotider in vivo37,38,39,40.
Den meiotiske opdeling i levende væv er mere kompleks end i dyrkningsforhold, hvor vævsarkitekturen, udviklingssignalerne og miljøfaktorerne in vivo bør tages i betragtning41. Tidligere undersøgelser har vist, at kulturmedier og celleautonome faktorer er afgørende for stimuleringen af begyndelsen af meiotisk delingsfase. For eksempel fremmer fosfatasehæmmeren okadainsyre (OA)42, spermatocytspecifik histon HIST1H1T43, topoisomerase II 44 og metafasefremmende faktor (MPF)45 G2/MI-overgangen i dyrkede spermatocytter. Disse komplekse kulturbetingelser og faktorer bidrager til begrænsningerne ved kortvarig kultur af spermatocytter.
Direkte injektion af plasmid-DNA i testikler anvendes med succes i testismedieret genoverførsel og produktion af transgene mus32,46. In vivo-elektroporationen involverer injektion af et DNA-ekspressionsplasmid i lumen af seminiferøse tubuli og bruger derefter en række elektriske impulser til at ændre cellemembranpermeabilitet, forbedre effektiviteten af transgenekspression og genetisk modifikation 45,46,47,48,49. Vores metode kunne kombineres med in vivo-elektroporation samt fluorescerende mærkede proteiner og genredigeringsværktøjer, hvilket gør denne tilgang mere kraftfuld til analyser af mandlig meiotisk opdeling i den fysiologiske kontekst af væv og organer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker alle medlemmer af cytoskeletlaboratoriet ved Fujian Medical University for nyttige diskussioner. Vi takker Jun-Jin Lin på Public Technology Service Center, Fujian Medical University for teknisk assistance inden for flowcytometri. Vi takker Ming-Xia Wu og Lin-Ying Zhou på Electron Microscopy Lab of Public Technology Service Center, Fujian Medical University for teknisk assistance i elektronmikroskopi. Vi takker Si-Yi Zheng, Ying Lin, Qi Ke, og Jun Song på Experimental Teaching Center of Basic Medical Sciences ved Fujian Medical University for deres støtter. Denne undersøgelse blev støttet af følgende bevillinger: National Natural Science Foundation of China (bevillingsnummer 82001608), Natural Science Foundation of Fujian-provinsen, Kina (bevillingsnummer 2019J05071), Fujian Provincial Health Technology Project (bevillingsnummer 2018-1-69), Startup Fund for Scientific Research, Fujian Medical University (bevillingsnummer 2017XQ1001), Fujian Medical University talenter på højt niveau videnskabeligt forskningsstartfinansieringsprojekt (bevillingsnummer XRCZX2017025) og Forskningsprojekt af online uddannelse og undervisning af kinesiske medicin kandidatstuderende (bevilling nummer B-YXC20200202-06).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| 1 ml Syringe | Several commercial brands available | Sterile. | |
| 1.5 mL Centrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Corning | 430828 | |
| 6 cm Petri dish | Corning | 430166 | |
| 95% Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009164 | |
| tubulin rabbit polyclonal antibody | Beyotime | AF0001 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
| rabbit anti-Histone H3 (phospho S10) monoclonal antibody | Abcam | ab267372 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
| rabbit anti-TUBA4A polyclonal antibody | Sangon Biotech | D110022 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
| Anti-SYCP3 rabbit monoclonal antibody | Abcam | ab175191 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
| Adhesion microscope slides | CITOTEST | 188105 | |
| Alexa fluor 488-labeled goat anti-rabbit antibody | Beyotime | A0423 | Sencodary antibody. Use at 1:500. |
| Aluminium potassium sulphate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10001060 | |
| Anhydrous ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 100092690 | |
| Anti-fade mounting medium | Beyotime | P0131 | Prevent photobleching of flourescent signals. |
| BD FACS Canto II | BD Biosciences | FACS Canto II | |
| Bovine Serum Albumin | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 69003435 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424BK745380 | |
| Chloral hydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80037516 | |
| Citric acid | Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd | 122670 | |
| Collagenase | Sangon Biotech | A004194-0100 | |
| Coverslips | CITOTEST | 10212020C | 20 × 20 mm. Thickness 0.13-0.16 mm. |
| DAPI | Beyotime | C1006 | |
| Dye vat | Several commercial brands available | 91347802 | |
| Eosin Y, alcohol soluble | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 71014460 | |
| Ether | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009318 | |
| Formaldehyde - aqueous solution | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10010018 | |
| GSK923295 | MedChemExpress | HY-10299 | |
| Hematoxylin, anhydrous | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 71020784 | |
| ICR mouse | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd | ||
| Image J software | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | Fluorescent image analysis. |
| Leica ultramicrotome | Leica | ||
| Leica EM UC-7 ultramicrotome | Leica | EM UC7 | |
| Modfit MFLT32 | Verity Software House | For analysis of flow cytometry results. | |
| Nail polish | Several commercial brands available | ||
| Neutral gum | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10004160 | |
| Nikon Ti-S2 microscope | Nikon | Ti-S2 | |
| Picric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | J60807 | |
| Rheodyne | Sangon Biotech | F519160-0001 | 10 μl rheodyne |
| Sliced paraffin | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 69019461 | |
| Sodium iodate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80117214 | |
| Surgical instruments | Several commercial brands available | For abdominal surgery. Sterilize at 121 °C, 20 min. | |
| Transmission electron microscope | FEI | Tecnai G2 | |
| Trisodium citrate dihydrate | Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd | 173970 | |
| Triton X-100 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 30188928 | Dilute in sterile PBS to make a 0.25% working solution. |
| Tween 20 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 30189328 | Dilute in sterile PBS to make a 0.1% working solution. |
| Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80096618 | |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10023418 |
References
- Lenormand, T., Engelstädter, J., Johnston, S. E., Wijnker, E., Haag, C. R.
- Brandeis, M. New-age ideas about age-old sex: separating meiosis from mating could solve a century-old conundrum. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 93 (2), 801-810 (2018).
- Lane, S., Kauppi, L. Meiotic spindle assembly checkpoint and aneuploidy in males versus females. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 76 (6), 1135-1150 (2019).
- Handel, M. A., Schimenti, J. C. Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility. Nature Reviews Genetics. 11 (2), 124-136 (2010).
- Miller, M. P., Amon, A., Ünal, E. Meiosis I: when chromosomes undergo extreme makeover. Current Opinion in Cell Biology. 25 (6), 687-696 (2013).
- Duro, E., Marston, A. L. From equator to pole: splitting chromosomes in mitosis and meiosis. Genes & Development. 29 (2), 109-122 (2015).
- Eaker, S., Pyle, A., Cobb, J., Handel, M. A. Evidence for meiotic spindle checkpoint from analysis of spermatocytes from Robertsonian-chromosome heterozygous mice. Journal of Cell Science. 114, Pt 16 2953-2965 (2001).
- Faisal, I., Kauppi, L. Reduced MAD2 levels dampen the apoptotic response to non-exchange sex chromosomes and lead to sperm aneuploidy. Development. 144 (11), 1988-1996 (2017).
- Bolcun-Filas, E., Handel, M. A.
- Lawrence, C. J., et al.
- Cross, R. A., McAinsh, A. Prime movers: the mechanochemistry of mitotic kinesins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 257-271 (2014).
- Camlin, N. J., McLaughlin, E. A., Holt, J. E. Motoring through: the role of kinesin superfamily proteins in female meiosis. Human Reproduction Update. 23 (4), 409-420 (2017).
- Yen, T. J., Li, G., Schaar, B. T., Szilak, I., Cleveland, D. W. CENP-E is a putative kinetochore motor that accumulates just before mitosis. Nature. 359 (6395), 536-539 (1992).
- Wood, K. W., Sakowicz, R., Goldstein, L. S., Cleveland, D. W. CENP-E is a plus end-directed kinetochore motor required for metaphase chromosome alignment. Cell. 91 (3), 357-366 (1997).
- Abrieu, A., Kahana, J. A., Wood, K. W., Cleveland, D. W. CENP-E as an essential component of the mitotic checkpoint in vitro. Cell. 102 (6), 817-826 (2000).
- Mao, Y., Desai, A., Cleveland, D. W. Microtubule capture by CENP-E silences BubR1-dependent mitotic checkpoint signaling. The Journal of Cell Biology. 170 (6), 873-880 (2005).
- Gudimchuk, N., et al. Kinetochore kinesin CENP-E is a processive bi-directional tracker of dynamic microtubule tips. Nature Cell Biology. 15 (9), 1079-1088 (2013).
- Yu, K. W., Zhong, N., Xiao, Y., She, Z. Y. Mechanisms of kinesin-7 CENP-E in kinetochore-microtubule capture and chromosome alignment during cell division. Biology of the Cell. 111 (6), 143-160 (2019).
- She, Z. Y., et al. Kinesin-7 CENP-E regulates chromosome alignment and genome stability of spermatogenic cells. Cell Death Discovery. 6, 25 (2020).
- Parra, M. T., et al. Sequential assembly of centromeric proteins in male mouse meiosis. PLoS Genetics. 5 (3), 1000417 (2009).
- Parra, M. T., et al. Expression and behaviour of CENP-E at kinetochores during mouse spermatogenesis. Chromosoma. 111 (1), 53-61 (2002).
- Duesbery, N. S., et al. CENP-E is an essential kinetochore motor in maturing oocytes and is masked during mos-dependent, cell cycle arrest at metaphase II. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (17), 9165-9170 (1997).
- Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).
- Parks, J. E., Lee, D. R., Huang, S., Kaproth, M. T.
- Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471 (7339), 504-507 (2011).
- Staub, C. A century of research on mammalian male germ cell meiotic differentiation in vitro. Journal of Andrology. 22 (6), 911-926 (2001).
- Handel, M. A., Caldwell, K. A., Wiltshire, T. Culture of pachytene spermatocytes for analysis of meiosis. Developmental Genetics. 16 (2), 128-139 (1995).
- La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis. Methods in Molecular Biology. 558, 279-297 (2009).
- Putkey, F. R., et al. Unstable kinetochore-microtubule capture and chromosomal instability following deletion of CENP-E. Developmental Cell. 3 (3), 351-365 (2002).
- Wood, K. W., et al. Antitumor activity of an allosteric inhibitor of centromere-associated protein-E. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5839-5844 (2010).
- Nam, D., Sershon, R. A., Levine, B. R., Della Valle, C. J. The use of closed incision negative-pressure wound therapy in orthopaedic surgery. Journal of the American Academy Orthopaedic Surgeons. 26 (9), 295-302 (2018).
- She, Z. Y., et al. Kinesin-5 Eg5 is essential for spindle assembly and chromosome alignment of mouse spermatocytes. Cell Division. 15, 6 (2020).
- She, Z. Y., et al. Kinesin-6 family motor KIF20A regulates central spindle assembly and acrosome biogenesis in mouse spermatogenesis. Biochimica et Biophysica Acta-Molecular Cell Research. 1867 (4), 118636 (2020).
- Wellard, S. R., Hopkins, J., Jordan, P. W. A seminiferous tubule squash technique for the cytological analysis of spermatogenesis using the mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56453 (2018).
- Sato, M., Ishikawa, A., Kimura, M. Direct injection of foreign DNA into mouse testis as a possible in vivo gene transfer system via epididymal spermatozoa. Molecular Reproduction and Development. 61 (1), 49-56 (2002).
- Coward, K., et al. Expression of a fluorescent recombinant form of sperm protein phospholipase C zeta in mouse epididymal sperm by in vivo gene transfer into the testis. Fertility and Sterility. 85, 1281-1289 (2006).
- Davis, S., et al. Potent inhibition of microRNA in vivo without degradation. Nucleic Acids Research. 37 (1), 70-77 (2009).
- Zhao, H. T., et al. LRRK2 antisense oligonucleotides ameliorate α-Synuclein inclusion formation in a Parkinson's Disease mouse model. Molecular Therapy-Nucleic Acids. 8, 508-519 (2017).
- Shahzad, K., et al. CHOP-ASO Ameliorates Glomerular and Tubular Damage on Top of ACE Inhibition in Diabetic Kidney Disease. Journal of the American Society of Nephrology. 3, 2021040431 (2021).
- Kang, K., Niu, B., Wu, C., Hua, J., Wu, J. The construction and application of lentiviral overexpression vector of goat miR-204 in testis. Research in Veterinary Science. 130, 52-58 (2020).
- Karabasheva, D., Smyth, J. T. Preparation of Drosophila larval and pupal testes for analysis of cell division in live, intact tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60961 (2020).
- Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis. Developmental Biology. 169 (2), 557-567 (1995).
- Cobb, J., Cargile, B., Handel, M. A. Acquisition of competence to condense metaphase I chromosomes during spermatogenesis. Developmental Biology. 205 (1), 49-64 (1999).
- Cobb, J., Reddy, R. K., Park, C., Handel, M. A. Analysis of expression and function of topoisomerase I and II during meiosis in male mice. Molecular Reproduction and Development. 46 (4), 489-498 (1997).
- Inselman, A., Handel, M. A. Mitogen-activated protein kinase dynamics during the meiotic G2/MI transition of mouse spermatocytes. Biology of Reproduction. 71 (2), 570-578 (2004).
- Muramatsu, T., Shibata, O., Ryoki, S., Ohmori, Y., Okumura, J. Foreign gene expression in the mouse testis by localized in vivo gene transfer. Biochemical and Biophysical Research Communications. 233 (1), 45-49 (1997).
- Yamazaki, Y., et al. In vivo gene transfer to mouse spermatogenic cells by deoxyribonucleic acid injection into seminiferous tubules and subsequent electroporation. Biology of Reproduction. 59 (6), 1439-1444 (1998).
- Yamazaki, Y., Yagi, T., Ozaki, T., Imoto, K. In vivo gene transfer to mouse spermatogenic cells using green fluorescent protein as a marker. The Journal of Experimental Zoology. 286 (2), 212-218 (2000).
- Coward, K., Kubota, H., Parrington, J. In vivo gene transfer into testis and sperm: developments and future application. Archives of Andrology. 53 (4), 187-197 (2007).
