Summary
在这里，我们提出了一种基于残余卵碎片现场收集的蝴蝶种群无创遗传采样的简单方案。它可用于确认物种身份和量化遗传变异。该协议可以很容易地适应更广泛的社区科学参与群体。
Abstract
全球昆虫数量下降继续加速。为了增进对许多分类群的了解和解决现有的知识差距，迫切需要有效的基因取样。该协议代表了一种用于种群遗传结构或DNA条形码分析的非破坏性采样稀有蝴蝶的演示方法。它使用孵化的蝴蝶卵的绒毛膜产生足够高的数量和质量的DNA，用于成功的基因测序，以确认物种身份并量化遗传变异。当其他组织取样技术不切实际或不可用时，它可能特别有用。虽然它是为鳞翅目动物开发的，但它可以很容易地适应其他昆虫物种。它经过专门设计，易于使用，旨在帮助具有不同经验和技能水平的个人（如社区科学家、保护从业者和学生）最大限度地广泛实施，并用于大地理区域以促进广泛的人口抽样。生成的数据有助于为生物分类和清单决定、保护和管理行动提供信息，并加强基础生态研究。
Introduction
对稀有、下降和/或列出的昆虫分类群进行有效的种群遗传采样通常对于帮助为保护和管理行动提供信息至关重要。致死或有害组织取样方法通常用于许多遗传分析。然而，这些方法是不可取的或不允许的，因为它们可能对脆弱的现存人群造成伤害或对行为和健康产生负面影响。涉及组织的各种非致死性或非侵入性采样技术，例如整条腿、触角或翅膀剪报、幼虫外露或防御性分泌物和其他产物（如碎屑）的血淋巴，已适用于昆虫遗传研究1，2，3，4，5，6，7，8，9.这些不同组织采样技术的总体可行性和适用性因焦点生物的生物学、生态学、行为、大小和稀有性、情况和收集材料的个体而异。例如，整条腿或附肢剪裁需要临时捕获并小心处理处于适当生命阶段的几个个体，通常由经验丰富的人员进行。同样，组织来源，如幼虫或皱皮，可能只有在生物体被圈养或暂时被关押足够长的时间时才是实用的。
对于在种群一级提出的研究问题，例如关于潜在分类分化或遗传结构的研究问题，往往需要在更广泛的时间或地理尺度（即区域或大陆）进行取样。因此，某些非侵入性组织来源可能完全不切实际，或者至少收集数量效率低下。此外，在这种规模下收集样本在后勤或财政上可能不切实际，或者对个别研究人员甚至较小的实地团队来说都是令人望而却步的。虽然社区科学家的直接参与越来越多地被研究界采用，以帮助解决其中的许多挑战并加速大数据驱动的收集，但对于涉及非破坏性、非侵入性或 eDNA 采样的研究，采用范围有限10，11，12。
为了帮助克服其中一些潜在的局限性，我们证明了来自孵化的蝴蝶卵的绒毛膜可以产生足够高的数量和质量的DNA，用于成功的基因测序，以确认物种身份并量化遗传变异。我们随后使用该技术测试了各种收集协议13。这项试点工作为进一步完善方法奠定了基础。本文详细描述了为社区科学家和其他非专家人员推出的简单而全面的修订版现场收集协议。该协议是对霜冻精灵蝴蝶（Callophrys irus）进行的范围种群结构分析的一部分，以帮助为未来的保护行动提供信息，并根据美国濒危物种法案确定可能列入联邦。虽然可能比一些非侵入性方法更劳动密集，但缺乏必要的生物体接触和易用性使其成为一种潜在的可行模型，可以应用于其他种群遗传研究计划，针对选择常见昆虫和保护关注的昆虫，这些昆虫留下了最近孵化的若虫或幼虫的残余卵碎片。这里介绍的协议语言是专门为Lycaenidae家族的蝴蝶开发的，供非专家使用，这里定义为社区科学家或其他昆虫学经验有限的个人（例如，机构生物学家，实习生）。
Protocol
1. 向社区科学家分发用品
- 通过查阅完整的 材料表，仔细查看并收集所需的与收藏相关的用品的完整清单。
- 如果样本采集将在多个地点和/或由多个个人/团队进行，请将所需的所有物资收集并组织到单独的可部署单位中（图1 和 图2）。
- 向社区科学家或其他负责实地收集的人员运送物资（可部署单位）。
- 如果人员不是本地人，请小心地将用品（每个可部署单元）装入单独的纸板运输箱中，并带有完整的运输标签和运输。
注意：此阶段不需要加急运输。
2. 社区科学家馆藏准备
- 收到收集用品（包括收集钩箱）后，请仔细查看层压供应清单并进行全面清点。如果缺少任何用品，请通知项目负责人。
- 用 180 μL 裂解缓冲液预填充 1.5 mL 微量离心管，在每个微量离心管上贴上带有预印唯一 ID 标签的标签，并将所有试管放入 64 孔微量离心管储存盒中。装入后牢固盖紧盖子。
注意：如果没有标签打印机，请使用防乙醇标记在每个小瓶的侧面和盖子上应用唯一的ID号。 - 确保所有数字设备（例如智能手机或相机）都已充满电，并已包装所有备用电池。
- 在小型冷却器中部分装满冰块，用于现场储存和收集样品的本地运输。
- 将所有收集用品装入收集钩箱或类似坚固、防风雨的容器中，以便安全运输和合并存储。
- 在进入现场之前，请详细查看无损遗传样本收集方案。
注意：使用层压和压缩的图示方案在现场获得其他指导（补充图S1 和 补充图S2）。
3. 现场样品采集
- 到达现场后，使用铅笔或全天候笔在防风雨现场笔记本中记录一天中的时间、日期、整体财产名称（例如，阿巴拉契科拉国家森林）、特定的现场位置名称或描述和 GPS 读数（如果有），以及所有在场人员的全名和角色。
- 找到一个合适的栖息地，存在目标蝴蝶特有的幼虫宿主植物物种。
注意：要小心避免或尽量减少对敏感栖息地、植物种群和野生动物的影响。此外，在访问站点和样本收集事件之前，请务必获得所有适当的土地所有者权限和/或许可。 - 使用智能手机或相机拍摄所有现场、样品采集位置、寄主植物以及可能与项目相关的任何其他信息的详细照片。使用智能手机或其他记录GPS坐标的相机。
注意：所有智能手机都需要启用照片地理标记。 - 全面搜索所有幼虫寄主植物部分，如叶子、花蕾、花朵或发育中的果实，已知是通过产卵（产卵）成年雌蝶选择孵化卵的。对于大多数Lycaenidae，寻找白色的孵化卵，中心有一个明显的孔，类似于甜甜圈，新生幼虫从中出现（图3）。寻找颜色较深的未孵化卵，通常是绿色或蓝色，并且将完全完好无损，中间没有孔（图4）。使用手持镜头或其他放大设备仔细检查每个鸡蛋。
- 找到孵化的鸡蛋后，将丁腈手套戴在双手上。
- 使用干净、无菌、尖锐的镊子，抓住并轻轻地将孵化的鸡蛋从寄主植物上拉出，并将其直接放入预先填充有从 64 孔储存盒中提取的裂解缓冲液的标记微量离心管中。
注意：一些寄主植物残留材料（直径小于15毫米）在收集过程中是可以接受和正常的。 - 每个寄主植物斑块/地点至少收集5个样本（每个样本包含1-20个孵化卵），目标是在一个位置总共>50个卵（如果有的话）。
注意：这将有助于确保在每个样品植物/贴片中至少收集一些组织，并增加检测DNA的机会（个人观察）。 - 每次收集鸡蛋后，仔细清洁镊子尖端，将它们浸入 95% 乙醇的小瓶中，或从挤压瓶中浸入 95% 乙醇或使用酒精湿巾。
注意：这将有助于最大限度地减少采样事件之间的组织残留。 - 如果有条件，将来自同一宿主斑块中多个植物的几个孵化卵（1-20 个卵）收集到单个微量离心管中并牢固地盖上盖子。对于使用较大草本或木本寄主物种的蝴蝶物种，如果宿主斑块有限，则从同一植物的不同位置收集多个卵。
注意：如果植物的叶子相互接触，则植物位于同一宿主补丁中。如果植物或斑块之间存在明显的物理分离，则应将其视为不同的样本。如果收集另一种组织类型，例如幼虫外露或单条腿，请仅将一条腿、腿碎片或幼虫外分泌物放入微量离心管中（每人一个样本）。 - 确保所有收集的材料完全浸没在每个 1.5 mL 微量离心管内的裂解缓冲液中。如果需要，在坚硬的表面上敲击有问题的试管底部以重新浸没任何样品。
- 用干净的一次性实验室湿巾擦拭镊子晾干。
注意：仔细清洁镊子对于避免样品之间的交叉污染至关重要。 - 收集新样品时，丢弃用过的丁腈手套，并用干净的手套替换它们。
- 在防风雨的野外笔记本中，使用铅笔或全天候笔记录从微量离心管分配的唯一 ID 标签以及样品类型（例如，卵、幼虫外露或腿）、孵化卵的大致数量以及收集信息，例如收集器名称、日期、位置、寄主植物物种和任何其他注释（图 2）。
- 将装有蛋渣样品的封闭微量离心管放回64孔微量离心机储存盒中。
- 在现场时，将 64 孔微量离心机储存盒保持在带冰的冷却器中。
- 在现场时，将所有其他收集用品保存在收集钩箱中，以便在站点之间安全、统一地存储和运输。
4. 字段收集完成时
- 确保所有含有样品的微量离心管都放在装有冰的冷却器的 64 孔微量离心机储存盒中，以便运输。
- 将所有现场收集用品放回收集铲斗箱中。
- 将所有样品运回办公室或实验室，并仔细仔细检查每个微量离心管，以确保所有样品材料完全浸没在裂解缓冲液中。
- 将装有样品的64孔微量离心机储存盒放入冰箱中，直到装运或处理。
注意：-18°C的平均商用冰箱可以接受短期储存。 - 仔细评估收集工具箱中的所有耗材，并根据需要更换任何耗材。
注意：如果计划了多个字段收集事件，这一点尤其重要。 - 将收集处理箱存放在安全的位置，直到下一次现场收集事件。
- 下载所有数字映像，并确保所有数字映像都安全地备份在服务器或基于云的存储系统上。
- 扫描或拍摄包含采集数据的原始防风雨、现场笔记本页面或现场数据表，直到所有信息都可以输入到项目电子表格或数据库中。
5. 提交样本和数据
- 从冰箱中取出所有装有样品的64孔微量离心机储存盒。
- 将装有样品和现场笔记本或现场数据表的 64 孔微量离心机储存盒小心地包装在标准运输箱中，将提供的运输标签附上原始发件人的帐号，并通过快递公司保证隔夜次日交付给项目总监。
- 通过电子邮件将包裹跟踪号和扫描的笔记本页面或现场数据表的副本发送给项目主管。
6. 脱氧核糖核酸提取
- 收到64孔微量离心机储存盒后，将其储存在-20°C以保存样品中的DNA，直到准备好进行DNA提取。
- 在实验室中，通过研磨从-20°C解冻后储存在裂解缓冲液中的昆虫组织来提取DNA。 加入20μL蛋白酶K，让样品在56°C下在加热的培养箱中浸泡不超过24小时。
- 根据特定制造商的建议添加适当的清洁和洗涤缓冲液13。
- 将悬浮在缓冲液中的样品转移到连接到 2 mL 收集瓶的离心柱中。
- 使用离心机以 6，021 × g 旋转 60 秒。加入适当的洗涤缓冲液并适当地向下旋转。
- 使用游脱缓冲液 （30 μL） 释放结合的 DNA，并将样品离心到新鲜的 1.5 mL 微量离心管中。储存在-20°C。
注意：如果DNA浓度超过0.010 ng / mL，请继续测序。按组织类型划分的DNA浓度见 图5 。
7. DNA序列的数据分析
- 在生成的序列中修剪或编辑低质量的基本调用。
- 根据公共数据库查询序列以确认物种识别。
- 将序列相互对齐，以比较个体之间的差异。
Representative Results
收集多达563个样本的材料被发送给来自北美东部物种分布范围九个州的八名保护和社区科学家。材料在 2021 年当地飞行高峰期之前发送了三个多月。迄今为止，我们共收到了160个C . irus 组织样本（表1）。基因组DNA按照Storer等人详述的该样品类型的协议提取14。在这160个样品中，从88个样品中成功提取DNA，平均浓度为1.67 ng/μL（SE ± 2.98），最高DNA产量为26.8 ng/μL。根据制造商的说明，使用高灵敏度检测试剂盒和 2 μL 提取物对浓度进行定量。
虽然收到的样本总数大大低于用于收集的材料总数，但这主要是向主要收集者或团队负责人提供过多收集材料的人工制品，使他们能够有最大的灵活性，如果需要，包括多个收集地点和/或社区科学家参与。此外， C. iris 是一种罕见且不断下降的分类单元，其代表是在其现存范围内有限且通常相对较小的种群。尽管存在这种限制，但收到的组织样本总数是可观的，特别是与更传统的个体成年蝴蝶取样相比。
图1：等待运往社区科学家或负责实地收集的其他人员的所有必要用品的单独可部署单位。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：单个可部署单元，包括所有用品、透明塑料收集钩箱和完整的快递标签，等待运送给社区科学家或其他负责现场收集的人员。 请点击此处查看此图的大图。
图3：野生羽扇豆（羽扇豆）上孵化的磨砂精灵蝴蝶（Callophrys irus）卵的照片，显示新生幼虫从该中心出现的明显孔。 请注意，孵化蛋的整体颜色是白色的。请点击此处查看此图的大图。
图4：野生羽扇豆（羽扇豆）上未孵化孵化的磨砂精灵蝴蝶（Callophrys irus）卵的照片。 请注意，未孵化的卵没有明显的中央孔，它们的整体颜色是蓝绿色。请点击此处查看此图的大图。
图5：按组织类型划分的DNA浓度。 箱体中线表示中位数，每个方框延伸 IQR，箱须为 1.5 × IQR，外部的任何点都是异常值。含有单个卵箱的样本只有一个卵箱，而含有多个卵箱的样本至少有两个个案，每个样本的个案数目从2到20个（平均= 5.3）不等。缩写：IQR = 四分位距。 请点击此处查看此图的大图。
| 州 | 蛋盒 | 蛋盒 | 弗拉斯 | 腿 | 蜕皮 | 合计 |
| 阿肯色州 | 2 | 2 | ||||
| 佛罗里达州 | 3 | 10 | 7 | 22 | 42 | |
| 密歇根州 | ||||||
| 新罕布什尔州 | 24 | 6 | 15 | 45 | ||
| 纽约 | 30 | 30 | ||||
| 俄亥俄州 | ||||||
| 威斯康星州 | 9 | 5 | 5 | 19 | ||
| 俄克拉何马州 | 16 | 6 | 22 | |||
| 合计 | 36 | 21 | 16 | 65 | 22 | 160 |
表1：各州收集的组织材料的数量和类型。
补充图S1：用于现场的双面、层压、浓缩和插图协议的首页。请点击此处下载此文件。
补充图S2。用于现场的双面、层压、浓缩、插图协议的背面。请点击此处下载此文件。
Discussion
该协议描述了一种用于非破坏性采样稀有蝴蝶以进行种群遗传结构或DNA条形码分析的现场方法。该协议的总体好处是专门设计的，以帮助具有不同经验和技能水平的个人（如社区科学家，保护从业者和学生）最大限度地广泛实施。其中包括相对较低的总体成本，易于获得的用品和设备，一种简单易近人的方法，无需许多过于复杂的步骤，以及易于在广泛的地理区域部署。它还针对残留的有机物质，消除了暂时捕获或操纵的需要，并且在此过程中，可能会伤害生物体以获取遗传样本。此外，它将可用于样本采集的潜在期限延长到特定生命阶段的传统物候或寿命之外，增强了灵活性和整体收集机会，以帮助最大化样本数量。
虽然这项工作的重点分类单元是霜精灵蝴蝶，一种广泛但不断下降的栖息地专家，但该协议可以更广泛地应用于许多其他昆虫，包括那些受到保护关注的昆虫。同样，虽然该协议的目标是收集孵化的卵作为遗传物质的来源，但它可以很容易地适应其他可能更传统的样本（例如，腿，翅膀碎片，触角夹）甚至整个生物体。然而，这方面也是协议的潜在限制。尽管绝大多数步骤的设计相对简单且快速完成，但全面搜索幼虫寄主植物斑块以寻找孵化卵，这些卵的直径通常为<1.0毫米，是时间和劳动密集型的。尽管如此，这种广泛的抽样活动对于社区科学家等更大的参与者网络来说特别理想。
同其他外地项目一样，认真准备工作至关重要。这包括对所需物资进行全面清点，以确保没有物品丢失，任何必要的准备工作已经完成，并且它们组织良好，包装安全，随时可以进行现场部署。此外，所有现场人员，特别是进行组织采集的人员，应在任何收集活动之前详细审查收集协议，并向监督该项目的个人提出任何问题。一旦进入现场，协议的样本收集部分需要一丝不苟地关注细节。这包括定位并仔细检查任何卵泡，以确保它们已孵化并因此适合收集，彻底清洁镊子，更换手套以帮助减少采样事件之间的组织残留，并确保组织样品完全浸没在每个 1.5 mL 微量离心管内的裂解缓冲液中。最后，记录准确和详细的数据至关重要，其中包括将从微量离心管分配的唯一ID标签与采集的特定样品和所有其他相关的收集信息相关联。虽然这一步在科学研究中是常规的，但对于社区科学观众来说，它通常需要彻底澄清和加强。
在这里，我们展示了社区科学家从小型，稀有和受威胁物种中收集非致命样本的潜力。但是，在分析任何生成的遗传数据时，需要牢记一些潜在的局限性。例如，虽然从单个贴片中汇集样本会增加回收足够DNA进行检测的机会，但它也可能引入杂合性。此外，由于该协议涉及从孵化的卵中收集绒毛膜，因此只能在种群中对代表亲本DNA的雌性蝴蝶进行采样。尽管如此，由于没有针对 C. irus的先前种群水平的遗传数据，因此获得的见解只能有益于物种保护和管理。例如，虽然需要彻底、详细的研究设计和仔细的标记物选择来充分评估种群结构，但此处概述的采样方案和细胞色素 c 氧化酶亚基 1 （CO1） DNA 条形码的使用可用于检测稀有或危险分类群的发生。Storer et 详细介绍了此处描述的非致命采样 DNA 测序的效用和应用的其他讨论。第14章。
除了收集样本进行遗传分析的主要目标外，该协议还强调参与者对所有野外地点、收集地点、存在的幼虫寄主植物以及周围栖息地可能相关的任何其他元素进行详细的数码照片。此类文档有助于提供一般栖息地评估，有助于说明现有的场地条件，例如植物物候、宿主资源密度和管理历史（例如，最近规定的火灾）。这种信息对于在较宽的时间范围内采集实地样本以便进行更详细的环境比较的项目特别有用。
最后，随着全球昆虫数量继续加速，迫切需要扩大物种评估和监测工作15，16。社区科学家、学生（例如，美国鱼类和野生动物管理局的实习生和研究员）以及保护从业人员更广泛地参与参与，为包括DNA样本在内的多种类型的广泛数据收集提供了越来越可行的选择。因此，从该协议生成的数据具有许多可能的用途。其中包括帮助为保护行动提供信息（例如，规划、恢复和管理）、上市决定或物种状况评估以及生态、种群和分类学研究。
Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
作者希望感谢David Cuthrell，Amanda Dillon，Steve Fuller，Neil Gifford，Heidi Holman，Dean Jue，Sally Jue，Daniel Kennedy，Genevieve Kozak，Rebecca Longenecker，Maureen McClung，Matt Moran，Robin Niver，Brenda Smith，Hunter Trowbridge和Jessup Weichelt在项目的各个方面提供帮助，包括后勤，协调，许可和/或样本收集。这项研究由野生动物管理研究所管理的美国鱼类和野生动物管理局（联邦奖项识别号F20AC00356）资助（赠款SA 2021-01）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 quart Igloo Playmate Cooler | Amazon | NA | portable cooler Amount per deployable unit: 1 cooler |
| 250 DNeasy Mini Spin Columns, Proteinase K, Buffers, Collection Tubes (2 mL) | Qiagen | 69506 | Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit Amount per deployable unit: NA |
| Andwin Scientific Supplier Diversity Partner LAB MARKERS BLACK | FisherSci | NC9280166 | ethanol proof lab marker Amount per deployable unit: 2 markers |
| Cardboard shipping box | shipping box Amount per deployable unit: as needed |
||
| Eisco Polyethylene Wash Bottles, LDPE | FisherSci | S14091 | lab grade spray or squirt bottle (for ethanol or alcohol) Amount per deployable unit: 1 bottle |
| FedEx U.S. express airbill | FedEx | NA | shipping return label Amount per deployable unit: 2 labels |
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | FisherSci | NC9386261 | sterile 1.5 mL microcentrifuge tubes Amount per deployable unit: 128 tubes |
| Forceps, #4a, very fine yet extra strong tips (33 mm), 4-3/8" (111 mm) long | Bioquip | 4523 | straight tip forceps Amount per deployable unit: 2 straight forceps |
| Forceps, #7, curved tips (13 mm), very fine points, 4-1/2" (114 mm) long | Bioquip | 4527 | curved tip forceps Amount per deployable unit: 2 curved forceps |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply | FisherSci | 06-666A | kimwipes (or other sterile wipe) Amount per deployable unit: 1 box |
| Laminated Illustrated field collection protocol | NA | NA | abbreviated protocol Amount per deployable unit: 1 protocol |
| Laminated list of materials | NA | NA | supply list Amount per deployable unit: 1 list |
| Lily Sugar 'N Cream The Original Solid Yarn, 2.5 oz, Medium 4 Gauge, 100% Cotton - Hot Pink - Machine Wash & Dry | Amazon | NA | pink yarn (to secure to forceps for visibility) Amount per deployable unit: 2 yards |
| Loupe by Bausch & Lomb, 10x Coddington Magnifier | Amazon | NA | hand lens Amount per deployable unit: 2 hand lenses |
| MyGift Clear Plastic 2-Tier Trays Craft Supply Storage Box/First Aid Carrying Case w/Top Handle & Latch Lock | Amazon | NA | supply storage box Amount per deployable unit: 1 box |
| Nitrile, Disposable Gloves, L, Powder-Free, 2.8 mil Palm Thickness | Grainger | 60NU14 | nitrile lab gloves (large) Amount per deployable unit: 1 box |
| Nitrile, Disposable Gloves, M, Powder-Free, 2.8 mil Palm Thickness | Grainger | 60NU13 | nitrile lab gloves (medium) Amount per deployable unit: 1 box |
| Qiagen, Inc. BUFFER ATL (200 ML) | Qiagen | 19076 | Qiagen ATL lysis buffer Amount per deployable unit: 180 µl/tube; 128 tubes |
| Rite In The Rain Weatherproof Side Spiral Notebook, Yellow Cover, Universal Page Pattern (No. 373-MX), 11 x 8.75 x 0.5 | Amazon | NA | weatherproof field notebook Amount per deployable unit: 1 notebook |
| Showgard Professional Stamp Tongs 6" 904 Round Tip Tweezers | Amazon | NA | 6" spade tip forceps Amount per deployable unit: 2 long spade forceps |
| Texwipe PolySat Pre-Wetted Wipers | FisherSci | 18-366-231 | alcohol wipes Amount per deployable unit: 100 wipes |
| Thermo Scientific CryoBoxes | FisherSci | 12-565-227 | 64 well microcentrifuge tubes collection/storage boxes Amount per deployable unit: 2 boxes |
| packing material Amount per deployable unit: as needed |
References
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