Summary
Hier presenteren we een eenvoudig protocol voor niet-invasieve genetische bemonstering van vlinderpopulaties op basis van de veldverzameling van resterend eipuin. Het kan worden gebruikt om de identiteit van soorten te bevestigen en genetische variatie te kwantificeren. Dit protocol kan eenvoudig worden aangepast aan bredere groepen voor betrokkenheid van de gemeenschap bij de wetenschap.
Abstract
De wereldwijde achteruitgang van insecten blijft versnellen. Effectieve genetische bemonstering is van cruciaal belang om het begrip van veel taxa te bevorderen en bestaande kennislacunes aan te pakken. Dit protocol vertegenwoordigt een gedemonstreerde methode voor het niet-destructief bemonsteren van zeldzame vlinders voor populatiegenetische structuur of DNA-barcoderingsanalyses. Het maakt gebruik van het chorion van uitgekomen vlinderovae om voldoende hoge kwantiteit en kwaliteit DNA te produceren voor succesvolle gensequencing om de identiteit van de soort te bevestigen en genetische variatie te kwantificeren. Het kan met name nuttig zijn wanneer andere weefselbemonsteringstechnieken onpraktisch of niet beschikbaar zijn. Hoewel ontwikkeld voor een lepidoptera, kan het toch gemakkelijk worden aangepast voor gebruik met andere insectensoorten. Het is speciaal ontworpen met gebruiksgemak als doel om de brede implementatie te maximaliseren door personen met verschillende ervarings- en vaardigheidsniveaus, zoals gemeenschapswetenschappers, natuurbeschermers en studenten, en voor gebruik in grote geografische gebieden om brede populatiesteekproeven te vergemakkelijken. De gegenereerde gegevens kunnen helpen bij het informeren van taxonomische en lijstbeslissingen, instandhoudings- en beheeracties en het verbeteren van fundamenteel ecologisch onderzoek.
Introduction
Effectieve populatie genetische bemonstering van zeldzame, afnemende en / of vermelde insectentaxa is vaak van cruciaal belang om instandhoudings- en beheeracties te helpen informeren. Dodelijke of schadelijke weefselbemonsteringsmethoden worden routinematig gebruikt voor veel genetische analyses. Deze methoden zijn echter ongewenst of niet toegestaan omdat ze schade kunnen toebrengen aan kwetsbare bestaande populaties of een negatieve invloed kunnen hebben op gedrag en fitheid. Verschillende niet-dodelijke of niet-invasieve bemonsteringstechnieken waarbij weefsel betrokken is, zoals hele benen, antenne- of vleugelmaaisel, larvale exuviae of hemolymfe van defensieve afscheidingen en andere producten, zoals frass, zijn geschikt voor genetisch onderzoek van insecten 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . De algehele haalbaarheid en toepasbaarheid van deze verschillende weefselbemonsteringstechnieken variëren aanzienlijk op basis van de biologie, ecologie, gedrag, grootte en zeldzaamheid van het focale organisme, de situatie en individuen die het materiaal verzamelen. Hele benen of aanhangselknipsels vereisen bijvoorbeeld tijdelijke vangst en zorgvuldige behandeling van verschillende personen in een geschikte levensfase, meestal door ervaren personeel. Evenzo zijn weefselbronnen, zoals larvale exuviae of frass, waarschijnlijk alleen praktisch als de organismen in gevangenschap zijn of tijdelijk gedurende een voldoende periode worden vastgehouden.
Voor onderzoeksvragen die op populatieniveau worden gesteld, zoals die met betrekking tot mogelijke taxonomische differentiatie of genetische structuur, is vaak bemonstering op een bredere temporele of geografische schaal (d.w.z. regionaal of continentaal) vereist. Als gevolg hiervan kunnen bepaalde niet-invasieve weefselbronnen volledig onpraktisch of op zijn minst inefficiënt zijn om in hoeveelheid te verzamelen. Monsterverzameling op dergelijke schaal kan bovendien logistiek of financieel onpraktisch of onbetaalbaar zijn voor individuele onderzoekers of zelfs kleinere veldteams om te ondernemen. Hoewel de directe betrokkenheid van gemeenschapswetenschappers in toenemende mate door de onderzoeksgemeenschap is overgenomen om veel van deze uitdagingen aan te pakken en big data-gedreven verzameling te versnellen, is de acceptatie beperkt voor studies met niet-destructieve, niet-invasieve of eDNA-bemonstering 10,11,12.
Om een aantal van deze potentiële beperkingen te overwinnen, hebben we aangetoond dat het chorion van uitgekomen vlinderovae voldoende hoge kwantiteit en kwaliteit DNA kon opleveren voor succesvolle gensequencing om de identiteit van de soort te bevestigen en genetische variatie te kwantificeren. Vervolgens hebben we verschillende verzamelprotocollen getest met behulp van deze techniek13. Dit proefwerk diende als basis voor verdere methodologische verfijning. Dit artikel beschrijft in detail het resulterende eenvoudige maar uitgebreide herziene veldverzamelingsprotocol dat is uitgerold voor gemeenschapswetenschappers en ander niet-deskundig personeel. Dit protocol maakt deel uit van een populatiestructuuranalyse van de frosted elfin butterfly (Callophrys irus) om toekomstige instandhoudingsacties en een federale bepaling van mogelijke opname onder de Amerikaanse Endangered Species Act te helpen informeren. Hoewel potentieel arbeidsintensiever dan sommige niet-invasieve methoden, maakt het gebrek aan noodzakelijk contact met organismen en gebruiksgemak het een potentieel levensvatbaar model dat kan worden toegepast op andere populatiegenetische onderzoeksprogramma's die gericht zijn op een selectie van zowel gewone insecten als die van instandhoudingszorg, die resterende eiresten achterlaten van recent uitgekomen nimfen of larven. De hier gepresenteerde protocoltaal is speciaal ontwikkeld voor vlinders in de familie Lycaenidae en voor gebruik door niet-experts die hier worden gedefinieerd als gemeenschapswetenschappers of andere individuen (bijv. Bureaubiologen, stagiaires) met beperkte entomologische ervaring.
Protocol
1. Verspreiding van benodigdheden aan wetenschappers uit de gemeenschap
- Bekijk en verzamel zorgvuldig de volledige lijst met collectiegerelateerde benodigdheden die nodig zijn door de volledige materiaaltabel te raadplegen.
- Als monsterverzameling op meerdere locaties en/of door meerdere personen/teams zal plaatsvinden, verzamel en organiseer dan alle benodigde benodigdheden in afzonderlijke inzetbare eenheden (figuur 1 en figuur 2).
- Transportbenodigdheden (inzetbare eenheden) aan gemeenschapswetenschappers of ander personeel dat verantwoordelijk is voor het verzamelen van het veld.
- Als het personeel niet lokaal is, verpak dan zorgvuldig benodigdheden (elke inzetbare eenheid) in een aparte kartonnen verzenddoos met een compleet verzendlabel en verzend.
OPMERKING: Versnelde verzending is in dit stadium niet vereist.
2. Voorbereiding van de verzameling van communautaire wetenschappers
- Na ontvangst van de verzamelbenodigdheden, inclusief de collectie tacklebox, bekijkt u zorgvuldig de gelamineerde voorraadlijst en voert u een volledige inventaris uit. Breng de projectleider op de hoogte als er voorraden ontbreken.
- Vul 1,5 ml microcentrifugebuizen voor met 180 μL lysisbuffer, breng etiketten aan met een voorbedrukt uniek ID-label op elke microcentrifugebuis en plaats alle buizen in de opbergdoos met 64-wells microcentrifugebuizen. Zet het deksel stevig vast na het laden.
OPMERKING: Als er geen labelprinters beschikbaar zijn, brengt u unieke ID-nummers aan op de zijkant en het deksel van elke injectieflacon met behulp van een ethanolbestendige marker. - Zorg ervoor dat alle digitale apparatuur (bijv. smartphone of camera) volledig is opgeladen en dat eventuele reservebatterijen zijn ingepakt.
- Vul een kleine koeler gedeeltelijk met ijs voor veldopslag en lokaal transport van de verzamelde monsters.
- Verpak alle verzamelbenodigdheden in de collectie tacklebox of soortgelijke stevige, weerbestendige container voor veilig transport en geconsolideerde opslag.
- Bekijk het niet-destructieve protocol voor het verzamelen van genetische monsters in detail voordat u het veld ingaat.
OPMERKING: Gebruik het gelamineerde en gecondenseerde, geïllustreerde protocol voor aanvullende richtlijnen in het veld (aanvullende figuur S1 en aanvullende figuur S2).
3. Monstername in het veld
- Gebruik bij aankomst op de veldlocatie een potlood of een all-weather pen om in het weerbestendige veldnotitieblok het tijdstip van de dag, de datum, de algemene naam van de accommodatie (bijv. Apalachicola National Forest), de naam of beschrijving van de specifieke locatie van het veld en de GPS-meting, indien beschikbaar, en de volledige naam en rollen van alle aanwezige personen vast te leggen.
- Zoek een geschikte habitat met de aanwezigheid van larvale waardplantensoorten die specifiek zijn voor de doelvlinder.
OPMERKING: Wees voorzichtig om de impact op gevoelige habitats, plantenpopulaties en dieren in het wild te vermijden of te minimaliseren. Zorg er bovendien voor dat u alle juiste machtigingen en / of vergunningen van landeigenaren beveiligt voordat u toegang krijgt tot een site en monsterverzamelingsgebeurtenissen. - Maak met behulp van een smartphone of camera gedetailleerde foto's van alle veldlocaties, locaties voor het verzamelen van monsters, waardplanten en alle andere informatie die relevant kan zijn voor het project. Gebruik smartphones of andere camera's die GPS-coördinaten registreren.
OPMERKING: Fotogeotagging moet op alle smartphones zijn ingeschakeld. - Doorzoek uitgebreid alle larvale gastheerplantdelen, zoals bladeren, bloemknoppen, bloemen of zich ontwikkelende vruchten, waarvan bekend is dat ze worden geselecteerd door volwassen vrouwelijke vlinders te laten leggen (eieren leggen) voor uitgekomen eieren. Zoek voor de meeste Lycaenidae naar witte, uitgekomen eieren met een duidelijk gat in het midden dat lijkt op een donut waaruit de pasgeboren larve is voortgekomen (figuur 3). Zoek naar niet-gehate eieren die iets donkerder van kleur zijn, vaak groen of blauwachtig, en volledig intact zijn zonder een gat in het midden (figuur 4). Gebruik een handlens of een ander vergrootglas om elk ei van dichtbij te inspecteren.
- Zodra een uitgekomen ei is gelokaliseerd, doe je nitrilhandschoenen aan beide handen.
- Gebruik een schone, steriele, puntige tang om het uitgekomen ei voorzichtig van de waardplant te trekken en plaats het rechtstreeks in een gelabelde microcentrifugebuis die vooraf is gevuld met lysisbuffer uit de 64-wells opslagdoos.
OPMERKING: Sommige transportmaterialen van waardplanten (kleiner dan 15 mm in diameter) zijn acceptabel en normaal tijdens het verzamelen. - Verzamel minimaal 5 monsters per pleister/plaats van de waardplant (elk met 1-20 uitgekomen eieren), met als doel >50 eieren in totaal op een locatie, indien beschikbaar.
OPMERKING: Dit zal helpen ervoor te zorgen dat ten minste wat weefsel wordt verzameld bij elke monsterplant / -pleister en de kans op het detecteren van DNA (persoonlijke observatie) vergroten. - Maak na elke eicelverzameling de tangpunten zorgvuldig schoon door ze in een injectieflacon met 95% ethanol te dopen of door te overgieten met 95% ethanol uit een knijpfles of door alcoholdoekjes te gebruiken.
OPMERKING: Dit zal helpen om weefseloverdracht tussen bemonsteringsgebeurtenissen te minimaliseren. - Verzamel, indien beschikbaar, meerdere uitgekomen eieren (1-20 eieren) van meerdere planten in dezelfde gastheerpleister in een enkele microcentrifugebuis en sluit het deksel stevig. Voor vlindersoorten die grotere kruidachtige of houtachtige gastheersoorten gebruiken, verzamel meerdere eieren van verschillende locaties op dezelfde plant als gastheerplekken beperkt zijn.
OPMERKING: Planten bevinden zich in dezelfde gastheer als hun bladeren elkaar raken. Als er een merkbare fysieke scheiding is tussen planten of patches, moet dit als een ander monster worden beschouwd. Als u een ander weefseltype verzamelt, zoals larvale exuviae of een enkele poot, plaatst u slechts een enkele poot, beenfragment of larvale exuvia in een microcentrifugebuis (één monster per persoon). - Zorg ervoor dat al het verzamelde materiaal volledig is ondergedompeld in de lysisbuffer in elke microcentrifugebuis van 1,5 ml. Tik op de onderkant van de buis in kwestie op een hard oppervlak om eventuele monsters indien nodig opnieuw onder te dompelen.
- Veeg de tang af om te drogen met een schoon wegwerp laboratoriumdoekje.
OPMERKING: Zorgvuldige reiniging van de tang is essentieel om kruisbesmetting tussen monsters te voorkomen. - Gooi bij het verzamelen van een nieuw monster gebruikte nitrilhandschoenen weg en vervang ze door een schoon paar.
- Gebruik in een weerbestendig veldnotitieblok een potlood of all-weather pen om het unieke ID-label vast te leggen dat is toegewezen aan de microcentrifugebuis, samen met het type monster (bijv. Eieren, larvale exuviae of poot), het geschatte aantal uitgekomen eieren en verzamelinformatie zoals verzamelnaam (en), datum, locatie, gastheerplantensoort en eventuele aanvullende opmerkingen (figuur 2).
- Plaats de gesloten microcentrifugebuis met eirestenmonster terug in de 64-wells microcentrifuge-opslagdoos.
- Onderhoud de 64-wells microcentrifuge opslagbox in een koeler met ijs terwijl u in het veld bent.
- Bewaar alle andere verzamelbenodigdheden in de verzamelbox terwijl u in het veld bent voor veilige en geconsolideerde opslag en transport tussen locaties.
4. Wanneer het verzamelen van velden is voltooid
- Zorg ervoor dat alle microcentrifugebuizen met monsters zich in de 64-wells microcentrifuge-opslagdoos in een koeler met ijs bevinden voor transport.
- Plaats alle veldverzamelingsbenodigdheden terug in de verzamelbox.
- Transporteer alle monsters terug naar het kantoor of laboratorium en controleer elke microcentrifugebuis zorgvuldig om ervoor te zorgen dat al het monstermateriaal volledig is ondergedompeld in een lysisbuffer.
- Plaats de 64-wells microcentrifuge opslagdoos met monsters in een vriezer tot verzending of verwerking.
OPMERKING: Een gemiddelde commerciële vriezer van -18 °C is acceptabel voor kortdurende opslag. - Beoordeel zorgvuldig alle benodigdheden in de verzameltoolbox en vervang ze indien nodig.
OPMERKING: Dit is vooral belangrijk als er meerdere veldverzamelingsgebeurtenissen zijn gepland. - Bewaar de collectie tacklebox op een veilige locatie tot de volgende veldverzamelingsgebeurtenis.
- Download alle digitale afbeeldingen en zorg ervoor dat er veilig een back-up van wordt gemaakt op een server of cloudgebaseerd opslagsysteem.
- Scan of fotografeer de originele weerbestendige, veldnotitieblokpagina's of veldgegevensbladen met collectiegegevens totdat alle informatie kan worden ingevoerd in een projectspreadsheet of -database.
5. Monsters en gegevens indienen
- Verwijder alle 64-wells microcentrifuge opbergdozen met monsters uit de vriezer.
- Verpak de 64-wells microcentrifuge-opbergdozen met monsters en het veldnotitieblok of veldgegevensbladen zorgvuldig in een standaard verzenddoos, bevestig het meegeleverde verzendlabel met het rekeningnummer van de originele afzender en verzend via express carrier-gegarandeerde, nachtelijke, levering de volgende dag naar de projectdirecteur.
- E-mail het trackingnummer van het pakket en een kopie van de gescande notitieblokpagina's of veldgegevensbladen naar de projectdirecteur.
6. DNA-extractie
- Zodra de 64-wells microcentrifuge-opslagdozen zijn ontvangen, bewaart u ze bij -20 °C voor het bewaren van DNA in monsters totdat ze klaar zijn voor DNA-extractie.
- In het laboratorium dna extraheren door insectenweefsel te malen dat is opgeslagen in de lysisbuffer na het ontdooien van de -20 °C. Voeg 20 μL proteïnase K toe en laat het monster een nacht bij 56 °C weken in een verwarmde incubator gedurende ten hoogste 24 uur.
- Voeg de juiste reinigings- en wasbuffers toe, volgens de aanbeveling van de specifieke fabrikant13.
- Breng het in buffer gesuspendeerde monster over in een spinkolom die is bevestigd aan een injectieflacon met 2 ml.
- Spin naar beneden bij 6.021 × g gedurende 60 s met behulp van een centrifuge. Voeg de juiste wasbuffers toe en draai op de juiste manier.
- Laat gebonden DNA vrij met behulp van een elusiebuffer (30 μL) en draai het monster af in een verse microcentrifugebuis van 1,5 ml. Bewaren bij -20 °C.
OPMERKING: Ga verder met sequencing als de DNA-concentratie hoger is dan 0,010 ng / ml. Zie figuur 5 voor DNA-concentratie per weefseltype.
7. Data-analyse van DNA-sequenties
- Trim of bewerk basisaanroepen van lage kwaliteit in resulterende reeksen.
- Querysequenties tegen openbare databases voor bevestiging van soortidentificatie.
- Lijn reeksen op elkaar af voor vergelijking van verschillen tussen individuen.
Representative Results
Materialen voor het verzamelen van maximaal 563 monsters werden verzonden naar acht natuurbeschermings- en gemeenschapswetenschappers uit negen staten in het soortengebied in het oosten van Noord-Amerika. Materialen werden in 2021 gedurende drie maanden verzonden voorafgaand aan lokale piekvluchttijden. Tot op heden hebben we in totaal 160 C. irus weefselmonsters ontvangen die zijn verzameld (tabel 1). Genomisch DNA werd geëxtraheerd volgens een protocol voor dit monstertype, gedetailleerd door Storer et al.14. Van deze 160 monsters werd met succes DNA geëxtraheerd uit 88 met een gemiddelde concentratie van 1,67 ng / μL (SE ± 2,98), en de hoogste DNA-opbrengst was 26,8 ng / μL. De concentraties werden gekwantificeerd met behulp van een zeer gevoelige testkit volgens de instructies van de fabrikant met 2 μL extract.
Hoewel het totale aantal ontvangen monsters aanzienlijk lager is dan dat van het totale totale aantal materialen dat voor verzameling wordt ingezet, is dit voornamelijk een artefact van het verstrekken van een overvloed aan collectiemateriaal aan de primaire verzamelaar of teamleider om hen in staat te stellen de maximale flexibiliteit te hebben voor het opnemen van meerdere verzamellocaties en / of betrokken gemeenschapswetenschappers indien gewenst. Bovendien is C. iris een zeldzaam en afnemend taxon dat wordt vertegenwoordigd door beperkte en vaak relatief kleine populaties in zijn hele bestaande bereik. Ondanks deze beperking is het totale aantal ontvangen weefselmonsters aanzienlijk, vooral in vergelijking met wat zou worden verwacht met een meer traditionele bemonstering van individuele volwassen vlinders.
Figuur 1: Individuele inzetbare eenheden van alle benodigde voorraden die in afwachting zijn van verzending naar gemeenschapswetenschappers of ander personeel dat verantwoordelijk is voor het verzamelen van het veld. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Individuele inzetbare eenheid inclusief alle benodigdheden, doorzichtige plastic verzamelbox en ingevuld expresvervoerderlabel in afwachting van verzending naar gemeenschapswetenschappers of ander personeel dat verantwoordelijk is voor het verzamelen van het veld. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Foto van uitgekomen mat elfenvlinder (Callophrys irus) ei op wilde lupine (Lupinus perennis) met een duidelijk gat in het midden waaruit de pasgeboren larve tevoorschijn kwam. Merk op dat de algehele kleur van het uitgekomen ei wit is. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Foto van niet-gehate uitgekomen matte elfenvlinder (Callophrys irus) eieren op wilde lupine (Lupinus perennis). Merk op dat niet-gehate eieren geen merkbaar centraal gat hebben en dat hun algehele kleur blauwachtig groen is. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: DNA-concentratie per weefseltype. De middellijnen van de doos vertegenwoordigen de mediaan, elke doos verlengt de IQR en de snorharen van de doos zijn 1,5 × IQR, waarbij eventuele punten buiten uitschieters zijn. Monsters met een enkele eierdoos hadden slechts één eierdoos en monsters met meerdere eierdozen hadden ten minste twee gevallen, waarbij het aantal gevallen varieerde van 2 tot 20 (gemiddeld = 5,3) per monster. Afkorting: IQR = interkwartielbereik. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Staat | Eierdoosje | Eierdozen | Frass | Been | Ruien | Totaal-generaal |
| Arkansas | 2 | 2 | ||||
| Florida | 3 | 10 | 7 | 22 | 42 | |
| Michigan | ||||||
| New Hampshire | 24 | 6 | 15 | 45 | ||
| New York | 30 | 30 | ||||
| Ohio | ||||||
| Wisconsin | 9 | 5 | 5 | 19 | ||
| Oklahoma | 16 | 6 | 22 | |||
| Totaal-generaal | 36 | 21 | 16 | 65 | 22 | 160 |
Tabel 1: Aantal en type weefselmateriaal verzameld per staat.
Aanvullende figuur S1: Voorpagina van een dubbelzijdig, gelamineerd, gecondenseerd en geïllustreerd protocol voor gebruik in het veld. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S2. Achterpagina van dubbelzijdig, gelamineerd, gecondenseerd, geïllustreerd protocol voor gebruik in het veld. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
Dit protocol beschrijft een veldmethode voor het niet-destructief bemonsteren van zeldzame vlinders voor populatiegenetische structuur- of DNA-barcoderingsanalyses. De algemene voordelen van dit protocol zijn specifiek ontworpen om de brede implementatie te maximaliseren door personen met verschillende ervarings- en vaardigheidsniveaus, zoals gemeenschapswetenschappers, natuurbeschermers en studenten. Deze omvatten relatief lage totale kosten, gemakkelijk aan te schaffen benodigdheden en apparatuur, een eenvoudige en toegankelijke methode zonder tal van al te complexe stappen en eenvoudige implementatie over een breed geografisch gebied. Het richt zich bovendien op resterend organisch materiaal dat de noodzaak elimineert om tijdelijk te vangen of te manipuleren, en in het proces mogelijk levende organismen schaadt om genetische monsters te verkrijgen. Bovendien verlengt het de potentiële periode die beschikbaar is voor monsterverzameling buiten de traditionele fenologie of levensduur van een bepaalde levensfase, waardoor de flexibiliteit en de algehele verzamelmogelijkheid worden verbeterd om het aantal monsters te maximaliseren.
Hoewel het centrale taxon voor deze inspanning de bevroren elfenvlinder was, een wijdverspreide maar afnemende habitatspecialist, kan dit protocol breder worden toegepast op vele andere insecten, waaronder die van zorg voor natuurbehoud. Evenzo, terwijl het protocol zich richt op het verzamelen van uitgekomen eieren als de bron van genetisch materiaal, kan het gemakkelijk worden aangepast aan andere, mogelijk meer traditionele monsters (bijv. Benen, vleugelfragmenten, antenneklemmen) of zelfs hele organismen. Dit aspect is echter ook een mogelijke beperking van het protocol. Hoewel de overgrote meerderheid van de stappen is ontworpen om relatief eenvoudig en snel te bereiken te zijn, is het uitgebreid zoeken naar stukjes larvale waardplanten naar broedeieren, die individueel meestal < 1,0 mm in diameter zijn, tijd- en arbeidsintensief. Niettemin is zo'n uitgebreide bemonsteringsactiviteit vooral ideaal voor een groter netwerk van deelnemers, zoals gemeenschapswetenschappers.
Net als bij andere veldprojecten is een zorgvuldige voorbereiding essentieel. Dit omvat het uitvoeren van een volledige inventaris van de benodigdheden die nodig zijn om ervoor te zorgen dat er geen items ontbreken, dat alle vereiste voorbereidingswerkzaamheden zijn voltooid en dat ze goed georganiseerd, veilig verpakt en klaar zijn voor inzet in het veld. Bovendien moet al het veldpersoneel, met name degenen die de weefselverzameling uitvoeren, het verzamelprotocol in detail bekijken voorafgaand aan een verzamelevenement en eventuele vragen richten aan personen die toezicht houden op het project. Eenmaal in het veld vereist het monsterverzamelingsgedeelte van het protocol nauwgezette aandacht voor detail. Dit omvat het lokaliseren en zorgvuldig inspecteren van eicellen om ervoor te zorgen dat ze zijn uitgebroed en dus geschikt zijn voor verzameling, het grondig reinigen van een tang, het vervangen van handschoenen om weefseloverdracht tussen bemonsteringsgebeurtenissen te helpen verminderen en ervoor zorgen dat weefselmonsters volledig worden ondergedompeld in lysisbuffer in elke microcentrifugebuis van 1,5 ml. Ten slotte is het vastleggen van nauwkeurige en gedetailleerde gegevens van essentieel belang, waaronder het koppelen van het unieke ID-label dat aan de microcentrifugebuis is toegewezen, samen met het specifieke monster dat is genomen en alle andere relevante verzamelinformatie. Hoewel deze stap routine is in wetenschappelijk onderzoek, moet deze vaak grondig worden verduidelijkt en versterkt voor een gemeenschapswetenschappelijk publiek.
Hier demonstreren we het potentiële gebruik van gemeenschapswetenschappers voor niet-dodelijke monsterverzameling van kleine, zeldzame en bedreigde soorten. Er zijn echter enkele mogelijke beperkingen om in gedachten te houden bij het analyseren van resulterende genetische gegevens. Bijvoorbeeld, terwijl het poolen van monsters van een enkele patch de kans vergroot om voldoende DNA te herstellen voor detectie, introduceert het mogelijk ook heterozygositeit. Bovendien, omdat het protocol betrekking heeft op het verzamelen van het chorion van uitgekomen eicellen, kunnen alleen vrouwelijke vlinders, die ouderlijk DNA vertegenwoordigen, binnen een populatie worden bemonsterd. Aangezien er echter geen eerdere genetische gegevens op populatieniveau beschikbaar waren voor C. irus, kunnen de verkregen inzichten alleen het behoud en beheer van soorten ten goede komen. Bijvoorbeeld, terwijl een grondig, gedetailleerd onderzoeksontwerp en zorgvuldige markerselectie nodig zouden zijn om de populatiestructuur adequaat te beoordelen, zou het hier geschetste bemonsteringsprotocol en het gebruik van cytochroom c-oxidase subunit 1 (CO1) DNA-barcoding kunnen worden gebruikt om het optreden van zeldzame of bedreigde taxa te detecteren. Aanvullende bespreking van het nut en de toepassing van DNA-sequencing van niet-dodelijke bemonstering die hier wordt beschreven, wordt gedetailleerd beschreven door Storer et. al.14.
Naast het primaire doel van het verzamelen van monsters voor genetische analyse, benadrukt het protocol ook dat deelnemers gedetailleerde digitale foto's maken van alle veldlocaties, verzamellocaties, aanwezige larvale waardplanten en andere elementen van de omliggende habitat die relevant kunnen zijn. Dergelijke documentatie helpt bij het bieden van een algemene habitatbeoordeling die nuttig is om bestaande locatieomstandigheden te illustreren, zoals plantenfenologie, dichtheid van gastheerbronnen en beheergeschiedenis (bijv. Recent voorgeschreven brand). Dergelijke informatie is met name nuttig voor projecten waarbij veldmonsters worden genomen over een bredere periode om meer gedetailleerde milieuvergelijkingen mogelijk te maken.
Ten slotte, naarmate de wereldwijde achteruitgang van insecten blijft versnellen, zijn uitgebreide inspanningen voor de beoordeling en monitoring van soorten van cruciaal belang15,16. Het gebruik van meer wijdverspreide participatieve betrokkenheid van gemeenschapswetenschappers, studenten (bijv. U.S. Fish and Wildlife Service-stagiairs en fellows) en natuurbeschermers biedt steeds haalbare opties voor uitgebreide gegevensverzameling van vele soorten, waaronder DNA-monsters. Dienovereenkomstig hebben de gegevens die uit dit protocol worden gegenereerd veel mogelijke toepassingen. Deze omvatten het helpen informeren van instandhoudingsacties (bijv. Planning, herstel en beheer), het inventariseren van beslissingen of beoordelingen van de status van soorten, en ecologisch, populatie- en taxonomisch onderzoek.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen David Cuthrell, Amanda Dillon, Steve Fuller, Neil Gifford, Heidi Holman, Dean Jue, Sally Jue, Daniel Kennedy, Genevieve Kozak, Rebecca Longenecker, Maureen McClung, Matt Moran, Robin Niver, Brenda Smith, Hunter Trowbridge en Jessup Weichelt bedanken voor hulp bij verschillende aspecten van het project, waaronder logistiek, coördinatie, vergunningen en / of monsterverzameling. Dit onderzoek werd gefinancierd door een subsidie van de U.S. Fish and Wildlife Service (Federal Award Identification Number F20AC00356) beheerd door het Wildlife Management Institute (subsidie SA 2021-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 quart Igloo Playmate Cooler | Amazon | NA | portable cooler Amount per deployable unit: 1 cooler |
| 250 DNeasy Mini Spin Columns, Proteinase K, Buffers, Collection Tubes (2 mL) | Qiagen | 69506 | Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit Amount per deployable unit: NA |
| Andwin Scientific Supplier Diversity Partner LAB MARKERS BLACK | FisherSci | NC9280166 | ethanol proof lab marker Amount per deployable unit: 2 markers |
| Cardboard shipping box | shipping box Amount per deployable unit: as needed |
||
| Eisco Polyethylene Wash Bottles, LDPE | FisherSci | S14091 | lab grade spray or squirt bottle (for ethanol or alcohol) Amount per deployable unit: 1 bottle |
| FedEx U.S. express airbill | FedEx | NA | shipping return label Amount per deployable unit: 2 labels |
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | FisherSci | NC9386261 | sterile 1.5 mL microcentrifuge tubes Amount per deployable unit: 128 tubes |
| Forceps, #4a, very fine yet extra strong tips (33 mm), 4-3/8" (111 mm) long | Bioquip | 4523 | straight tip forceps Amount per deployable unit: 2 straight forceps |
| Forceps, #7, curved tips (13 mm), very fine points, 4-1/2" (114 mm) long | Bioquip | 4527 | curved tip forceps Amount per deployable unit: 2 curved forceps |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply | FisherSci | 06-666A | kimwipes (or other sterile wipe) Amount per deployable unit: 1 box |
| Laminated Illustrated field collection protocol | NA | NA | abbreviated protocol Amount per deployable unit: 1 protocol |
| Laminated list of materials | NA | NA | supply list Amount per deployable unit: 1 list |
| Lily Sugar 'N Cream The Original Solid Yarn, 2.5 oz, Medium 4 Gauge, 100% Cotton - Hot Pink - Machine Wash & Dry | Amazon | NA | pink yarn (to secure to forceps for visibility) Amount per deployable unit: 2 yards |
| Loupe by Bausch & Lomb, 10x Coddington Magnifier | Amazon | NA | hand lens Amount per deployable unit: 2 hand lenses |
| MyGift Clear Plastic 2-Tier Trays Craft Supply Storage Box/First Aid Carrying Case w/Top Handle & Latch Lock | Amazon | NA | supply storage box Amount per deployable unit: 1 box |
| Nitrile, Disposable Gloves, L, Powder-Free, 2.8 mil Palm Thickness | Grainger | 60NU14 | nitrile lab gloves (large) Amount per deployable unit: 1 box |
| Nitrile, Disposable Gloves, M, Powder-Free, 2.8 mil Palm Thickness | Grainger | 60NU13 | nitrile lab gloves (medium) Amount per deployable unit: 1 box |
| Qiagen, Inc. BUFFER ATL (200 ML) | Qiagen | 19076 | Qiagen ATL lysis buffer Amount per deployable unit: 180 µl/tube; 128 tubes |
| Rite In The Rain Weatherproof Side Spiral Notebook, Yellow Cover, Universal Page Pattern (No. 373-MX), 11 x 8.75 x 0.5 | Amazon | NA | weatherproof field notebook Amount per deployable unit: 1 notebook |
| Showgard Professional Stamp Tongs 6" 904 Round Tip Tweezers | Amazon | NA | 6" spade tip forceps Amount per deployable unit: 2 long spade forceps |
| Texwipe PolySat Pre-Wetted Wipers | FisherSci | 18-366-231 | alcohol wipes Amount per deployable unit: 100 wipes |
| Thermo Scientific CryoBoxes | FisherSci | 12-565-227 | 64 well microcentrifuge tubes collection/storage boxes Amount per deployable unit: 2 boxes |
| packing material Amount per deployable unit: as needed |
References
- Donald, H. M., Wood, C. W., Benowitz, K. M., Johnson, R. A., Drodie, E. D. Nondestructive sampling of insect DNA from defensive secretion. Molecular Ecology Resources. 12 (5), 856-860 (2012).
- Feinstein, J. DNA sequence from butterfly frass and exuviae. Conservation Genetics. 5 (1), 103-104 (2004).
- Hamm, C. A., Aggarwal, D., Landis, D. A. Evaluating the impact of non-lethal DNA sampling on two butterflies, Vanessa cardui and Satyrodes Eurydice. Journal of Insect Conservation. 14, 11-18 (2010).
- Holehouse, K. A., Hammond, R. L., Bourke, A. F. G. Non-lethal sampling of DNA from bumblebees for conservation genetics. Insectes Sociaux. 50 (3), 277-285 (2003).
- Lushai, G., et al. Application of molecular techniques to non-lethal tissue samples of endangered butterfly population (Parnassius apollo L.) in Norway for conservation management. Biological Conservation. 94 (1), 43-50 (2000).
- Monroe, E. M., Lynch, C., Soluk, D. A., Britten, H. B. Nonlethal tissue sampling techniques and microsatellite markers used for first report of genetic diversity in two populations of the endangered Somatochlora hineana (Odonata: Corduliidae). Annals of the Entomological Society of America. 103 (6), 1012-1017 (2010).
- Oi, C. A., López-Uribe, M. M., Cervini, M., Del Lama, M. A. Non-lethal method of DNA sampling in euglossine bees supported by mark-recapture experiments and microsatellite genotyping. Journal of Insect Conservation. 17 (5), 1071-1079 (2013).
- Scriven, J. J., Woodall, L. C., Goulson, D. Nondestructive DNA sampling from bumblebee feces. Molecular Ecology Resources. 13 (2), 225-229 (2013).
- Watts, P. C., Thompson, D. J., Daguet, C., Kemp, S. J. Exuviae as a reliable source of DNA for population-genetic analysis of odonates. Odonatologica. 34 (2), 183-187 (2005).
- Andrews, K., et al. All hands on deck: local ecological knowledge and expert volunteers contribute to the first delisting of a marine fish species under the Endangered Species Act. Citizen Science: Theory and Practice. 4 (1), 37 (2019).
- Buxton, A., Groombridge, J., Griffiths, G. Comparison of two citizen scientist methods for collecting pond water samples for environmental DNA studies. Citizen Science: Theory and Practice. 3 (2), 2 (2018).
- Granroth-Wilding, H., et al. Non-invasive genetic monitoring involving citizen science enables reconstruction of current pack dynamics in a re-establishing wolf population. BMC Ecology. 17 (1), 44 (2017).
- Qiagen, DNeasy Blood & Tissue Kit Quick Start Protocol. , Available from: https://www.qiagen.com/us/resources/download.aspx?id=63e22fd7-6eed-4bcb-8097-7ec77bcd4de6&lang=en (2016).
- Storer, C., Daniels, J., Xiao, L., Rossetti, K. Using noninvasive genetic sampling to survey rare butterfly populations. Insects. 10 (10), 311 (2019).
- Wagner, D. L., et al. Insect decline in the Anthropocene: Death by a thousand cuts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (2), 20239891 (2021).
- Montgomery, G. A., et al. Is the insect apocalypse upon us? How to find out. Biological Conservation. 241, 108327 (2020).
