Summary
Här presenterar vi ett enkelt protokoll för icke-invasiv genetisk provtagning av fjärilspopulationer baserat på fältinsamling av kvarvarande äggskräp. Den kan användas för att bekräfta artens identitet och kvantifiera genetisk variation. Detta protokoll kan enkelt anpassas till bredare grupper för samhällsvetenskapligt engagemang.
Abstract
De globala insektsminskningarna fortsätter att accelerera. Effektiv genetisk provtagning behövs kritiskt för att öka förståelsen för många taxa och ta itu med befintliga kunskapsluckor. Detta protokoll representerar en demonstrerad metod för icke-förstörande provtagning av sällsynta fjärilar för populationsgenetisk struktur eller DNA-streckkodningsanalyser. Den använder korionen av kläckta fjärilsägg för att ge tillräckligt hög kvantitet och kvalitets-DNA för framgångsrik gensekvensering för att bekräfta artens identitet och kvantifiera genetisk variation. Det kan vara särskilt användbart när andra vävnadsprovtagningstekniker är opraktiska eller otillgängliga. Även om den är utvecklad för en lepidopteran, kan den ändå lätt anpassas för användning med andra insektsarter. Det var speciellt utformat med användarvänlighet som ett mål att hjälpa till att maximera bred implementering av individer med varierande erfarenhet och färdighetsnivåer, såsom samhällsforskare, bevarandeutövare och studenter, och för användning över stora geografiska områden för att underlätta bred befolkningsprovtagning. De data som genereras kan bidra till att informera taxonomiska och listningsbeslut, bevarande- och förvaltningsåtgärder och förbättra grundläggande ekologisk forskning.
Introduction
Effektiv populationsgenetisk provtagning av sällsynta, minskande och/eller listade insektstaxa är ofta avgörande för att bidra till bevarande- och förvaltningsåtgärder. Dödliga eller skadliga vävnadsprovtagningsmetoder används rutinmässigt för många genetiska analyser. Dessa metoder är dock oönskade eller inte tillåtna eftersom de kan orsaka skada på sårbara befintliga populationer eller negativt påverka beteende och kondition. Olika nonlethal eller icke-invasiva provtagningstekniker som involverar vävnad som hela ben, antenn- eller vingklipp, larvexuviae eller hemolymf från defensiva sekret och andra produkter, såsom frass, har varit lämpliga för insektsgenetisk forskning 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Den övergripande genomförbarheten och tillämpligheten av dessa olika vävnadsprovtagningstekniker varierar avsevärt beroende på biologi, ekologi, beteende, storlek och sällsynthet hos fokalorganismen, situationen och individerna som samlar in materialet. Till exempel kräver hela ben eller bihangklipp tillfällig fångst och noggrann hantering av flera individer i ett lämpligt livsstadium, vanligtvis av erfaren personal. På samma sätt är vävnadskällor, såsom larvexuviae eller frass, sannolikt endast praktiska om organismerna är i fångenskap eller tillfälligt hålls i en tillräcklig period.
För forskningsfrågor som ställs på populationsnivå, t.ex. sådana som rör potentiell taxonomisk differentiering eller genetisk struktur, krävs ofta provtagning på en bredare tidsmässig eller geografisk skala (dvs. regional eller kontinental). Som ett resultat kan vissa icke-invasiva vävnadskällor vara helt opraktiska eller åtminstone ineffektiva att samla in i kvantitet. Provtagning i sådana skalor kan dessutom vara logistiskt eller ekonomiskt opraktiskt eller oöverkomligt för enskilda forskare eller till och med mindre fältteam att genomföra. Medan det direkta engagemanget från samhällsforskare i allt högre grad har antagits av forskarsamhället för att hjälpa till att ta itu med många av dessa utmaningar och påskynda stordatadriven insamling, har antagandet varit begränsat för studier som involverar icke-förstörande, icke-invasiv eller eDNA-provtagning10,11,12.
För att hjälpa till att övervinna några av dessa potentiella begränsningar visade vi att korionen från kläckta fjärilsägg kan ge tillräckligt hög kvantitet och kvalitets-DNA för framgångsrik gensekvensering för att bekräfta artens identitet och kvantifiera genetisk variation. Vi testade därefter olika insamlingsprotokoll med denna teknik13. Detta pilotarbete fungerade som grund för ytterligare metodisk förfining. Detta dokument beskriver i detalj det resulterande enkla men ändå omfattande reviderade fältinsamlingsprotokollet som rullades ut för samhällsforskare och annan icke-expertpersonal. Detta protokoll är en del av en områdesomfattande populationsstrukturanalys av den frostat elfenbensfjärilen (Callophrys irus) för att hjälpa till att informera framtida bevarandeåtgärder och en federal bestämning av eventuellt listning enligt U.S. Endangered Species Act. Även om det potentiellt är mer arbetskrävande än vissa icke-invasiva metoder, gör bristen på nödvändig organismkontakt och användarvänlighet det till en potentiellt livskraftig modell som kan tillämpas på andra populationsgenetiska forskningsprogram som riktar sig till ett urval av både vanliga insekter och de av bevarandeproblem, som lämnar kvarvarande äggskräp efter sig från nyligen kläckta nymfer eller larver. Protokollspråket som presenteras här utvecklades specifikt för fjärilar i familjen Lycaenidae och för användning av icke-experter som här definieras som samhällsforskare eller andra individer (t.ex. byråbiologer, praktikanter) med begränsad entomologisk erfarenhet.
Protocol
1. Spridning av förnödenheter till samhällsforskare
- Granska noggrant och samla in hela listan över samlingsrelaterade förnödenheter som behövs genom att konsultera hela materialförteckningen.
- Om provtagning kommer att ske på flera platser och/eller av flera individer/team, samla in och organisera alla förnödenheter som behövs i separata utplaceringsbara enheter (figur 1 och figur 2).
- Transportförnödenheter (utplaceringsbara enheter) till samhällsforskare eller annan personal som ansvarar för fältinsamling.
- Om personalen inte är lokal, packa försiktigt förnödenheter (varje utplaceringsbar enhet) i en separat kartong med en komplett fraktetikett och fartyg.
OBS: Snabb leverans krävs inte i detta skede.
2. Förberedelse av insamling av samhällsvetare
- Vid mottagandet av insamlingsmaterial, inklusive insamlingslådan, granska noggrant den laminerade leveranslistan och gör en fullständig inventering. Meddela projektledaren om några förnödenheter saknas.
- Förfyll 1,5 ml mikrocentrifugrör med 180 μl lysbuffert, applicera etiketter med en förtryckt unik ID-etikett på varje mikrocentrifugrör och placera alla rör i 64-brunns mikrocentrifugrörsförvaringslådan. Säkra locket ordentligt efter lastning.
OBS: Om etikettskrivare inte är tillgängliga, använd unika ID-nummer på sidan och locket på varje injektionsflaska med en etanolsäker markör. - Se till att all digital utrustning (t.ex. smartphone eller kamera) är fulladdad och att eventuella reservbatterier är packade.
- Fyll delvis en liten kylare med is för fältlagring och lokal transport av de insamlade proverna.
- Packa alla insamlingsmaterial i insamlingslådan eller liknande robust, väderbeständig behållare för säker transport och konsoliderad lagring.
- Granska det icke-förstörande genetiska provsamlingsprotokollet i detalj innan du går in i fältet.
OBS: Använd det laminerade och kondenserade, illustrerade protokollet för ytterligare vägledning i fältet (kompletterande figur S1 och kompletterande figur S2).
3. Provinsamling i fält
- När du anländer till fältplatsen, använd en penna eller allväderspenna för att i den väderbeständiga fältanteckningsboken registrera tid på dagen, datum, övergripande fastighetsnamn (t.ex. Apalachicola National Forest), specifikt fältplatsnamn eller beskrivning och GPS-avläsning om tillgängligt, och fullständigt namn och roller för alla närvarande personer.
- Lokalisera en lämplig livsmiljö med närvaro av larvvärdväxtarter som är specifika för målfjärilen.
OBS: Var försiktig för att undvika eller minimera påverkan på känsliga livsmiljöer, växtpopulationer och vilda djur. Se också till att säkra alla lämpliga markägarbehörigheter och/eller tillstånd innan du öppnar en webbplats och provinsamlingshändelser. - Använd en smartphone eller kamera för att ta detaljerade fotografier av alla fältplatser, provtagningsplatser, värdväxter och all annan information som kan vara relevant för projektet. Använd smartphones eller andra kameror som spelar in GPS-koordinater.
OBS: Photo Geotagging måste vara aktiverat på alla smartphones. - Sök omfattande alla larvvärdväxtdelar, såsom löv, blomknoppar, blommor eller utvecklande frukt, som är kända för att väljas genom ovipositing (äggläggning) vuxna kvinnliga fjärilar för kläckta ägg. För de flesta Lycaenidae, leta efter vita, kläckta ägg med ett distinkt hål i mitten som liknar en munk från vilken den nyfödda larven uppstod (figur 3). Leta efter oskadade ägg som är något mörkare i färgen, ofta gröna eller blåaktiga, och kommer att vara helt intakta utan ett hål i mitten (figur 4). Använd en handlins eller annan förstoringsenhet för att inspektera varje ägg noggrant.
- När ett kläckt ägg har hittats, sätt nitrilhandskar på båda händerna.
- Använd rena, sterila, spetsiga pincett, ta tag i och dra försiktigt det kläckta ägget från värdväxten och placera det direkt i ett märkt mikrocentrifugrör förfyllt med lysbuffert som tagits från förvaringslådan med 64 brunnar.
OBS: En del värdväxtöverföringsmaterial (mindre än 15 mm i diameter) är acceptabelt och normalt under insamlingen. - Samla in minst 5 prover per värdväxtplåster/plats (var och en innehåller 1-20 kläckta ägg), med sikte på >50 ägg totalt på en plats om sådan finns.
OBS: Detta kommer att bidra till att säkerställa att åtminstone viss vävnad samlas in vid varje provväxt / plåster och öka chanserna att upptäcka DNA (personlig observation). - Efter varje ägguppsamling, rengör försiktigt pincettspetsarna genom att doppa dem i en injektionsflaska med 95% etanol eller genom att dousing med 95% etanol från en pressflaska eller genom att använda alkoholservetter.
OBS: Detta hjälper till att minimera vävnadsöverföring mellan provtagningshändelser. - Om tillgängligt, samla flera kläckta ägg (1-20 ägg) från flera växter i samma värdplåster i ett enda mikrocentrifugrör och stäng locket ordentligt. För fjärilsarter som använder större örtartade eller träiga värdarter, samla flera ägg från olika platser på samma växt om värdlapparna är begränsade.
OBS: Växter är i samma värdlapp om deras löv rör vid varandra. Om det finns en märkbar fysisk separation mellan växter eller fläckar, bör detta betraktas som ett annat prov. Om du samlar en annan vävnadstyp, såsom larvexuviae eller ett enda ben, placera endast ett enda ben, benfragment eller larvexuvia i ett mikrocentrifugrör (ett prov per individ). - Se till att allt uppsamlat material är helt nedsänkt i lysbufferten i varje 1,5 ml mikrocentrifugrör. Knacka på botten av röret i fråga på en hård yta för att sänka ner eventuella prover om det behövs.
- Torka av tången för att torka med en ren engångsservett.
OBS: Noggrann rengöring av pincett är viktigt för att undvika korskontaminering mellan proverna. - När du samlar in ett nytt prov, kassera använda nitrilhandskar och byt ut dem med ett rent par.
- I en väderbeständig fältanteckningsbok använder du en penna eller allväderspenna för att registrera den unika ID-etiketten som tilldelats från mikrocentrifugröret tillsammans med typen av prov (t.ex. ägg, larvexuviae eller ben), det ungefärliga antalet kläckta ägg och insamlingsinformation som samlarnamn, datum, plats, värdväxtarter och eventuella ytterligare anteckningar (figur 2).
- Placera det slutna mikrocentrifugröret med äggskräpprovet tillbaka i 64-brunns mikrocentrifugförvaringslådan.
- Håll 64-brunns mikrocentrifugförvaringslådan i en kylare med is medan du är i fältet.
- Behåll alla andra insamlingsmaterial i insamlingsboxen medan du är i fältet för säker och konsoliderad lagring och transport mellan platser.
4. När fältinsamlingen är klar
- Se till att alla mikrocentrifugrör som innehåller prover finns i 64-brunns mikrocentrifugförvaringslådan i en kylare med is för transport.
- Placera tillbaka alla fältinsamlingsmaterial i insamlingslådan.
- Transportera alla prover tillbaka till kontoret eller laboratoriet och dubbelkolla noggrant varje mikrocentrifugrör för att säkerställa att allt provmaterial är helt nedsänkt i lysbuffert.
- Placera 64-brunns mikrocentrifugförvaringslådan med prover i en frys tills leverans eller bearbetning.
OBS: En genomsnittlig kommersiell frys på -18 °C är acceptabel för kortvarig lagring. - Bedöm noggrant alla förnödenheter i insamlingsverktygslådan och byt ut eventuella efter behov.
Detta är särskilt viktigt om flera fältsamlingshändelser schemaläggs. - Förvara insamlingsboxen på en säker plats fram till nästa fältinsamlingshändelse.
- Ladda ner alla digitala bilder och se till att alla säkerhetskopieras säkert på en server eller ett molnbaserat lagringssystem.
- Skanna eller fotografera de ursprungliga väderbeständiga sidorna, fältanteckningsbokssidorna eller fältdatabladen som innehåller insamlingsdata tills all information kan matas in i ett projektkalkylblad eller en databas.
5. Inlämning av prover och data
- Ta bort alla 64-brunns mikrocentrifugförvaringslådor med prover från frysen.
- Förpacka försiktigt 64-brunns mikrocentrifugförvaringslådorna med prover och fältanteckningsboken eller fältdatabladen i en standardfraktlåda, fäst den medföljande fraktetiketten med den ursprungliga avsändarens kontonummer och skicka via expresstransportörgaranterad leverans över natten till nästa dag till projektledaren.
- Skicka paketets spårningsnummer och en kopia av de skannade anteckningsbokssidorna eller fältdatabladen via e-post till projektledaren.
6. DNA-extraktion
- När förvaringslådorna med 64 brunnar för mikrocentrifug har tagits emot, förvara dem vid -20 °C för bevarande av DNA i prover tills de är klara för DNA-extraktion.
- I labbet extraherar du DNA genom att slipa insektsvävnad lagrad i lysbuffert efter upptining från -20 °C. Tillsätt 20 μl proteinas K och låt provet dra över natten vid 56 °C i en uppvärmd inkubator i högst 24 timmar.
- Lägg till lämpliga rengörings- och tvättbuffertar, enligt den specifika tillverkarens rekommendation13.
- Överför provet upphängt i buffert till en centrifugeringskolonn som är fäst vid en 2 ml injektionsflaska med uppsamling.
- Snurra ner vid 6 021 × g i 60 s med en centrifug. Tillsätt lämpliga tvättbuffertar och snurra ner på lämpligt sätt.
- Släpp bundet DNA med hjälp av elusionsbuffert (30 μL) och snurra ner provet i ett nytt 1,5 ml mikrocentrifugrör. Förvaras vid -20 °C.
OBS: Fortsätt till sekvensering om DNA-koncentrationen överstiger 0,010 ng / ml. Se figur 5 för DNA-koncentration per vävnadstyp.
7. Dataanalys av DNA-sekvenser
- Trimma eller redigera basanrop av låg kvalitet i resulterande sekvenser.
- Frågesekvenser mot offentliga databaser för bekräftelse av artidentifiering.
- Anpassa sekvenser till varandra för jämförelse av skillnader mellan individer.
Representative Results
Material för insamling av upp till 563 prover skickades till åtta naturvårds- och samhällsforskare från nio stater över artområdet i östra Nordamerika. Material skickades ut under tre månader under 2021 före lokala rusningstider. Hittills har vi fått in totalt 160 C . irus vävnadsprover som har samlats in (tabell 1). Genomiskt DNA extraherades enligt ett protokoll för denna provtyp som beskrivs av Storer et al.14. Av dessa 160 prover extraherades DNA framgångsrikt från 88 med en genomsnittlig koncentration på 1,67 ng/μL (SE ± 2,98), och det högsta DNA-utbytet var 26,8 ng/μL. Koncentrationerna kvantifierades med hjälp av ett högkänsligt analyskit enligt tillverkarens instruktioner med 2 μL extrakt.
Även om det totala antalet mottagna prover är betydligt lägre än det totala antalet material som används för insamling, är detta främst en artefakt för att tillhandahålla ett överflöd av insamlingsmaterial till den primära samlaren eller teamledaren för att göra det möjligt för dem att ha maximal flexibilitet för att inkludera flera insamlingsplatser och / eller samhällsforskare som är involverade om så önskas. Dessutom är C. iris ett sällsynt och minskande taxon som representeras av begränsade och ofta relativt små populationer i hela sitt befintliga utbredningsområde. Trots denna begränsning är det totala antalet mottagna vävnadsprover betydande, särskilt jämfört med vad som kan förväntas med en mer traditionell provtagning av enskilda vuxna fjärilar.
Figur 1: Enskilda utplaceringsbara enheter av alla nödvändiga förnödenheter som väntar på leverans till samhällsforskare eller annan personal som ansvarar för fältinsamling. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Individuell utplaceringsbar enhet inklusive alla förnödenheter, rensa plastinsamlingslåda och ifylld expresstransportöretikett i väntan på leverans till samhällsforskare eller annan personal som ansvarar för fältinsamling. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Foto av kläckt frostat elfinfjäril (Callophrys irus) ägg på vild lupin (Lupinus perennis) som visar ett distinkt hål i mitten från vilket den nyfödda larven uppstod. Observera att den övergripande färgen på det kläckta ägget är vit. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Foto av oskläckt kläckt frostad elfenbensfjäril (Callophrys irus) ägg på vild lupin (Lupinus perennis). Observera att oskadade ägg saknar ett märkbart centralt hål och att deras övergripande färg är blågrön. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: DNA-koncentration efter vävnadstyp. Lådans mittlinjer representerar medianen, varje ruta förlänger IQR och boxmorrhåren är 1,5 × IQR, med alla punkter utanför som outliers. Prover som innehöll ett enda äggfall hade bara ett äggfall, och prover som innehöll flera äggfall hade minst två fall, med antalet fall från 2 till 20 (genomsnitt = 5,3) per prov. Förkortning: IQR = interkvartilintervall. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Stat | Äggfall | Äggfall | Frass | Ben | Molt | Totalt |
| Arkansas | 2 | 2 | ||||
| Florida | 3 | 10 | 7 | 22 | 42 | |
| Michigan | ||||||
| Nya Hampshire | 24 | 6 | 15 | 45 | ||
| New York | 30 | 30 | ||||
| Ohio | ||||||
| Wisconsin | 9 | 5 | 5 | 19 | ||
| Oklahoma | 16 | 6 | 22 | |||
| Totalt | 36 | 21 | 16 | 65 | 22 | 160 |
Tabell 1: Antal och typ av vävnadsmaterial som samlats in per stat.
Kompletterande figur S1: Första sidan av tvåsidiga, laminerade, kondenserade och illustrerade protokoll för användning i fält. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S2. Baksida av dubbelsidigt, laminerat, kondenserat, illustrerat protokoll för användning i fält. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Detta protokoll beskriver en fältmetod för icke-förstörande provtagning av sällsynta fjärilar för populationsgenetisk struktur eller DNA-streckkodningsanalyser. De övergripande fördelarna med detta protokoll är specifikt utformade för att maximera bred implementering av individer med varierande erfarenhet och färdighetsnivåer som samhällsforskare, bevarandeutövare och studenter. Dessa inkluderar relativt låg totalkostnad, lätt att skaffa förnödenheter och utrustning, en enkel och tillgänglig metod utan många alltför komplexa steg och enkel distribution över ett brett geografiskt område. Det riktar sig dessutom mot kvarvarande organiskt material som eliminerar behovet av att tillfälligt fånga eller manipulera, och i processen potentiellt skada levande organismer för att förvärva genetiska prover. Dessutom förlänger det den potentiella perioden som är tillgänglig för provinsamling utöver den traditionella fenologin eller livslängden för ett visst livsstadium, vilket ökar flexibiliteten och den övergripande insamlingsmöjligheten för att maximera provantalet.
Medan det centrala taxonet för denna insats var den frostat alfinnefjärilen, en utbredd men minskande livsmiljöspecialist, kan detta protokoll tillämpas bredare på många andra insekter, inklusive de som är av bevarandeintresse. På samma sätt, medan protokollet är inriktat på insamling av kläckta ägg som källa till genetiskt material, kan det enkelt anpassas till andra, potentiellt mer traditionella prover (t.ex. ben, vingfragment, antennklämmor) eller till och med hela organismer. Denna aspekt är emellertid också en potentiell begränsning av protokollet. Även om de allra flesta stegen är utformade för att vara relativt enkla och snabba att utföra, är det tids- och arbetskrävande att fullständigt söka fläckar av larvvärdväxter efter kläckägg, som individuellt vanligtvis är < 1,0 mm i diameter. Icke desto mindre är en sådan omfattande provtagningsaktivitet särskilt idealisk för ett större nätverk av deltagare som samhällsforskare.
Som med andra fältbaserade projekt är noggranna förberedelser viktiga. Detta inkluderar att genomföra en fullständig inventering av de förnödenheter som behövs för att säkerställa att inga artiklar saknas, att allt nödvändigt förberedelsearbete har slutförts och att de är välorganiserade, säkert förpackade och redo för fältdistribution. Dessutom bör all fältpersonal, särskilt de som utför vävnadsinsamlingen, granska insamlingsprotokollet i detalj före varje insamlingshändelse och ställa frågor till personer som övervakar projektet. Väl i fältet kräver provsamlingsdelen av protokollet noggrann uppmärksamhet på detaljer. Detta inkluderar att lokalisera och noggrant inspektera alla ägg för att säkerställa att de är kläckta och därmed lämpliga för insamling, noggrant rengöra tång, byta ut handskar för att minska vävnadsöverföringen mellan provtagningshändelser och se till att vävnadsprover är helt nedsänkta i lysbuffert inom varje 1,5 ml mikrocentrifugrör. Slutligen är det viktigt att registrera korrekta och detaljerade data, vilket inkluderar att länka den unika ID-etiketten som tilldelats från mikrocentrifugröret tillsammans med det specifika provet som tagits och all annan relevant insamlingsinformation. Även om detta steg är rutin i vetenskaplig forskning, måste det ofta klargöras och förstärkas grundligt för en samhällsvetenskaplig publik.
Här demonstrerar vi potentialen för samhällsforskare för icke-dödlig provinsamling från små, sällsynta och hotade arter. Det finns dock vissa potentiella begränsningar att tänka på när man analyserar eventuella resulterande genetiska data. Till exempel, medan sammanslagning av prover från ett enda plåster ökar chansen att återvinna tillräckligt med DNA för detektion, introducerar det också potentiellt heterozygositet. Dessutom, eftersom protokollet innebär att korionen samlas in från kläckta ovae, kan endast kvinnliga fjärilar, som representerar föräldra-DNA, provtas inom en population. Eftersom det inte fanns några tidigare genetiska data på populationsnivå för C. irus, kan de insikter som erhållits endast gynna artbevarande och förvaltning. Till exempel, medan en grundlig, detaljerad studiedesign och noggrant markörval skulle krävas för att på ett adekvat sätt bedöma befolkningsstrukturen, kan provtagningsprotokollet som beskrivs här och användningen av cytokrom coxidasunderenhet 1 (CO1) DNA-streckkodning användas för att upptäcka förekomsten av sällsynta eller imperiled taxa. Ytterligare diskussion om nyttan och tillämpningen av DNA-sekvensering från nonlethal provtagning som beskrivs här beskrivs av Storer et. al.14.
Utöver det primära målet att samla in prover för genetisk analys betonar protokollet också att deltagarna tar detaljerade digitala fotografier av alla fältplatser, samlingsplatser, larvvärdväxter som finns och alla andra delar av den omgivande livsmiljön som kan vara relevanta. Sådan dokumentation hjälper till att tillhandahålla en allmän livsmiljöbedömning som är användbar för att illustrera befintliga områdesförhållanden som växtfenologi, värdresurstäthet och förvaltningshistorik (t.ex. nyligen föreskriven brand). Sådan information är särskilt användbar för projekt där fältprover tas under en längre tidsperiod för att möjliggöra mer detaljerade miljöjämförelser.
Slutligen, eftersom den globala insektsminskningen fortsätter att accelerera, behövs det kritiskt utökade artbedömningar och övervakningsinsatser15,16. Användningen av mer utbrett deltagande engagemang från samhällsforskare, studenter (t.ex. praktikanter och stipendiater från US Fish and Wildlife Service) och bevarandeutövare erbjuder alltmer livskraftiga alternativ för omfattande datainsamling av många typer, inklusive DNA-prover. Följaktligen har data som genereras från detta protokoll många möjliga användningsområden. Dessa inkluderar att hjälpa till att informera bevarandeåtgärder (t.ex. planering, återhämtning och förvaltning), listningsbeslut eller bedömningar av artstatus och ekologisk, populations- och taxonomisk forskning.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka David Cuthrell, Amanda Dillon, Steve Fuller, Neil Gifford, Heidi Holman, Dean Jue, Sally Jue, Daniel Kennedy, Genevieve Kozak, Rebecca Longenecker, Maureen McClung, Matt Moran, Robin Niver, Brenda Smith, Hunter Trowbridge och Jessup Weichelt för hjälp med olika aspekter av projektet, inklusive logistik, samordning, tillstånd och / eller provinsamling. Denna forskning finansierades genom ett bidrag från U.S. Fish and Wildlife Service (Federal Award Identification Number F20AC00356) som administreras av Wildlife Management Institute (bidrag SA 2021-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 quart Igloo Playmate Cooler | Amazon | NA | portable cooler Amount per deployable unit: 1 cooler |
| 250 DNeasy Mini Spin Columns, Proteinase K, Buffers, Collection Tubes (2 mL) | Qiagen | 69506 | Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit Amount per deployable unit: NA |
| Andwin Scientific Supplier Diversity Partner LAB MARKERS BLACK | FisherSci | NC9280166 | ethanol proof lab marker Amount per deployable unit: 2 markers |
| Cardboard shipping box | shipping box Amount per deployable unit: as needed |
||
| Eisco Polyethylene Wash Bottles, LDPE | FisherSci | S14091 | lab grade spray or squirt bottle (for ethanol or alcohol) Amount per deployable unit: 1 bottle |
| FedEx U.S. express airbill | FedEx | NA | shipping return label Amount per deployable unit: 2 labels |
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | FisherSci | NC9386261 | sterile 1.5 mL microcentrifuge tubes Amount per deployable unit: 128 tubes |
| Forceps, #4a, very fine yet extra strong tips (33 mm), 4-3/8" (111 mm) long | Bioquip | 4523 | straight tip forceps Amount per deployable unit: 2 straight forceps |
| Forceps, #7, curved tips (13 mm), very fine points, 4-1/2" (114 mm) long | Bioquip | 4527 | curved tip forceps Amount per deployable unit: 2 curved forceps |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply | FisherSci | 06-666A | kimwipes (or other sterile wipe) Amount per deployable unit: 1 box |
| Laminated Illustrated field collection protocol | NA | NA | abbreviated protocol Amount per deployable unit: 1 protocol |
| Laminated list of materials | NA | NA | supply list Amount per deployable unit: 1 list |
| Lily Sugar 'N Cream The Original Solid Yarn, 2.5 oz, Medium 4 Gauge, 100% Cotton - Hot Pink - Machine Wash & Dry | Amazon | NA | pink yarn (to secure to forceps for visibility) Amount per deployable unit: 2 yards |
| Loupe by Bausch & Lomb, 10x Coddington Magnifier | Amazon | NA | hand lens Amount per deployable unit: 2 hand lenses |
| MyGift Clear Plastic 2-Tier Trays Craft Supply Storage Box/First Aid Carrying Case w/Top Handle & Latch Lock | Amazon | NA | supply storage box Amount per deployable unit: 1 box |
| Nitrile, Disposable Gloves, L, Powder-Free, 2.8 mil Palm Thickness | Grainger | 60NU14 | nitrile lab gloves (large) Amount per deployable unit: 1 box |
| Nitrile, Disposable Gloves, M, Powder-Free, 2.8 mil Palm Thickness | Grainger | 60NU13 | nitrile lab gloves (medium) Amount per deployable unit: 1 box |
| Qiagen, Inc. BUFFER ATL (200 ML) | Qiagen | 19076 | Qiagen ATL lysis buffer Amount per deployable unit: 180 µl/tube; 128 tubes |
| Rite In The Rain Weatherproof Side Spiral Notebook, Yellow Cover, Universal Page Pattern (No. 373-MX), 11 x 8.75 x 0.5 | Amazon | NA | weatherproof field notebook Amount per deployable unit: 1 notebook |
| Showgard Professional Stamp Tongs 6" 904 Round Tip Tweezers | Amazon | NA | 6" spade tip forceps Amount per deployable unit: 2 long spade forceps |
| Texwipe PolySat Pre-Wetted Wipers | FisherSci | 18-366-231 | alcohol wipes Amount per deployable unit: 100 wipes |
| Thermo Scientific CryoBoxes | FisherSci | 12-565-227 | 64 well microcentrifuge tubes collection/storage boxes Amount per deployable unit: 2 boxes |
| packing material Amount per deployable unit: as needed |
References
- Donald, H. M., Wood, C. W., Benowitz, K. M., Johnson, R. A., Drodie, E. D. Nondestructive sampling of insect DNA from defensive secretion. Molecular Ecology Resources. 12 (5), 856-860 (2012).
- Feinstein, J. DNA sequence from butterfly frass and exuviae. Conservation Genetics. 5 (1), 103-104 (2004).
- Hamm, C. A., Aggarwal, D., Landis, D. A. Evaluating the impact of non-lethal DNA sampling on two butterflies, Vanessa cardui and Satyrodes Eurydice. Journal of Insect Conservation. 14, 11-18 (2010).
- Holehouse, K. A., Hammond, R. L., Bourke, A. F. G. Non-lethal sampling of DNA from bumblebees for conservation genetics. Insectes Sociaux. 50 (3), 277-285 (2003).
- Lushai, G., et al. Application of molecular techniques to non-lethal tissue samples of endangered butterfly population (Parnassius apollo L.) in Norway for conservation management. Biological Conservation. 94 (1), 43-50 (2000).
- Monroe, E. M., Lynch, C., Soluk, D. A., Britten, H. B. Nonlethal tissue sampling techniques and microsatellite markers used for first report of genetic diversity in two populations of the endangered Somatochlora hineana (Odonata: Corduliidae). Annals of the Entomological Society of America. 103 (6), 1012-1017 (2010).
- Oi, C. A., López-Uribe, M. M., Cervini, M., Del Lama, M. A. Non-lethal method of DNA sampling in euglossine bees supported by mark-recapture experiments and microsatellite genotyping. Journal of Insect Conservation. 17 (5), 1071-1079 (2013).
- Scriven, J. J., Woodall, L. C., Goulson, D. Nondestructive DNA sampling from bumblebee feces. Molecular Ecology Resources. 13 (2), 225-229 (2013).
- Watts, P. C., Thompson, D. J., Daguet, C., Kemp, S. J. Exuviae as a reliable source of DNA for population-genetic analysis of odonates. Odonatologica. 34 (2), 183-187 (2005).
- Andrews, K., et al. All hands on deck: local ecological knowledge and expert volunteers contribute to the first delisting of a marine fish species under the Endangered Species Act. Citizen Science: Theory and Practice. 4 (1), 37 (2019).
- Buxton, A., Groombridge, J., Griffiths, G. Comparison of two citizen scientist methods for collecting pond water samples for environmental DNA studies. Citizen Science: Theory and Practice. 3 (2), 2 (2018).
- Granroth-Wilding, H., et al. Non-invasive genetic monitoring involving citizen science enables reconstruction of current pack dynamics in a re-establishing wolf population. BMC Ecology. 17 (1), 44 (2017).
- Qiagen, DNeasy Blood & Tissue Kit Quick Start Protocol. , Available from: https://www.qiagen.com/us/resources/download.aspx?id=63e22fd7-6eed-4bcb-8097-7ec77bcd4de6&lang=en (2016).
- Storer, C., Daniels, J., Xiao, L., Rossetti, K. Using noninvasive genetic sampling to survey rare butterfly populations. Insects. 10 (10), 311 (2019).
- Wagner, D. L., et al. Insect decline in the Anthropocene: Death by a thousand cuts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (2), 20239891 (2021).
- Montgomery, G. A., et al. Is the insect apocalypse upon us? How to find out. Biological Conservation. 241, 108327 (2020).
