Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

הערכה תפקודית של קינזין-7 CENP-E בזרעונים באמצעות עיכוב Vivo , אימונופלואורסנציה וציטומטריית זרימה

Published: December 28, 2021 doi: 10.3791/63271
Automatic Translation
1,2, 1,2, 3,4, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Cell Biology and Genetics, The School of Basic Medical Sciences, Fujian Medical University, 2Key Laboratory of Stem Cell Engineering and Regenerative Medicine, Fujian Province University, 3Fujian Obstetrics and Gynecology Hospital, 4Medical Research Center, Fujian Maternity and Child Health Hospital, Affiliated Hospital of Fujian Medical University

Summary

מאמר זה מדווח על עיכוב in vivo של CENP-E באמצעות ניתוח בטן והזרקת GSK923295 באשכים, מודל רב ערך לחלוקה מיוטית גברית. באמצעות בדיקות אימונופלואורסצנטיות, ציטומטריית זרימה ומיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת, אנו מראים כי עיכוב CENP-E גורם לחוסר תיאום כרומוזומים וחוסר יציבות גנומית בזרעונים של עכברים.

Abstract

באיקריוטים, מיוזה חיונית ליציבות הגנום ולמגוון גנטי ברבייה מינית. ניתוחים ניסיוניים של זרעונים באשכים הם קריטיים לחקירת הרכבת ציר והפרדת כרומוזומים בחלוקה מיוטית גברית. זרע העכבר הוא מודל אידיאלי למחקרים מכניסטיים של מיוזה, עם זאת, שיטות יעילות לניתוח של זרעונים חסרים. במאמר זה מדווחת שיטה מעשית ויעילה לעיכוב in vivo של קינזין-7 CENP-E בזרעונים של עכברים. מוצג הליך מפורט להזרקת אשכים של מעכב ספציפי GSK923295 באמצעות ניתוח בטן בעכברים בני 3 שבועות. יתר על כן, מתוארת כאן סדרה של פרוטוקולים לאיסוף וקיבוע רקמות, צביעת hematoxylin-eosin, immunofluorescence, ציטומטריית זרימה ומיקרוסקופ אלקטרונים הולכה. כאן אנו מציגים מודל עיכוב in vivo באמצעות ניתוח בטן והזרקת אשכים, שיכול להיות טכניקה רבת עוצמה לחקר מיוזה גברית. אנו גם מראים כי עיכוב CENP-E גורם לחוסר תיאום כרומוזומים ולמעצר מטאפאזי בזרעונים ראשוניים במהלך מיוזה I. שיטת העיכוב in vivo שלנו תאפשר מחקרים מכניסטיים של מיוזה, תשמש כשיטה שימושית לשינויים גנטיים של קווי נבט זכריים, ותשפוך אור על יישומים קליניים עתידיים.

Introduction

מיוזה היא אחד האירועים האבולוציוניים החשובים ביותר, הנוקשים ביותר, שהשתמרו אבולוציונית באורגניזמים אאוקריוטים, והיא חיונית לגמטוגנזה, רבייה מינית, שלמות הגנום ומגוון גנטי 1,2,3. ביונקים, תאי הנבט עוברים שתי חלוקות תאים עוקבות, מיוזה I ו-II, לאחר סבב אחד של שכפול DNA. שלא כמו כרומטידים אחים במיטוזה, כרומוזומים הומולוגיים משוכפלים מתחברים ונפרדים לשני תאי בת במהלך מיוזה I 4,5. במיוזה II, כרומטידים אחים מתפרקים ונפרדים ליצירת גמטות הפלואידים ללא שכפול DNA6. טעויות בכל אחת משתי החטיבות המיוטיות, כולל פגמים בהרכבת ציר והפרדת כרומוזומים, יכולות לגרום לאובדן גמטות, סטריליות או תסמונות אנופלואידיות 7,8,9.

מחקרים מצטברים הראו כי מנועים ממשפחת הקינזינים ממלאים תפקיד מכריע בוויסות יישור הכרומוזומים והפרדתם, הרכבת צירים, ציטוקינזיס והתקדמות מחזור התא בתאים מיטוטיים ומיאוטיים 10,11,12. Kinesin-7 CENP-E (חלבון Centromere E) הוא מנוע קינטוחור מכוון פלוס הנדרש לקונגרס כרומוזומים, הובלה ויישור כרומוזומים, וויסות מחסום הרכבת ציר במיטוזה 13,14,15,16,17,18. במהלך מיוזה, עיכוב CENP-E על ידי המעכב הספציפי GSK923295 מוביל למעצר מחזור התא, חוסר תיאום כרומוזומים, חוסר ארגון ציר, וחוסר יציבות גנום בתאים ספרמטוגניים19. דפוסי הלוקליזציה והדינמיקה של CENP-E בצנטרומרים של זרעונים מתחלקים מצביעים על כך ש-CENP-E מקיים אינטראקציה עם חלבוני קינטוחור לצורך הרכבה רציפה של צנטרומרים במהלך מיוזה I20,21. בביציות, CENP-E נדרש ליישור כרומוזומים ולהשלמת מיוזה I13,22,23. נוגדנים או הזרקת מורפולינו של CENP-E גורמים לכרומוזומים לא מיושרים, אוריינטציה לא תקינה של קינטוחור ומיוזה שאני עוצר הן בביציות עכבר והן בביציות דרוזופילה 23. בהשוואה לתפקידים החיוניים של CENP-E במיטוזה, הפונקציות והמנגנונים של CENP-E במיוזה נותרו בלתי ידועים במידה רבה. מנגנונים מפורטים של CENP-E בקונגרס הכרומוזומים ויציבות הגנום בתאים מיוטיים זכריים עדיין לא ברורים.

ספרמטוגנזה היא תהליך פיזיולוגי מורכב וארוך טווח, הכולל שגשוג זרעונים רציף, מיוזה וספרמיוגנזה. לכן, התהליך כולו קשה במיוחד להתרבות במבחנה ביונקים ובמינים אחרים24,25. אי אפשר לגרום להתמיינות זרעונים לאחר שלב הפצ'יטן במבחנה. מחקרים על חלוקות מיוטיות גבריות הוגבלו בדרך כלל לניתוחים ניסיוניים של שלב מיוטי מוקדם25,26. למרות מאמצים טכנולוגיים רבים, כולל תרבית קצרת טווח של זרעונים27,28 ושיטות תרבית איברים 25, יש מעט שיטות יעילות לחקר חלוקה מיוטית גברית. יתר על כן, מחיקה גנטית של גנים חיוניים גורמת בדרך כלל למעצר התפתחותי ולקטלניות עוברית. לדוגמה, עוברי עכברים חסרי CENP-E אינם מצליחים להשתיל ואינם יכולים לפתח מעבר להשתלה29, דבר המהווה מכשול במחקרים מכניסטיים של CENP-E במיוזה. יחד, הקמת מערכת מעשית וישימה לחקר החלוקה המיוטית הגברית יכולה לקדם מאוד את תחום המחקר של מיוזה.

המעכב הקטן החדיר לתאים הוא כלי רב עוצמה לחקר מנועי קינזין בחלוקת תאים ובתהליכי התפתחות. המעכב האלוסטרי, GSK923295, נקשר באופן ספציפי לתחום המוטורי CENP-E, חוסם את שחרור ADP (אדנוזין דיפוספט), ולבסוף מייצב את האינטראקציות בין CENP-E ומיקרוטובולים30. במחקר זה, מודל עכבר מעכב in vivo מוצג באמצעות ניתוח בטן והזרקת אשכים של GSK923295. עיכוב CENP-E גורם לחוסר התאמה של כרומוזומים במטא-פאזה I של זרעונים ראשוניים. יתר על כן, עיכוב CENP-E מוביל למעצר מיוטי של זרעונים ולהפרעה של זרעונים. סדרה של פרוטוקולים מתוארת לניתוח של זרעונים וניתן ליישם אותם כדי לצפות במיקרוטובולים של ציר מיוטי, כרומוזומים הומולוגיים ואברונים תת-תאיים בזרעונים. שיטת העיכוב in vivo שלנו היא שיטה יעילה לחקר חלוקה מיוטית וספרמטוגנזה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטה הרפואית פוג'יאן (פרוטוקול מספר SYXK 2016-0007). כל הניסויים בעכברים בוצעו בהתאם להנחיות הרלוונטיות של הטיפול והשימוש בחיות מעבדה של המכונים הלאומיים לבריאות (פרסומי NIH מספר 8023, מתוקן 1978).

1. בניית מודלים של עכברי מעכבי CENP-E בתיווך GSK923295

  1. יש לעקר את כלי הניתוח בטמפרטורה של 121°C למשך 30 דקות. הקרינו את שולחן העבודה הכירורגי האולטרה-נקי עם Ultraviolet-C (UVC) למשך שעתיים. שקלו את עכברי ה-ICR (המכון לחקר הסרטן) בני 3 שבועות ששימשו לניסויים וחשבו את מינוני ההרדמה הנדרשים.
  2. מרדימים עכברים על ידי מתן שילוב של קטמין (100 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (10 מ"ג/ק"ג) באמצעות הזרקה תוך צפקית. בדוק את עומק ההרדמה של העכברים באמצעות שילוב של רפלקס הקרנית של העכבר, רפלקס nociceptive , נשימה, כמו גם טונוס שרירים. ודא שהעכברים מורדמים עמוק.
    הערה: הניחו את בעל החיים על כרית חימום כדי לספק תמיכה תרמית במהלך הניתוח.
  3. קשרו את איברי העכבר וקיבעו אותם על מגש השעווה. יש להניח טיפת משחה וטרינרית על עיני עכבר כדי למנוע יובש בזמן הרדמה. לגלח את שיער הבטן של העכבר מהבטן התחתונה אל שק האשכים באמצעות סכין גילוח ניסיוני של בעלי חיים. אבטחו את אזור הניתוח בעזרת שפשוף סטרילי.
  4. יש לחטא את הבטן הגחונית עם פילינג בטאדין ואחריו 75% אתנול שלוש פעמים. פתח את חלל הבטן באמצעות אזמל סטרילי וצור פתח של <5 מ"מ.
  5. הדקו את העור עם מלחציים כירורגיים סטריליים ומשכו את כרית השומן האפידידימלית עם מלקחיים מנתחים סטריליים כדי לאתר את האשכים באמצעות פינצטה סטרילית. לתקן את האשכים עם מלקחיים סטריליים תחת סטריאוסקופ, ולהזריק לאט 10 μL של GSK923295 לתוך צינוריות seminiferous בריכוז סופי של 10 μM באמצעות 10 μL של rheodyne30. לבניית קבוצת הביקורת, יש להזריק 10 μL של תמיסת 1% DMSO (dimethyl sulfoxide)/PBS (פוספט חוצץ מלוחים).
    הערה: אחסן את תמיסת GSK923295 בריכוז של 10 mM ב- -80°C. יש להמיס 0.1 μL של 10 mM GSK923295 לתוך 100 μL של תמיסת PBS כדי להכין את 10 μM של תמיסת GSK923295.
  6. דוחפים בעדינות את האשכים חזרה לחלל הבטן בעזרת מלקחיים כירורגיים סטריליים. תפרו את הצפק והעור בנפרד עם שניים עד ארבעה תפרים באמצעות קו התפרים בקוטר של 0.1 מ"מ.
  7. תייגו מקום בגודל 3X3 מ"מ על גב בעל החיים בטוש קבוע לאחר ניתוח בטן, החזירו את העכבר לכלוב ההאכלה והבטיחו סביבה נקייה ונטולת פתוגנים עם מספיק מזון ומים.
  8. שמור על הסביבה במצב סטרילי באמצעות האוויר המסונן, המזון והמים המעוקרים. טפל בבעל החיים עד שהוא חזר להכרה מספקת כדי לשמור על שכיבה עצם החזה. עבור שיכוך כאבים לאחר הניתוח, לנהל מנה של buprenorphine (0.1 מ"ג / ק"ג) תת עורית כל 12 שעות במשך 3 ימים. ודא שהעכבר אינו מוחזר לחברתם של בעלי חיים אחרים עד להחלמה מלאה.
    הערה: העכברים מקבלים טיפול לאחר הניתוח, ונותנים לפצע הרדמה מקומית באמצעות 0.5% לידוקאין כדי להפחית את הכאב לאחר הניתוח בעת הצורך.

2. צביעת Hematoxylin-eosin (HE) והיסטופתולוגיה

  1. ארבעה ימים לאחר ניתוח בטן, הרדימו את העכברים עםCO2 בקצב זרימה של 2 ליטר/דקה בתא CO2 . לאשר מוות על ידי נקע צוואר הרחם כשיטה מאשרת של המתת חסד. השתמש מספריים כירורגיים כדי לפתוח את שק האשכים ולהסיר את האשכים עם מלקחיים. לאסוף אשכי עכבר 4 ימים לאחר הזרקת GSK923295 ולתקן אותם 30 מ"ל של 10% תמיסת פורמלדהיד בטמפרטורת החדר במשך 12 שעות.
  2. עבור התייבשות הדרגתית, לדגור ברצף את הדגימה ב 40 מ"ל של 70% אתנול במשך 1 שעות, ב 40 מ"ל של 85% אתנול במשך 1 שעות, ב 40 מ"ל של 95% אתנול במשך 1 שעות, וב 40 מ"ל של 100% אתנול במשך 1 שעות.
  3. לדגור את הדגימה ב 40 מ"ל של xylene במשך 40 דקות, ולאחר מכן ב 40 מ"ל של פרפין במשך 1 שעה ב 65 ° C. הניחו את הרקמות בתחתית קופסת ההטבעה. מוסיפים את הפרפין המומס לקופסת ההטבעה. מצננים את הרקמות להתמצקות מלאה ב-4°C למשך 6 שעות.
  4. מקבעים את הדגימות על מחזיק האולטרה-מיקרוטום, שומרים על הזווית בין הדגימות למשטח הסכין על 5-10°, ומכוונים את עובי הפרוסה ל-5 מיקרומטר. הכינו את החלקים בעובי 5 מיקרומטר באמצעות אולטרה-מיקרוטום, פרסו את המגלשות באמבט מים ב-40°C וייבשו את החלקים במגלשה יבשה למשך 12 שעות ב-37°C.
  5. לדגור על שקופיות ב 200 מ"ל של קסילן במשך 40 דקות, ב 200 מ"ל של 100% אתנול במשך 6 דקות, ב 200 מ"ל של 95% אתנול במשך 2 דקות, ב 200 מ"ל של 90% אתנול במשך 2 דקות, ב 200 מ"ל של 80% אתנול במשך 2 דקות, וב 200 מ"ל של 70% אתנול במשך 2 דקות, בהתאמה.
  6. שטפו את המגלשות במים מזוקקים במשך 5 דקות והכתימו אותן בתמיסת המטוקסילין של מאייר למשך 6 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: תמיסת המטוקסילין של מאייר: 0.011 mol/L hematoxylin, 6.7% אתנול נטול מים, 0.646 mol/L אלומיניום אשלגן סולפט, ו-0.003 mol/L נתרן יודאט.
  7. שוטפים את המגלשות במים זורמים במשך 5 דקות ודגרים במים מזוקקים למשך 2 דקות.
  8. לדגור את המגלשות באתנול הידרוכלוריד 1% במשך 3 שניות, ולאחר מכן לשטוף אותם במים זורמים במשך 2 דקות.
  9. מכתימים את הדגימה עם 1% eosin במשך 15 שניות, ולאחר מכן לדגור אותם עם 95% אתנול במשך 5 שניות, עם 100% אתנול במשך 2 דקות, ובקסילן במשך 40 דקות.
  10. אטמו את המגלשות באמצעות 15 μL של מסטיק נייטרלי וכיסוי 24 x 50 מ"מ.

3. אימונופלואורסנציה ומיקרוסקופ קונפוקלי

  1. לאסוף את קטעי פרפין בעובי 5 מיקרומטר של אשכי עכבר עבור immunofluorescence. לדגור על המגלשות בקסילן במשך 40 דקות, ב-100% אתנול במשך 6 דקות, באתנול 95% למשך 2 דקות, באתנול 90% למשך 2 דקות, באתנול 80% למשך 2 דקות, ובאתנול 70% למשך 2 דקות. שטפו את המגלשות במים מזוקקים במשך 5 דקות, ושטפו את המגלשות עם 0.01 מ' PBS במשך 5 דקות.
  2. מניחים את המגלשות בתמיסת שליפת האנטיגן (חיץ ציטראט 0.01 מ') ומרתיחים בלחץ גבוה באמצעות סיר לחץ למשך 4 דקות לשליפת אנטיגן. מצננים את המגלשות באופן טבעי לטמפרטורת החדר. יש לשטוף פעמיים במים מזוקקים במשך 5 דקות, ועם PBS במשך 5 דקות.
    הערה: חיץ ציטראט 0.01 M (pH 6.0): 2.1 mmol / L חומצת לימון, 11.6 mmol / L טריסודיום ציטראט דיהידרט.
  3. חדיר תאים על ידי דגירה של המגלשות ב 500 μL של 0.25% TritonX-100/PBS במשך 10 דקות. שטפו את המגלשות עם PBS במשך 5 דקות שלוש פעמים.
  4. לחסימת אנטיגן, יש לדגור על הדגימות עם 300 μL של אלבומין בסרום בקר 3% (BSA)/PBST (0.1% Tween-20 ב-PBS) למשך שעה אחת. לדגור על הדגימות עם הנוגדנים הראשוניים ב 3% BSA/PBST במשך 16 שעות ב 4 ° C. שים את המגלשות בקופסה לחה כדי למנוע מהרקמות להתייבש. חממו מחדש את המגלשות באופן טבעי לטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
  5. יש להשליך את הנוגדן הראשוני ולאחר מכן לשטוף את השקופיות ב-PBST במשך 5 דקות שלוש פעמים. לדלל נוגדנים משניים ב-3% BSA/PBST. לדגור את הדגימות עם נוגדנים משניים במשך 1-2 שעות ב 37 ° C. שטפו את הדגימות ב-PBST במשך 5 דקות חמש פעמים.
  6. מכתימים את הגרעינים ב-50 μL של 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. הרכיבו את הכיסוי עם אמצעי ההרכבה נגד דהייה, ואטמו את הכיסוי עם לק.
  7. צפה והקלט אותות פלואורסצנטיים בשקופיות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד במטרה NA 40x/ 0.75.

4. ציטומטריית זרימה

  1. לאסוף אשכי עכבר בצלחות פטרי 6 ס"מ לחתוך את האשכים לתוך 1 מ"מ3 חתיכות באמצעות מספריים כירורגיים.
  2. לעכל את האשכים באמצעות 1 מ"ל של 1% collagenase בצינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל במשך 10 דקות ב 37 ° C, ולאחר מכן צנטריפוגה את הדגימות ב 1,000 x גרם במשך 5 דקות כדי לזרז תאים זרע.
  3. השליכו את הסופרנטנט ולאחר מכן הוסיפו 1 מ"ל של תמיסת טריפסין-EDTA (אתילן דיאמין חומצה טטראצטית) למשך 20 דקות ב-37°C, ולאחר מכן בצעו צנטריפוגות בטמפרטורה של 1,000 x גרם למשך 5 דקות.
  4. להשליך את supernatant, ולאחר מכן לדגור את התאים המושקעים עם 1 מ"ל של אתנול קר 70% במשך יותר מ 8 שעות ב 4 ° C.
  5. צנטריפוגו את הדגימות ב 1,000 x גרם במשך 5 דקות, ולאחר מכן לאסוף משקעי התא. צבעו את תאי הזרע בתמיסת צביעה של 500 מיקרוליטר פרופידיום יודיד (PI) (50 מיקרוגרם/מ"ל PI, 100 מיקרוגרם/מ"ל RNase A ו-0.2% טריטון X-100 ב-PBS) ב-37°C למשך 30 דקות.
    הערה: נער בעדינות את צינור הצנטריפוגה כל 5 דקות כדי למנוע הצטברות תאים.
  6. סנן את הדגימות באמצעות רשת רשת של 300 כדי להיפטר מפסולת תאים; לאסוף את התאים בצינור זרימה ולאחסן אותם ב 4 ° C.
  7. זיהוי אותות פלואורסצנטיים ופיזור אור באורך גל עירור של 488 ננומטר באמצעות ציטומטר זרימה. נתח את תוכן הדנ"א ואת פיזור האור באמצעות תוכנת Modfit MFLT32.

5. מיקרוסקופ אלקטרונים שידור

  1. חותכים את האשכים ל 1 מ"מ3 חתיכות באמצעות אזמל חד, ודגרים במהירות את הדגימות עם 3% גלוטראלדהיד-1.5% תמיסת פרפורמלדהיד ב 0.1 M PBS (pH 7.2) במשך 4 שעות ב 4 ° C כדי למנוע את השינויים של ultrastructure. שטפו את הדגימות עם 0.1 M PBS במשך 5 דקות שלוש פעמים.
    הערה: האזמל והמספריים צריכים להיות חדים, ולנסות להימנע מסחיטה ומשיכה מלאכותיות. עיבוד הדגימות צריך להתבצע בנוזל הקיבוע.
  2. תקן את הדגימות בתמיסת 1% חומצה אוסמית-1.5% אשלגן פרוציאניד ב -4 ° C למשך 1.5 שעות. יבשו את המים עם נייר סינון ושטפו את הדגימות עם 0.1 M PBS במשך 5 דקות שלוש פעמים.
  3. יש לייבש את הדגימות ב-40 מ"ל אתנול 50% למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. לדגור על הדגימות ב 40 מ"ל של 70% אתנול רווי אורניום אצטט צבע ב 4 ° C במשך 12 שעות, ב 40 מ"ל של 90% אתנול במשך 10 דקות ב 4 ° C, ב 40 מ"ל של 90% אתנול אצטון במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, וב 40 מ"ל של אצטון נטול מים במשך 10 דקות שלוש פעמים בטמפרטורת החדר.
  4. דגרו על הדגימות בתערובת נטולת מים של שרף אצטון-אפוקסי 618 (v / v = 1:1) למשך 1.5 שעות, ולאחר מכן הטמיעו את הדגימות בחומרי הטבעה של שרף אפוקסי 618 בטמפרטורה של 35°C למשך 3 שעות.
  5. עבור פילמור שרף, לדגור את הדגימות בחומרים מטביעים שרף אפוקסי 618 ב 35 ° C במשך 12 שעות, ב 45 ° C במשך 12 שעות, ולאחר מכן ב 60 ° C במשך 24 שעות.
  6. התקן את הדגימות ואת סכין הזכוכית ולאחר מכן התאם את המרחקים בין הדגימות לסכין. הכינו את המקטעים הדקים במיוחד בעובי 90 ננומטר באמצעות מיקרוטום דק במיוחד. פורסים את הדגימות במהירות קבועה, ולאחר מכן מניחים את השקופיות על רשת ניקל. מניחים את המגלשות בצלחת פטרי בטמפרטורת החדר.
  7. הכתימו את המגלשות עם 2% אורניל אצטט למשך 10 דקות, ולאחר מכן הכתימו את הדגימות עם 2% עופרת ציטראט למשך 10 דקות. שטפו את המגלשות במים מזוקקים. יבשו את המגלשות במשך 24 שעות בטמפרטורת החדר.
  8. התבונן בשקופיות והקלט תמונות אלקטרונים במהירות של 70-100 קילו-וולט באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בנינו בהצלחה מודל עיכוב CENP-E in vivo של אשכי עכבר באמצעות ניתוחי בטן והזרקת אשכים של GSK92329519. השלבים הטכניים העיקריים של שיטה זו הוצגו באיור 1. לאחר הזרקת אשכים של GSK923295 במשך 4 ימים, האשכים נקצרו, לניתוחים נוספים. בקבוצת הביקורת, הגל הזרעוני בצינוריות הזרע היה סדיר ומאורגן (איור 2A). אולם בקבוצת GSK923295, הגל הזרעוני השתנה בצינוריות הזרע, והמטאפאזות שנעצרו בזרעונים הראשוניים גדלו באופן משמעותי לאחר עיכוב CENP-E (איור 2B-D). חשוב לציין שכמה כרומוזומים הומולוגיים לא היו מיושרים בלוח המשווני לאחר עיכוב CENP-E (איור 2B-D). יתר על כן, עיכוב CENP-E הוביל גם לעלייה של זרעונים מטא-פאזיים I בצינוריות זרע (איור 2E,F,G). יחד, עיכוב CENP-E גורם לחוסר התאמה של כרומוזומים בזרעונים ראשוניים במהלך מיוזה I, מה שמרמז על כך ש- CENP-E אחראי לקונגרס הכרומוזומים ויישור הזרעונים במיוזה.

כדי לאמת עוד יותר את התוצאות הללו, ביצענו את בדיקות האימונופלואורסצנטיות כדי לזהות את תאי הזרע בצינוריות זרע. מצאנו שהגל הזרעוני הרגיל שהוצג בקבוצת הביקורת השתנה ללא ספק והפך לבלתי סדיר בקבוצת GSK923295 (איור 3). הציר המיוטי של הזרעונים המתחלקים סומן בנוגדן אנטי-α-טובולין, וחוט הלהט הרוחבי של קומפלקסים סינפטונמליים בתאי הזרע סומן בנוגדן קומפלקס אנטי-סינפטונמלי 3 (SYCP3) (איור 3A). התאים החיוביים ל-SYCP3 לכל צינורית זרע ירדו לאחר עיכוב CENP-E (איור 3B). בינתיים, נקודות SYCP3 לכל תא מטא-פאזי לא הופרעו לאחר עיכוב CENP-E (איור 3C). נוסף על כך, מתיחות SYCP3 לכל תא גם לא הושפעו בקבוצות GSK92395 (איור 3D). באופן מדהים, מצאנו שהמרחקים של קטבי ציר בזרעונים מטא-פאזיים I גדלו לאחר עיכוב CENP-E (איור 3E,F). תוצאות אימונופלואורסצנטיות אלה מצביעות על כך ש- CENP-E נדרש לחוסר התאמה של כרומוזומים ולתהליכי הזרע, והוא חיוני לשמירה על ציר דו קוטבי וארגון הציר המיוטי.

כדי לחקור אוכלוסיות תאים באשכי עכברים, עיכלנו את האשכים וביצענו בדיקות של צביעת PI וציטומטריית זרימה (איור 4). ההליכים הטכניים החשובים הוצגו באיור 4A-C. תאי הזרע מורכבים ממספר אוכלוסיות תאים, כולל הזרעונים, זרעונים ראשוניים, זרעונים משניים, זרעונים וזרעונים. תכולת הדנ"א של תאי הזרע האלה הוצגה באיור 4A. הראינו כי עיכוב CENP-E הביא לירידה של התאים ההפלואידים מ-42.95 ±-1.09% בקבוצת הביקורת ל-38.26 ±-1.86% בקבוצת GSK923295 (איור 4B-D). היחסים בין התאים הדיפלואידים לתאים האנאופלואידיים לא הושפעו באופן משמעותי לאחר עיכוב CENP-E (איור 4E,F). יתר על כן, היחס בין תאי הטטרפלואידים עולה מ-17.76 ±-1.52% בקבוצת הביקורת ל-28.88 ±-2.05% בקבוצת GSK923295 (איור 4G). יחד, אנו מוצאים כי אוכלוסיות התאים של תאי הזרע משתנות מעט לאחר עיכוב CENP-E. עיכוב CENP-E גורם לירידה בתאים הפלואידים ולעלייה בתאי טטרפלואיד, מה שמצביע על כך שעיכוב CENP-E קשור למעצר מטא-פאזי בזרעונים המתחלקים.

יתר על כן, צפינו במבנה התת-מיקרוסקופי של תאי הזרע באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים הולכה (איור 5). ארגון הכרומטין, הרשתית האנדופלסמית והמיטוכונדריה של זרעונים הוצגו באיור 5. מצאנו שארגון תאי הזרע השתבש מעט בקבוצת GSK923295 (איור 5).

Figure 1
איור 1: ביסוס מודל עיכוב in vivo של אשכי עכבר באמצעות ניתוחי בטן ומתן אשכים. (A) כל כלי הניתוח המשמשים בניתוחי בטן. 1) מספריים מנתחים, 2) מלקחיים מחט, 3) מלקחיים ישרים, 4) פינצט, 5) ראודין, 6) מזרק 1 מ"ל, 7) אזמל עם ידית מס' 3 ולהב מס' 11, 8) סטילוליט, 9) מחטי תפירה עגולות, 1/2 0.6 x 14 מ"מ, 1/2 0.7 x 17 מ"מ, 10) מקלוני אתנול. (B) לאחר ההרדמה, העכברים הונחו במצב שכיבה על מגש שעווה, הבטן התחתונה הוכנה וחוטאה באתנול 75%. (C) פתח בקוטר <5 מ"מ נעשה באמצע הבטן התחתונה. (D) כרית השומן האפידידימלית נמשכה באמצעות מלקחיים מנתחים סטריליים כדי לאתר את האשכים. האשכים הוזרקו עם 10 μL GSK923295 באמצעות rheodyne 10 μL. (E) הצפק והעור נתפרו בו זמנית בשני תפרים. (F) הפצע עבר חיטוי באתנול 75%. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: עיכוב CENP-E הביא למעצר של מיוזה I ולחוסר התאמה של כרומוזומים בזרעונים של עכברים . (A) צביעת תאי הזרע בקבוצת הביקורת. החצים מציינים את הזרעונים. (B) צביעת תאי הזרע בקבוצת GSK923295. לאשכים הוזרקו GSK923295 למשך 4 ימים בריכוז סופי של 10 מיקרומטר. החיצים מצביעים על חוסר התאמה של הכרומוזומים בזרעונים. עבור כל התמונות, סרגל קנה מידה, 10 מיקרומטר. (C) יחס של זרעונים metaphase ב tubules seminiferous. שליטה, 13.43 ± 1.68%; GSK923295, 42.29 ± 3.94%. N = 1308 תאים נותחו. קבוצה = 4. מבחן t של התלמיד. קווי שגיאה, פירושו ± SEM. ***, P < 0.001. (D) יחס של צינוריות זרע עם זרעונים מתחלקים. שליטה, 5.38 ± 2.64%; GSK923295, 33.96 ± 3.87%. N = 151 צינוריות זרע נותחו. קבוצה = 4. (E) תמונות אימונופלואורסצנטיות של Histone H3 (phospho Ser 10) ו-TUBA4A בקבוצות הבקרה וה-GSK923295. TUBA4A, אדום; היסטון H3 (פוספו סר 10), ירוק; DAPI, כחול. סרגל קנה מידה, 10 מיקרומטר. התיבה המוגדלת מוגדלת. (F) כימות מספר תאי המטאפאזות בצינוריות זרע. בקרה, 11.45 ± 1.55; GSK923295, 18.91 ± 2.36. N = 11. (ז,ח) ניתוח קווי של עוצמות פלואורסצנטיות של Histone H3 ו- TUBA4A בזרעונים מטאפאזיים I של קבוצת הביקורת (G) וקבוצת GSK923295 (H). TUBA4A, אדום; היסטון H3 (פוספו סר 10), ירוק; DAPI, כחול. ציר X מציין את המרחק היחסי. ציר Y מציין עוצמות פלואורסצנטיות. מבחן t של התלמיד. קווי שגיאה, ממוצע ± SEM. *, P < 0.05; ***, P < 0.001. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: עיכוב CENP-E על-ידי GSK923295 הוביל לחוסר ארגון של צינוריות זרע ולהפרעה של זרעונים . (A) תמונות אימונופלואורסצנטיות מייצגות של SYCP3 ו-TUBA4A בקבוצת הביקורת ובקבוצות GSK923295. SYCP3, אדום; TUBA4A, ירוק; DAPI, כחול. סרגל קנה מידה, 10 מיקרומטר. (B) תאים חיוביים SYCP3 לכל צינוריות זרע בקבוצת הבקרה ובקבוצות GSK923295. בקרה, 56.00 ± 5.43%; GSK923295, 39.00 ± 1.73%. N = 10. (C) הכימות של נקודות SYCP3 לכל תא מטאפאזה. בקרה, 10.00 ± 1.02; GSK923295, 9.71 ± 0.86, N = 7. (D) הכימות של SYCP3 נמתח לכל תא בקבוצת הבקרה ובקבוצות GSK923295. בקרה, 8.63 ± 0.22; GSK923295, 8.21 ± 0.21. N = 19. (E) ניתוח המרחק של קטבי ציר במטאפאזות I של זרעונים. שליטה, 8.20 ± 0.28 מיקרומטר; GSK923295, 9.30 ± 0.29 מיקרומטר. N = 30. (F) תמונות אימונופלואורסצנטיות של צינוריות זרע בקבוצת הבקרה ובקבוצות GSK923295. החצים מציינים את הזרעונים. DAPI, ירוק; β-טובולין, ירוק. התמונות המוגדלות של התיבה המקווקו הוצגו בזום. עבור כל התמונות, סרגל קנה מידה, 10 מיקרומטר. מבחן t של סטודנט. קווי שגיאה, ממוצע ± SEM. ns, P > 0.05; * *, P < 0.01. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: ניתוח ציטומטריית זרימה של תאי זרע באשכי עכבר. (A) איורים סכמטיים של שלבי המפתח בניתוח מחזור התא של תאי זרע בעכבר. הזרעונים הדיפלואידים עוברים מיוזה I ו- II כדי ליצור את הזרעונים הפלואידים. הערך C מציין את תוכן ה- DNA. ערך N (פלוידי) מציין את מספר קבוצות הכרומוזומים. (ב,ג) ניתוח ציטומטריית זרימה של תאי הזרע בקבוצת הביקורת (B) ובקבוצת GSK923295 (C). עבור עיכוב CENP-E in vivo , GSK923295 הוזרק לאשכי עכבר ICR זכר בן 3 שבועות בריכוז סופי של 10 מיקרומטר למשך 4 ימים. לצורך ניתוח מחזור התא, n = 3,000 תאים נמדדו ונותחו. P4, התאים הפלואידים (1C). P5, התאים הדיפלואידים (2C). P6, תאי הטטרפלואיד (4C). (D) יחסי התאים ההפלואידים בקבוצת הביקורת ובקבוצת GSK923295. בקרה, 42.95 ± 1.09%; GSK923295, 38.26 ± 1.86%. N = 8. (E) יחסי התאים הדיפלואידים בקבוצת הבקרה ובקבוצת GSK923295. בקרה, 20.10 ± 0.91%; GSK923295, 17.95 ± 0.81%. N = 8. (F) יחסי התאים האנאופלואידים (2C ~ 4C) בקבוצת הבקרה ובקבוצות GSK923295. שליטה, 3.41 ± 0.23%; GSK923295, 3.39 ± 0.25%. N = 8. (G) יחסי התאים הטטרפלואידים בקבוצת הבקרה ובקבוצת GSK923295. בקרה, 17.76 ± 1.52%; GSK923295, 28.88 ± 2.05%. N = 8. עבור כל הגרפים, מבחן התלמיד לא . קווי שגיאה, ממוצע ± SEM. ns, P > 0.05; *, P < 0.05; P < 0.001., אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: ניתוח מיקרוסקופ אלקטרונים של תאי זרע בקבוצת הביקורת ובקבוצת GSK923295. (A) תמונות מייצגות של צינוריות זרע בקבוצת הביקורת. סרגל קנה מידה, 5 מיקרומטר. (B) התמונה המוגדלת של גרעין הזרע. החיצים מציינים כרומטין הומולוגי של הזרעונים. סרגל קנה מידה, 1 מיקרומטר. (C) התמונה המוגדלת של הציטופלסמה של הזרעונים. סרגל קנה מידה, 1 מיקרומטר. (D) תמונות מייצגות של צינוריות זרע בקבוצה GSK923295. האשכים טופלו עם 10 מיקרומטר GSK923295 במשך 4 ימים. סרגל קנה מידה, 5 מיקרומטר. (E) התמונה המוגדלת של גרעין הזרע בקבוצה GSK923295. סרגל קנה מידה, 1 מיקרומטר. (F) התמונה המוגדלת של הציטופלסמה של הזרעונים בקבוצה GSK923295. סרגל קנה מידה, 1 מיקרומטר. עבור כל הגרפים, sc, זרעונים; SD, זרע. ER, רשתית אנדופלסמית; MT, מיטוכונדריה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

במחקר זה, ביססנו מודל עיכוב CENP-E in vivo של אשכי עכבר באמצעות ניתוח בטן ומיקרו-הזרקה של GSK923295. לניתוח הבטן ולשיטת הזרקת האשכים המשמשים במחקר זה יש את היתרונות הבאים. ראשית, הוא אינו מוגבל לגיל העכברים. נסיינים יכולים לבצע הזרקת אשכים בשלב מוקדם, למשל, בעכברים בני 3 שבועות או צעירים יותר. שנית, GSK923295 יש השפעה מעכבת ספציפית ומצוינת על CENP-E. שלישית, שיטה זו פשוטה לתפעול וניתנת לשחזור רב. בנוסף, שלמות האשכים נשמרים, אשר מתאים למחקרים של רקמות שלמות בהקשר של האיברים.

ישנם מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול זה. לדוגמה, חשוב לשמור על סביבה סטרילית במהלך ניתוח בטן למניעת זיהומים לאחר הניתוח31. יתר על כן, עבור עכברים בגילאים שונים או חיות ניסוי שונות, יש להתאים את כמויות ההזרקה בהתאם לגודל האשכים ויעילות התרופות19,32. בנוסף, זמן העיכול הנכון והתצפית המיקרוסקופית נדרשים לקביעת תאים בודדים ובדיקות אוכלוסיית תאים עוקבות במהלך ציטומטריית זרימה. עם זאת, ישנן מספר מגבלות בפרוטוקול זה. קשה להשתמש בניתוח בטן כדי לבנות מודל עכבר כאשר גיל העכבר הוא פחות משבועיים. הסיבות העיקריות הן שהעכברים צעירים מדי, הדיאטה שלאחר הניתוח קשה ושיעור ההישרדות נמוך. התרופות המשמשות מודלים בעלי חיים הם נוזליים ויש להם את המאפיינים של קרום התא חודר בקלות 19,32,33, אשר מתאימים ליישומים של שיטת הממשל הזה.

הבנת המיוזה מגורה על ידי תרביות תאים חוץ גופיות ומחקרי נוקאאוט גנטי, אולם היא אינה ישימה בקלות בזרעונים של יונקים28. המכשול בפני המחקרים המכניסטיים של המיוזה הגברית היה היעדר מערכת מתאימה למניפולציה ותצפית על חלוקת זרעונים במיוזה27. העכבר הוא אורגניזם מודל מצוין במחקר של מנגנונים תאיים ומולקולריים של מיוזה במהלך spermatogenesis. הגל הראשון של זרעונים בעכברים מתחיל מיוזה ביום 10 לאחר הלידה (dpp) ומתפתח לזרע בוגר בגיל 35 dpp, המספק חלון זמן התפתחותי לחקר חלוקה מיוטית וזרע34.

הזרקת אשכים, כולל הזרקה ישירה דרך שק האשכים ומיקרו-הזרקה באמצעות ניתוח הבטן, היא טכניקה שימושית לחקר ספרמטוגנזה35,36. הזרקה ישירה דרך שק האשכים היא מהירה ופשוטה, וגורמת רק לטראומה כירורגית קלה, המתאימה לעכברים בני 4 שבועות ומעלה עם האשכים היורדים לשק האשכים. עם זאת, אי אפשר להזריק את האשכים undescended של עכברים בני 3 שבועות או צעירים יותר. מיקרו-הזרקה באמצעות ניתוח תוך צפקי או ניתוח שק האשכים מתאימה להזרקת אשכים טמירים, הדורשת מיומנות כירורגית מיומנת של מפעילי ניסוי, סטריאומיקרוסקופ וציוד כירורגי ומעבדה. על פי אתרי ההזרקה, ניתן לסווג מיקרו-הזרקה להזרקת צינורית זרע, הזרקת רשת אשכים והזרקת אינטרסטיציאל באשכים. בהשוואה למודלים אחרים של טסטיס מבוססי הזרקה, הזרקת מעכבים באמצעות ניתוח בטן יכולה לעכב ביעילות את תפקודי החלבונים ויש לה את היתרונות בחדירה לקרום התא, הליכים קלים ועיכוב לטווח ארוך19,32. לשיטות המשתמשות ב- siRNAs, אוליגונוקלאוטידים אנטיסנס או לנטיוירוס יש מגבלות גדולות יותר ביעילות חדירה נמוכה של קרום התא, תופעות לוואי מחוץ למטרה, ופירוק קל של siRNA או אוליגונוקלאוטידים in vivo37,38,39,40.

החלוקה המיאוטית ברקמות חיות מורכבת יותר מזו שבתנאי תרבית, שבה יש לקחת בחשבון את ארכיטקטורת הרקמות, האיתות ההתפתחותי והגורמים הסביבתיים in vivo 41. מחקרים קודמים הוכיחו כי מדיה תרבית וגורמים אוטונומיים של תאים חיוניים לגירוי תחילת שלב החלוקה המיוטית. לדוגמה, מעכב פוספטאז חומצה אוקדאית (OA)42, היסטון ספציפי לזרע HIST1H1T 43, טופואיזומראז II 44 וגורם מקדם מטאפאזות (MPF)45 מקדמים את המעבר G2/MI בזרעונים בתרבית. תנאי תרבית מורכבים אלה וגורמים תורמים למגבלות של תרבית קצרת טווח של זרעונים.

הזרקה ישירה של DNA פלסמיד לאשכים מיושמת בהצלחה באשכים בתיווך העברת גנים וייצור עכברים טרנסגניים32,46. אלקטרופורציה in vivo כוללת הזרקה של פלסמיד ביטוי DNA לתוך לומן של צינוריות seminiferous, ולאחר מכן להשתמש בסדרה של פולסים חשמליים כדי לשנות את חדירות קרום התא, לשפר את היעילות של ביטוי טרנסגנים, ושינוי גנטי 45,46,47,48,49. השיטה שלנו יכולה להיות משולבת עם אלקטרופורציה in vivo, כמו גם חלבונים מתויגים פלואורסצנטיים וכלי עריכת גנים, מה שהופך גישה זו חזקה יותר לניתוח של חלוקה מיוטית גברית בהקשר הפיזיולוגי של רקמות ואיברים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים לכל חברי מעבדת Cytoskeleton באוניברסיטה הרפואית פוג'יאן על דיונים מועילים. אנו מודים לג'ון-ג'ין לין במרכז השירות לטכנולוגיה ציבורית, האוניברסיטה הרפואית פוג'יאן על הסיוע הטכני בציטומטריית זרימה. אנו מודים למינג-שיה וו וללין-יינג ג'ואו במעבדת מיקרוסקופיית אלקטרונים במרכז השירות לטכנולוגיה ציבורית, האוניברסיטה הרפואית פוג'יאן על הסיוע הטכני במיקרוסקופ אלקטרונים. אנו מודים לסי-יי ג'נג, יינג לין, צ'י קה וג'ון סונג במרכז להוראה ניסויית של מדעי הרפואה הבסיסיים באוניברסיטה הרפואית פוג'יאן על תמיכתם. מחקר זה נתמך על ידי המענקים הבאים: הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מענק מספר 82001608), הקרן למדעי הטבע של מחוז פוג'יאן, סין (מענק מספר 2019J05071), פרויקט טכנולוגיית הבריאות המחוזית פוג'יאן (מענק מספר 2018-1-69), קרן סטארט-אפ למחקר מדעי, האוניברסיטה הרפואית פוג'יאן (מספר מענק 2017XQ1001), פרויקט מימון סטארט-אפ של כישרונות ברמה גבוהה של האוניברסיטה הרפואית פוג'יאן (מספר מענק XRCZX2017025) ופרויקט מחקר של חינוך מקוון והוראה של סטודנטים לתואר שני ברפואה סינית (מענק מספר B-YXC20200202-06).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200056
1 ml Syringe Several commercial brands available Sterile.
1.5 mL Centrifuge tube Axygen MCT-150-C
50 mL Centrifuge Tube Corning 430828
6 cm Petri dish Corning 430166
95% Ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10009164
tubulin rabbit polyclonal antibody Beyotime AF0001 For immunofluorescence assays. Use at 1:100.
rabbit anti-Histone H3 (phospho S10) monoclonal antibody Abcam ab267372 For immunofluorescence assays. Use at 1:100.
rabbit anti-TUBA4A polyclonal antibody Sangon Biotech D110022 For immunofluorescence assays. Use at 1:100.
Anti-SYCP3 rabbit monoclonal antibody Abcam ab175191 For immunofluorescence assays. Use at 1:100.
Adhesion microscope slides CITOTEST 188105
Alexa fluor 488-labeled goat anti-rabbit antibody Beyotime A0423 Sencodary antibody. Use at 1:500.
Aluminium potassium sulphate Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10001060
Anhydrous ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 100092690
Anti-fade mounting medium Beyotime P0131 Prevent photobleching of flourescent signals.
BD FACS Canto II BD Biosciences FACS Canto II
Bovine Serum Albumin Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 69003435
Centrifuge Eppendorf 5424BK745380
Chloral hydrate Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 80037516
Citric acid Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd 122670
Collagenase Sangon Biotech A004194-0100
Coverslips CITOTEST 10212020C 20 × 20 mm. Thickness 0.13-0.16 mm.
DAPI Beyotime C1006
Dye vat Several commercial brands available 91347802
Eosin Y, alcohol soluble Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 71014460
Ether Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10009318
Formaldehyde - aqueous solution Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10010018
GSK923295 MedChemExpress HY-10299
Hematoxylin, anhydrous Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 71020784
ICR mouse Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd
Image J software National Institutes of Health https://imagej.nih.gov/ij/ Fluorescent image analysis.
Leica ultramicrotome Leica
Leica EM UC-7 ultramicrotome Leica EM UC7
Modfit MFLT32 Verity Software House For analysis of flow cytometry results.
Nail polish Several commercial brands available
Neutral gum Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10004160
Nikon Ti-S2 microscope Nikon Ti-S2
Picric acid Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd J60807
Rheodyne Sangon Biotech F519160-0001 10 μl rheodyne
Sliced paraffin Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 69019461
Sodium iodate Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 80117214
Surgical instruments Several commercial brands available For abdominal surgery. Sterilize at 121 °C, 20 min.
Transmission electron microscope FEI Tecnai G2
Trisodium citrate dihydrate Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd 173970
Triton X-100 Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 30188928 Dilute in sterile PBS to make a 0.25% working solution.
Tween 20 Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 30189328 Dilute in sterile PBS to make a 0.1% working solution.
Paraformaldehyde Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 80096618
Xylene Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10023418

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lenormand, T., Engelstädter, J., Johnston, S. E., Wijnker, E., Haag, C. R. Evolutionary mysteries in meiosis. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 371 (1706), 20160001 (2016).
  2. Brandeis, M. New-age ideas about age-old sex: separating meiosis from mating could solve a century-old conundrum. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 93 (2), 801-810 (2018).
  3. Lane, S., Kauppi, L. Meiotic spindle assembly checkpoint and aneuploidy in males versus females. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 76 (6), 1135-1150 (2019).
  4. Handel, M. A., Schimenti, J. C. Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility. Nature Reviews Genetics. 11 (2), 124-136 (2010).
  5. Miller, M. P., Amon, A., Ünal, E. Meiosis I: when chromosomes undergo extreme makeover. Current Opinion in Cell Biology. 25 (6), 687-696 (2013).
  6. Duro, E., Marston, A. L. From equator to pole: splitting chromosomes in mitosis and meiosis. Genes & Development. 29 (2), 109-122 (2015).
  7. Eaker, S., Pyle, A., Cobb, J., Handel, M. A. Evidence for meiotic spindle checkpoint from analysis of spermatocytes from Robertsonian-chromosome heterozygous mice. Journal of Cell Science. 114, Pt 16 2953-2965 (2001).
  8. Faisal, I., Kauppi, L. Reduced MAD2 levels dampen the apoptotic response to non-exchange sex chromosomes and lead to sperm aneuploidy. Development. 144 (11), 1988-1996 (2017).
  9. Bolcun-Filas, E., Handel, M. A. Meiosis: the chromosomal foundation of reproduction. Biology of Reproduction. 99 (1), 112-126 (2018).
  10. Lawrence, C. J., et al. A standardized kinesin nomenclature. The Journal of Cell Biology. 167 (1), 19-22 (2004).
  11. Cross, R. A., McAinsh, A. Prime movers: the mechanochemistry of mitotic kinesins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 257-271 (2014).
  12. Camlin, N. J., McLaughlin, E. A., Holt, J. E. Motoring through: the role of kinesin superfamily proteins in female meiosis. Human Reproduction Update. 23 (4), 409-420 (2017).
  13. Yen, T. J., Li, G., Schaar, B. T., Szilak, I., Cleveland, D. W. CENP-E is a putative kinetochore motor that accumulates just before mitosis. Nature. 359 (6395), 536-539 (1992).
  14. Wood, K. W., Sakowicz, R., Goldstein, L. S., Cleveland, D. W. CENP-E is a plus end-directed kinetochore motor required for metaphase chromosome alignment. Cell. 91 (3), 357-366 (1997).
  15. Abrieu, A., Kahana, J. A., Wood, K. W., Cleveland, D. W. CENP-E as an essential component of the mitotic checkpoint in vitro. Cell. 102 (6), 817-826 (2000).
  16. Mao, Y., Desai, A., Cleveland, D. W. Microtubule capture by CENP-E silences BubR1-dependent mitotic checkpoint signaling. The Journal of Cell Biology. 170 (6), 873-880 (2005).
  17. Gudimchuk, N., et al. Kinetochore kinesin CENP-E is a processive bi-directional tracker of dynamic microtubule tips. Nature Cell Biology. 15 (9), 1079-1088 (2013).
  18. Yu, K. W., Zhong, N., Xiao, Y., She, Z. Y. Mechanisms of kinesin-7 CENP-E in kinetochore-microtubule capture and chromosome alignment during cell division. Biology of the Cell. 111 (6), 143-160 (2019).
  19. She, Z. Y., et al. Kinesin-7 CENP-E regulates chromosome alignment and genome stability of spermatogenic cells. Cell Death Discovery. 6, 25 (2020).
  20. Parra, M. T., et al. Sequential assembly of centromeric proteins in male mouse meiosis. PLoS Genetics. 5 (3), 1000417 (2009).
  21. Parra, M. T., et al. Expression and behaviour of CENP-E at kinetochores during mouse spermatogenesis. Chromosoma. 111 (1), 53-61 (2002).
  22. Duesbery, N. S., et al. CENP-E is an essential kinetochore motor in maturing oocytes and is masked during mos-dependent, cell cycle arrest at metaphase II. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (17), 9165-9170 (1997).
  23. Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).
  24. Parks, J. E., Lee, D. R., Huang, S., Kaproth, M. T. Prospects for spermatogenesis in vitro. Theriogenology. 59 (1), 73-86 (2003).
  25. Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471 (7339), 504-507 (2011).
  26. Staub, C. A century of research on mammalian male germ cell meiotic differentiation in vitro. Journal of Andrology. 22 (6), 911-926 (2001).
  27. Handel, M. A., Caldwell, K. A., Wiltshire, T. Culture of pachytene spermatocytes for analysis of meiosis. Developmental Genetics. 16 (2), 128-139 (1995).
  28. La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis. Methods in Molecular Biology. 558, 279-297 (2009).
  29. Putkey, F. R., et al. Unstable kinetochore-microtubule capture and chromosomal instability following deletion of CENP-E. Developmental Cell. 3 (3), 351-365 (2002).
  30. Wood, K. W., et al. Antitumor activity of an allosteric inhibitor of centromere-associated protein-E. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5839-5844 (2010).
  31. Nam, D., Sershon, R. A., Levine, B. R., Della Valle, C. J. The use of closed incision negative-pressure wound therapy in orthopaedic surgery. Journal of the American Academy Orthopaedic Surgeons. 26 (9), 295-302 (2018).
  32. She, Z. Y., et al. Kinesin-5 Eg5 is essential for spindle assembly and chromosome alignment of mouse spermatocytes. Cell Division. 15, 6 (2020).
  33. She, Z. Y., et al. Kinesin-6 family motor KIF20A regulates central spindle assembly and acrosome biogenesis in mouse spermatogenesis. Biochimica et Biophysica Acta-Molecular Cell Research. 1867 (4), 118636 (2020).
  34. Wellard, S. R., Hopkins, J., Jordan, P. W. A seminiferous tubule squash technique for the cytological analysis of spermatogenesis using the mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56453 (2018).
  35. Sato, M., Ishikawa, A., Kimura, M. Direct injection of foreign DNA into mouse testis as a possible in vivo gene transfer system via epididymal spermatozoa. Molecular Reproduction and Development. 61 (1), 49-56 (2002).
  36. Coward, K., et al. Expression of a fluorescent recombinant form of sperm protein phospholipase C zeta in mouse epididymal sperm by in vivo gene transfer into the testis. Fertility and Sterility. 85, 1281-1289 (2006).
  37. Davis, S., et al. Potent inhibition of microRNA in vivo without degradation. Nucleic Acids Research. 37 (1), 70-77 (2009).
  38. Zhao, H. T., et al. LRRK2 antisense oligonucleotides ameliorate α-Synuclein inclusion formation in a Parkinson's Disease mouse model. Molecular Therapy-Nucleic Acids. 8, 508-519 (2017).
  39. Shahzad, K., et al. CHOP-ASO Ameliorates Glomerular and Tubular Damage on Top of ACE Inhibition in Diabetic Kidney Disease. Journal of the American Society of Nephrology. 3, 2021040431 (2021).
  40. Kang, K., Niu, B., Wu, C., Hua, J., Wu, J. The construction and application of lentiviral overexpression vector of goat miR-204 in testis. Research in Veterinary Science. 130, 52-58 (2020).
  41. Karabasheva, D., Smyth, J. T. Preparation of Drosophila larval and pupal testes for analysis of cell division in live, intact tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60961 (2020).
  42. Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis. Developmental Biology. 169 (2), 557-567 (1995).
  43. Cobb, J., Cargile, B., Handel, M. A. Acquisition of competence to condense metaphase I chromosomes during spermatogenesis. Developmental Biology. 205 (1), 49-64 (1999).
  44. Cobb, J., Reddy, R. K., Park, C., Handel, M. A. Analysis of expression and function of topoisomerase I and II during meiosis in male mice. Molecular Reproduction and Development. 46 (4), 489-498 (1997).
  45. Inselman, A., Handel, M. A. Mitogen-activated protein kinase dynamics during the meiotic G2/MI transition of mouse spermatocytes. Biology of Reproduction. 71 (2), 570-578 (2004).
  46. Muramatsu, T., Shibata, O., Ryoki, S., Ohmori, Y., Okumura, J. Foreign gene expression in the mouse testis by localized in vivo gene transfer. Biochemical and Biophysical Research Communications. 233 (1), 45-49 (1997).
  47. Yamazaki, Y., et al. In vivo gene transfer to mouse spermatogenic cells by deoxyribonucleic acid injection into seminiferous tubules and subsequent electroporation. Biology of Reproduction. 59 (6), 1439-1444 (1998).
  48. Yamazaki, Y., Yagi, T., Ozaki, T., Imoto, K. In vivo gene transfer to mouse spermatogenic cells using green fluorescent protein as a marker. The Journal of Experimental Zoology. 286 (2), 212-218 (2000).
  49. Coward, K., Kubota, H., Parrington, J. In vivo gene transfer into testis and sperm: developments and future application. Archives of Andrology. 53 (4), 187-197 (2007).

Tags

החודש ב- JoVE גיליון 178 קינזין זרעונים מיוזה CENP-E ציר כרומוזום מיקרוטובול
הערכה תפקודית של קינזין-7 CENP-E בזרעונים באמצעות עיכוב <em>Vivo</em> , אימונופלואורסנציה וציטומטריית זרימה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xu, M. F., Yang, Y. H., Wei, Y. L.,… More

Xu, M. F., Yang, Y. H., Wei, Y. L., Zhang, J. L., Lin, X., Lin, X. Y., Chen, H., She, Z. Y. Functional Assessment of Kinesin-7 CENP-E in Spermatocytes Using In Vivo Inhibition, Immunofluorescence and Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (178), e63271, doi:10.3791/63271 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter