Summary
यहां, हम अवशिष्ट अंडे के मलबे के क्षेत्र संग्रह के आधार पर तितली आबादी के गैर-आक्रामक आनुवंशिक नमूने के लिए एक सीधा प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इसका उपयोग प्रजातियों की पहचान की पुष्टि करने और आनुवंशिक भिन्नता को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल को सामुदायिक विज्ञान की भागीदारी के लिए व्यापक समूहों के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है।
Abstract
वैश्विक कीट गिरावट में तेजी जारी है। कई टैक्सों की समझ को आगे बढ़ाने और मौजूदा ज्ञान अंतराल को संबोधित करने के लिए प्रभावी आनुवंशिक नमूनाकरण की गंभीर रूप से आवश्यकता है। यह प्रोटोकॉल जनसंख्या आनुवंशिक संरचना या डीएनए बारकोडिंग विश्लेषण के लिए दुर्लभ तितलियों के गैर-विनाशकारी नमूने के लिए एक प्रदर्शित विधि का प्रतिनिधित्व करता है। यह प्रजातियों की पहचान की पुष्टि करने और आनुवंशिक भिन्नता की मात्रा निर्धारित करने के लिए सफल जीन अनुक्रमण के लिए पर्याप्त उच्च मात्रा और गुणवत्ता वाले डीएनए उत्पन्न करने के लिए हैच तितली ओवे के कोरियन का उपयोग करता है। यह विशेष रूप से उपयोगी हो सकता है जब अन्य ऊतक नमूना तकनीक अव्यावहारिक या अनुपलब्ध होती है। जबकि लेपिडोप्टेरान के लिए विकसित किया गया था, फिर भी इसे आसानी से अन्य कीट प्रजातियों के साथ उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। यह विशेष रूप से उपयोग में आसानी के साथ डिजाइन किया गया था ताकि विभिन्न अनुभव और कौशल स्तरों के व्यक्तियों, जैसे सामुदायिक वैज्ञानिकों, संरक्षण चिकित्सकों और छात्रों द्वारा व्यापक कार्यान्वयन को अधिकतम करने में मदद मिल सके, और व्यापक जनसंख्या नमूनाकरण की सुविधा के लिए बड़े भौगोलिक क्षेत्रों में उपयोग किया जा सके। उत्पन्न डेटा टैक्सोनोमिक और लिस्टिंग निर्णयों, संरक्षण और प्रबंधन कार्यों को सूचित करने और बुनियादी पारिस्थितिक अनुसंधान को बढ़ाने में मदद कर सकता है।
Introduction
दुर्लभ, गिरावट और / या सूचीबद्ध कीट टैक्सा का प्रभावी जनसंख्या आनुवंशिक नमूनाकरण अक्सर संरक्षण और प्रबंधन कार्यों को सूचित करने में मदद करने के लिए महत्वपूर्ण होता है। कई आनुवंशिक विश्लेषणों के लिए घातक या हानिकारक ऊतक नमूनाकरण विधियों का नियमित रूप से उपयोग किया जाता है। हालांकि, ये विधियां अवांछनीय हैं या अनुमति नहीं है क्योंकि वे कमजोर मौजूदा आबादी को नुकसान पहुंचा सकते हैं या व्यवहार और फिटनेस को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकते हैं। विभिन्न गैर-घातक या गैर-आक्रामक नमूनाकरण तकनीकें जिनमें ऊतक शामिल हैं जैसे कि पूरे पैर, एंटीनल या विंग क्लिपिंग, लार्वा एक्सुविया, या रक्षात्मक स्राव से हेमोलिम्फ और अन्य उत्पाद, जैसे कि फ्रैस, कीट आनुवंशिक अनुसंधान के लिए उपयुक्त रहे हैं 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . इन विभिन्न ऊतक नमूना तकनीकों की समग्र व्यवहार्यता और प्रयोज्यता जीव विज्ञान, पारिस्थितिकी, व्यवहार, आकार और फोकल जीव, स्थिति और सामग्री एकत्र करने वाले व्यक्तियों की दुर्लभता के आधार पर काफी भिन्न होती है। उदाहरण के लिए, पूरे पैर या उपांग क्लिपिंग को एक उपयुक्त जीवन स्तर के कई व्यक्तियों के अस्थायी कैप्चर और सावधानीपूर्वक हैंडलिंग की आवश्यकता होती है, आमतौर पर अनुभवी कर्मियों द्वारा। इसी तरह, ऊतक स्रोत, जैसे कि लार्वा एक्सुविया या फ्रैस, केवल तभी व्यावहारिक होने की संभावना है जब जीव कैद में हों या अस्थायी रूप से पर्याप्त अवधि के लिए रखे गए हों।
जनसंख्या स्तर पर पूछे जाने वाले शोध प्रश्नों के लिए, जैसे कि संभावित टैक्सोनोमिक भेदभाव या आनुवंशिक संरचना से संबंधित, व्यापक अस्थायी या भौगोलिक पैमाने (यानी, क्षेत्रीय या महाद्वीपीय) पर नमूनाकरण अक्सर आवश्यक होता है। नतीजतन, कुछ गैर-आक्रामक ऊतक स्रोत पूरी तरह से अव्यावहारिक हो सकते हैं या मात्रा में एकत्र करने के लिए कम से कम अक्षम हो सकते हैं। ऐसे पैमानों पर नमूना संग्रह भी व्यक्तिगत शोधकर्ताओं या यहां तक कि छोटी फील्ड टीमों के लिए तार्किक या वित्तीय रूप से अव्यावहारिक या निषेधात्मक हो सकता है। जबकि इन चुनौतियों में से कई को संबोधित करने और बड़े डेटा-संचालित संग्रह में तेजी लाने में मदद करने के लिए अनुसंधान समुदाय द्वारा सामुदायिक वैज्ञानिकों की प्रत्यक्ष भागीदारी को तेजी से अपनाया गया है, गैर-विनाशकारी, गैर-आक्रामक, या ईडीएनए नमूनाकरण10,11,12 से जुड़े अध्ययनों के लिए अपनाना सीमित है।
इन संभावित सीमाओं में से कुछ को दूर करने में मदद करने के लिए, हमने प्रदर्शित किया कि हैच तितली ओवे से कोरियन प्रजातियों की पहचान की पुष्टि करने और आनुवंशिक भिन्नता की मात्रा निर्धारित करने के लिए सफल जीन अनुक्रमण के लिए पर्याप्त उच्च मात्रा और गुणवत्ता वाले डीएनए का उत्पादन कर सकता है। हमने बाद में इस तकनीक13 का उपयोग करके विभिन्न संग्रह प्रोटोकॉल का परीक्षण किया। इस पायलट कार्य ने आगे पद्धतिगत शोधन के आधार के रूप में कार्य किया। यह पत्र सामुदायिक वैज्ञानिकों और अन्य गैर-विशेषज्ञ कर्मियों के लिए परिणामी सरल लेकिन व्यापक संशोधित क्षेत्र संग्रह प्रोटोकॉल का विस्तार से वर्णन करता है। यह प्रोटोकॉल भविष्य के संरक्षण कार्यों को सूचित करने और अमेरिकी लुप्तप्राय प्रजाति अधिनियम के तहत संभवतः सूचीबद्ध होने के संघीय निर्धारण में मदद करने के लिए फ्रॉस्टेड एल्फिन तितली (कैलोफ्रिस इरस) के एक श्रृंखला-व्यापी जनसंख्या संरचना विश्लेषण का हिस्सा है। यद्यपि कुछ गैर-आक्रामक तरीकों की तुलना में संभावित रूप से अधिक श्रम-गहन है, आवश्यक जीव संपर्क की कमी और उपयोग में आसानी इसे एक संभावित व्यवहार्य मॉडल बनाती है जिसे आम कीड़ों और संरक्षण चिंता दोनों के चयन को लक्षित करने वाले अन्य जनसंख्या आनुवंशिक अनुसंधान कार्यक्रमों पर लागू किया जा सकता है, जो हाल ही में हैच किए गए अप्सराओं या लार्वा से अवशिष्ट अंडे के मलबे को पीछे छोड़ देते हैं। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल भाषा विशेष रूप से लाइकेनिडे परिवार में तितलियों के लिए विकसित की गई थी और यहां सामुदायिक वैज्ञानिकों या अन्य व्यक्तियों (जैसे, एजेंसी जीवविज्ञानी, इंटर्न) के रूप में परिभाषित गैर-विशेषज्ञों द्वारा उपयोग के लिए सीमित एंटोमोलॉजिकल अनुभव के साथ विकसित की गई थी।
Protocol
1. सामुदायिक वैज्ञानिकों को आपूर्ति का प्रसार
- सामग्री की पूरी तालिका से परामर्श करके आवश्यक संग्रह से संबंधित आपूर्ति की पूरी सूची की सावधानीपूर्वक समीक्षा करें और इकट्ठा करें।
- यदि नमूना संग्रह कई स्थानों पर और / या कई व्यक्तियों / टीमों द्वारा किया जाएगा, तो आवश्यक सभी आपूर्ति को अलग-अलग तैनात इकाइयों में इकट्ठा और व्यवस्थित करें (चित्रा 1 और चित्रा 2)।
- क्षेत्र संग्रह के लिए जिम्मेदार सामुदायिक वैज्ञानिकों या अन्य कर्मियों को परिवहन आपूर्ति (तैनात करने योग्य इकाइयां)।
- यदि कार्मिक स्थानीय नहीं हैं, तो सावधानीपूर्वक आपूर्ति (प्रत्येक तैनात इकाई) को एक पूर्ण शिपिंग लेबल और जहाज के साथ एक अलग कार्डबोर्ड शिपिंग बॉक्स में पैक करें।
नोट: इस स्तर पर त्वरित शिपिंग की आवश्यकता नहीं है।
2. सामुदायिक वैज्ञानिक संग्रह की तैयारी
- संग्रह टैकलबॉक्स सहित संग्रह आपूर्ति की प्राप्ति पर, लैमिनेटेड आपूर्ति सूची की सावधानीपूर्वक समीक्षा करें और एक पूर्ण सूची का संचालन करें। यदि कोई आपूर्ति गायब है तो परियोजना के नेता को सूचित करें।
- 180 μL लाइसिस बफर के साथ 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को प्रीफिल करें, प्रत्येक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब पर प्रीप्रिंटेड अद्वितीय आईडी लेबल के साथ लेबल लागू करें, और सभी ट्यूबों को 64-वेल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब स्टोरेज बॉक्स में रखें। लोड होने के बाद ढक्कन को मजबूती से सुरक्षित करें।
नोट: यदि लेबल प्रिंटर उपलब्ध नहीं हैं, तो इथेनॉल-प्रूफ मार्कर का उपयोग करके प्रत्येक शीशी के किनारे और ढक्कन पर अद्वितीय आईडी नंबर लागू करें। - सुनिश्चित करें कि सभी डिजिटल उपकरण (जैसे, स्मार्टफोन या कैमरा) पूरी तरह से चार्ज होते हैं, और किसी भी अतिरिक्त बैटरी पैक की जाती है।
- एकत्र किए गए नमूनों के क्षेत्र भंडारण और स्थानीय परिवहन के लिए बर्फ के साथ आंशिक रूप से एक छोटा कूलर भरें।
- सुरक्षित परिवहन और समेकित भंडारण के लिए संग्रह टैकलबॉक्स या इसी तरह के मजबूत, मौसमरोधी कंटेनर में सभी संग्रह आपूर्ति पैक करें।
- क्षेत्र में जाने से पहले विस्तार से गैर-विनाशकारी आनुवंशिक नमूना संग्रह प्रोटोकॉल की समीक्षा करें।
नोट: क्षेत्र में अतिरिक्त मार्गदर्शन के लिए लैमिनेटेड और संघनित, सचित्र प्रोटोकॉल का उपयोग करें (पूरक चित्रा एस 1 और पूरक चित्रा एस 2)।
3. क्षेत्र में नमूना संग्रह
- फील्ड साइट पर पहुंचने पर, मौसमरोधी फ़ील्ड नोटबुक में दिन का समय, दिनांक, समग्र संपत्ति का नाम (जैसे, अपालाचिकोला राष्ट्रीय वन), विशिष्ट क्षेत्र साइट का नाम या विवरण, और यदि उपलब्ध हो तो जीपीएस रीडिंग, और उपस्थित सभी व्यक्तियों का पूरा नाम और भूमिकाएं रिकॉर्ड करने के लिए एक पेंसिल या ऑल-वेदर पेन का उपयोग करें।
- लक्षित तितली के लिए विशिष्ट लार्वा मेजबान पौधों की प्रजातियों की उपस्थिति के साथ एक उपयुक्त निवास स्थान का पता लगाएं।
नोट: संवेदनशील आवासों, पौधों की आबादी और वन्यजीवों के प्रभाव से बचने या कम करने के लिए देखभाल का उपयोग करें। इसके अलावा, साइट और नमूना संग्रह घटनाओं तक पहुंचने से पहले सभी उपयुक्त भूस्वामी अनुमतियों और / या परमिट को सुरक्षित करना सुनिश्चित करें। - स्मार्टफोन या कैमरे का उपयोग करके, सभी फ़ील्ड साइटों, नमूना संग्रह स्थानों, होस्ट पौधों और किसी भी अन्य जानकारी की विस्तृत तस्वीरें लें जो परियोजना के लिए प्रासंगिक हो सकती हैं। स्मार्टफ़ोन या अन्य कैमरों का उपयोग करें जो जीपीएस निर्देशांक रिकॉर्ड करते हैं।
नोट: फोटो जियोटैगिंग को सभी स्मार्टफोन पर सक्षम करने की आवश्यकता है। - व्यापक रूप से सभी लार्वा मेजबान पौधों के हिस्सों की खोज करें, जैसे कि पत्तियां, फूल की कलियां, फूल, या विकासशील फल, जिन्हें अंडे से निकाले गए अंडे के लिए अंडाकार (अंडे देने वाली) वयस्क मादा तितलियों द्वारा चुना जाता है। अधिकांश लाइकेनिडे के लिए, सफेद, हैच किए गए अंडे की तलाश करें, जिसके केंद्र में एक अलग छेद हो जो डोनट जैसा दिखता है जिसमें से नवजात लार्वा उभरा (चित्रा 3)। ऐसे अंडों की तलाश करें जो कुछ गहरे रंग के हों, अक्सर हरे या नीले रंग के हों, और बीच में छेद के बिना पूरी तरह से बरकरार होंगे (चित्रा 4)। प्रत्येक अंडे का बारीकी से निरीक्षण करने के लिए एक हाथ लेंस या अन्य आवर्धक उपकरण का उपयोग करें।
- एक बार जब एक हैच किए गए अंडे का पता चल जाता है, तो दोनों हाथों पर नाइट्राइल दस्ताने डालें।
- साफ, बाँझ, नुकीले बल का उपयोग करके, मेजबान पौधे से हैच किए गए अंडे को पकड़ें और धीरे से खींचें और इसे सीधे 64-वेल स्टोरेज बॉक्स से लिए गए लाइसिस बफर के साथ प्रीफिल किए गए लेबल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में रखें।
नोट: कुछ मेजबान पौधे कैरीओवर सामग्री (व्यास में 15 मिमी से छोटी) संग्रह के दौरान स्वीकार्य और सामान्य है। - साइट पर कम से कम 5 नमूने एकत्र करें (प्रत्येक में 1-20 हैच किए गए अंडे होते हैं), यदि उपलब्ध हो तो एक स्थान पर कुल >50 अंडे एकत्र करें।
नोट: यह सुनिश्चित करने में मदद करेगा कि प्रत्येक नमूना पौधे / पैच पर कम से कम कुछ ऊतक एकत्र किए जाते हैं और डीएनए (व्यक्तिगत अवलोकन) का पता लगाने की संभावना बढ़ जाती है। - प्रत्येक अंडे के संग्रह के बाद, 95% इथेनॉल की शीशी में डुबोकर या निचोड़ बोतल से 95% इथेनॉल के साथ या अल्कोहल वाइप्स का उपयोग करके फोर्स टिप्स को सावधानीपूर्वक साफ करें।
नोट: यह नमूना घटनाओं के बीच ऊतक कैरीओवर को कम करने में मदद करेगा। - यदि उपलब्ध हो, तो एक ही मेजबान पैच में कई पौधों से कई हैच किए गए अंडे (1-20 अंडे) को एक ही माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में इकट्ठा करें और ढक्कन को मजबूती से बंद करें। बड़ी जड़ी-बूटियों या लकड़ी की मेजबान प्रजातियों का उपयोग करने वाली तितली प्रजातियों के लिए, यदि मेजबान पैच सीमित हैं तो एक ही पौधे पर विभिन्न स्थानों से कई अंडे एकत्र करें।
नोट: पौधे एक ही मेजबान पैच में होते हैं यदि उनकी पत्तियां एक दूसरे को छूती हैं। यदि पौधों या पैच के बीच एक ध्यान देने योग्य भौतिक पृथक्करण है, तो इसे एक अलग नमूना माना जाना चाहिए। यदि एक अन्य ऊतक प्रकार एकत्रित करते हैं, जैसे कि लार्वा एक्सुविया या एक पैर, तो केवल एक पैर, पैर का टुकड़ा, या लार्वा एक्सुविया को माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब (प्रति व्यक्ति एक नमूना) में रखें। - सुनिश्चित करें कि सभी एकत्रित सामग्री प्रत्येक 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब के भीतर लाइसिस बफर में पूरी तरह से डूबी हुई है। यदि आवश्यक हो तो किसी भी नमूने को पुन: जमा करने के लिए एक कठिन सतह पर ट्यूब के निचले हिस्से को टैप करें।
- एक साफ डिस्पोजेबल लैब वाइप के साथ सूखने के लिए बल को पोंछें।
नोट: नमूनों के बीच क्रॉस संदूषण से बचने के लिए सावधानीपूर्वक फोर्सेस सफाई आवश्यक है। - एक नया नमूना एकत्र करते समय, उपयोग किए गए नाइट्राइल दस्ताने को छोड़ दें और उन्हें एक साफ जोड़ी के साथ बदलें।
- एक मौसमरोधक क्षेत्र नोटबुक में, नमूने के प्रकार (जैसे, अंडे, लार्वा एक्सुविया, या पैर), हैच किए गए अंडे की अनुमानित संख्या, और संग्रह जानकारी जैसे कलेक्टर नाम (ओं), तिथि, स्थान, मेजबान पौधे की प्रजातियों और किसी भी अतिरिक्त नोट्स (चित्रा 2) के साथ माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब से असाइन किए गए अद्वितीय आईडी लेबल को रिकॉर्ड करने के लिए एक पेंसिल या ऑल-वेदर पेन का उपयोग करें।
- अंडे के मलबे के नमूने के साथ बंद माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब को 64-वेल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज स्टोरेज बॉक्स में वापस रखें।
- मैदान में रहते हुए बर्फ के साथ एक कूलर में 64-वेल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज स्टोरेज बॉक्स बनाए रखें।
- साइटों के बीच सुरक्षित और समेकित भंडारण और परिवहन के लिए क्षेत्र में रहते हुए संग्रह टैकलबॉक्स में अन्य सभी संग्रह आपूर्ति बनाए रखें।
4. जब फ़ील्ड संग्रह पूरा हो जाता है
- सुनिश्चित करें कि नमूने वाले सभी माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब परिवहन के लिए बर्फ के साथ एक कूलर में 64-वेल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज स्टोरेज बॉक्स में हैं।
- सभी फ़ील्ड संग्रह आपूर्ति को संग्रह टैकलबॉक्स में वापस रखें।
- सभी नमूनों को कार्यालय या प्रयोगशाला में वापस ले जाएं और यह सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब की सावधानीपूर्वक दोबारा जांच करें कि सभी नमूना सामग्री पूरी तरह से लाइसिस बफर में डूबी हुई है।
- शिपमेंट या प्रसंस्करण तक फ्रीजर में नमूने के साथ 64-अच्छी तरह से माइक्रोसेंट्रीफ्यूज स्टोरेज बॉक्स रखें।
नोट: अल्पकालिक भंडारण के लिए -18 डिग्री सेल्सियस का औसत वाणिज्यिक फ्रीजर स्वीकार्य है। - संग्रह टूलबॉक्स में सभी आपूर्ति का सावधानीपूर्वक आकलन करें और आवश्यकतानुसार किसी को बदलें।
नोट: यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है यदि एकाधिक फ़ील्ड संग्रह ईवेंट शेड्यूल किए गए हैं. - संग्रह टैकलबॉक्स को अगले फ़ील्ड संग्रह ईवेंट तक किसी सुरक्षित स्थान पर संग्रहीत करें.
- सभी डिजिटल छवियों को डाउनलोड करें और सुनिश्चित करें कि सर्वर या क्लाउड-आधारित स्टोरेज सिस्टम पर सभी का सुरक्षित रूप से बैकअप लिया गया है।
- मूल मौसमरोधी, फ़ील्ड नोटबुक पृष्ठ, या संग्रह डेटा युक्त फ़ील्ड डेटा पत्रकों को स्कैन या फोटोग्राफ करें जब तक कि सभी जानकारी प्रोजेक्ट स्प्रेडशीट या डेटाबेस में दर्ज नहीं की जा सकती।
5. नमूने और डेटा जमा करना
- फ्रीजर से नमूने के साथ सभी 64-अच्छी तरह से माइक्रोसेंट्रीफ्यूज स्टोरेज बॉक्स निकालें।
- एक मानक शिपिंग बॉक्स में नमूने और फील्ड नोटबुक या फील्ड डेटा शीट के साथ 64-वेल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज स्टोरेज बॉक्स को सावधानीपूर्वक पैकेज करें, मूल प्रेषक के खाता संख्या के साथ प्रदान किए गए शिपिंग लेबल को संलग्न करें, और परियोजना निदेशक को एक्सप्रेस कैरियर-गारंटीकृत, रात भर, अगले दिन डिलीवरी के माध्यम से भेजें।
- पैकेज ट्रैकिंग नंबर और स्कैन किए गए नोटबुक पृष्ठों या फ़ील्ड डेटा पत्रकों की एक प्रतिलिपि प्रोजेक्ट निदेशक को ईमेल करें.
6. डीएनए निष्कर्षण
- एक बार जब 64-वेल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज स्टोरेज बॉक्स प्राप्त हो जाते हैं, तो डीएनए निष्कर्षण के लिए तैयार होने तक नमूनों में डीएनए के संरक्षण के लिए उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- प्रयोगशाला में, -20 डिग्री सेल्सियस से पिघलने के बाद लाइसिस बफर में संग्रहीत कीट ऊतक को पीसकर डीएनए निकालें। प्रोटीन के 20 μL जोड़ें और नमूने को 24 घंटे से अधिक के लिए गर्म इनक्यूबेटर में 56 डिग्री सेल्सियस पर रात भर भिगोने दें।
- विशिष्ट निर्माताकी सिफारिश के अनुसार, उपयुक्त सफाई और धुलाई बफर जोड़ें।
- बफर में निलंबित नमूने को 2 एमएल संग्रह शीशी से जुड़े स्पिन कॉलम में स्थानांतरित करें।
- सेंट्रीफ्यूज का उपयोग करके 60 सेकंड के लिए 6,021 × ग्राम पर स्पिन करें। उपयुक्त वाशिंग बफर जोड़ें और उचित रूप से स्पिन करें।
- एल्यूशन बफर (30 μL) का उपयोग करके बाध्य डीएनए जारी करें और नमूने को एक ताजा 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में घुमाएं। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
नोट: यदि डीएनए एकाग्रता 0.010 एनजी / एमएल से अधिक है तो अनुक्रमण के लिए आगे बढ़ें। ऊतक प्रकार द्वारा डीएनए एकाग्रता के लिए चित्रा 5 देखें।
7. डीएनए अनुक्रमों का डेटा विश्लेषण
- परिणामी अनुक्रमों में कम गुणवत्ता वाले बेस कॉल को ट्रिम या संपादित करें।
- प्रजातियों की पहचान की पुष्टि के लिए सार्वजनिक डेटाबेस के खिलाफ क्वेरी अनुक्रम।
- व्यक्तियों के बीच मतभेदों की तुलना के लिए अनुक्रमों को एक दूसरे से संरेखित करें।
Representative Results
पूर्वी उत्तरी अमेरिका में प्रजातियों की सीमा में नौ राज्यों से 563 नमूने एकत्र करने के लिए सामग्री आठ संरक्षण और सामुदायिक वैज्ञानिकों को भेजी गई थी। स्थानीय पीक उड़ान समय से पहले 2021 के दौरान तीन महीने में सामग्री भेजी गई थी। आज तक, हमें कुल 160 सी इरस ऊतक के नमूने प्राप्त हुए हैं जो एकत्र किए गए हैं (तालिका 1)। स्टोरर एट अल.14 द्वारा विस्तृत इस नमूना प्रकार के लिए एक प्रोटोकॉल का पालन करते हुए जीनोमिक डीएनए निकाला गया था। इन 160 नमूनों में से, डीएनए को 1.67 एनजी / 1 एल (एसई ± 2.98) की औसत एकाग्रता के साथ 88 से सफलतापूर्वक निकाला गया था, और उच्चतम डीएनए उपज 26.8 एनजी / सांद्रता को 2 μL अर्क के साथ निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक उच्च-संवेदनशीलता परख किट का उपयोग करके निर्धारित किया गया था।
जबकि प्राप्त नमूनों की कुल संख्या संग्रह के लिए तैनात सामग्रियों की कुल संख्या की तुलना में काफी कम है, यह मुख्य रूप से प्राथमिक कलेक्टर या टीम लीडर को संग्रह सामग्री की अधिकता प्रदान करने की एक कलाकृति है ताकि उन्हें वांछित होने पर कई संग्रह स्थलों और / या सामुदायिक वैज्ञानिकों को शामिल करने के लिए अधिकतम लचीलापन मिल सके। इसके अलावा, सी आईरिस एक दुर्लभ और घटती टैक्सन है जो सीमित और अक्सर अपेक्षाकृत छोटी आबादी द्वारा इसकी मौजूदा सीमा में प्रतिनिधित्व किया जाता है। इस बाधा के बावजूद, प्राप्त ऊतक नमूनों की कुल संख्या पर्याप्त है, खासकर व्यक्तिगत वयस्क तितलियों के अधिक पारंपरिक नमूने के साथ क्या उम्मीद की जाएगी।
चित्र 1: क्षेत्र संग्रह के लिए जिम्मेदार सामुदायिक वैज्ञानिकों या अन्य कर्मियों को शिपमेंट की प्रतीक्षा कर रही सभी आवश्यक आपूर्ति की व्यक्तिगत तैनाती योग्य इकाइयां। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 2: सभी आपूर्ति, स्पष्ट प्लास्टिक संग्रह टैकलबॉक्स, और क्षेत्र संग्रह के लिए जिम्मेदार सामुदायिक वैज्ञानिकों या अन्य कर्मियों को शिपमेंट की प्रतीक्षा करने वाले पूर्ण एक्सप्रेस वाहक लेबल सहित व्यक्तिगत तैनाती योग्य इकाई। कृपया इस आंकड़े के बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 3: जंगली ल्यूपिन (ल्यूपिनस पेरेनिस) पर हैच्ड फ्रॉस्टेड एल्फिन तितली (कैलोफ्रिस इरस) अंडे की तस्वीर केंद्र में एक अलग छेद दिखाती है जिसमें नवजात लार्वा उभरा था। ध्यान दें कि हैच किए गए अंडे का समग्र रंग सफेद है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 4: जंगली ल्यूपिन (ल्यूपिनस पेरेनिस) पर बिना हैच वाले फ्रॉस्टेड एल्फिन तितली (कैलोफ्रिस इरस) अंडे की तस्वीर। ध्यान दें कि अनहैच अंडे में एक ध्यान देने योग्य केंद्रीय छेद की कमी होती है और उनका समग्र रंग नीला हरा होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 5: ऊतक प्रकार द्वारा डीएनए एकाग्रता। बॉक्स मिडलाइन औसत का प्रतिनिधित्व करती है, प्रत्येक बॉक्स आईक्यूआर का विस्तार करता है, और बॉक्स मूंछें 1.5 × आईक्यूआर होती हैं, जिसमें बाहर कोई भी बिंदु आउटलायर होता है। एक अंडे के मामले वाले नमूनों में केवल एक अंडे का मामला था, और कई अंडे के मामलों वाले नमूनों में कम से कम दो मामले थे, जिनमें मामलों की संख्या प्रति नमूने 2 से 20 (औसत = 5.3) तक थी। संक्षिप्त नाम: IQR = इंटरक्वार्टाइल रेंज। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| राज्य | अंडे का मामला | अंडे के मामले | Frass | टाँग | Molt | महायोग |
| अर्कांसस | 2 | 2 | ||||
| फ्लोरिडा | 3 | 10 | 7 | 22 | 42 | |
| मिशीगन | ||||||
| न्यू हैम्पशायर | 24 | 6 | 15 | 45 | ||
| न्यूयार्क | 30 | 30 | ||||
| ओहियो | ||||||
| विस्कॉन्सिन | 9 | 5 | 5 | 19 | ||
| ओकलाहोमा | 16 | 6 | 22 | |||
| महायोग | 36 | 21 | 16 | 65 | 22 | 160 |
तालिका 1: राज्य द्वारा एकत्रित ऊतक सामग्री की संख्या और प्रकार।
पूरक चित्रा एस 1: क्षेत्र में उपयोग के लिए दो तरफा, लैमिनेटेड, संघनित और सचित्र प्रोटोकॉल का फ्रंट पेज। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
पूरक चित्रा एस 2। क्षेत्र में उपयोग के लिए दो तरफा, लैमिनेटेड, संघनित, सचित्र प्रोटोकॉल का पिछला पृष्ठ। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
Discussion
यह प्रोटोकॉल जनसंख्या आनुवंशिक संरचना या डीएनए बारकोडिंग विश्लेषण के लिए दुर्लभ तितलियों के गैर-विनाशकारी नमूने के लिए एक क्षेत्र विधि का वर्णन करता है। इस प्रोटोकॉल के समग्र लाभ विशेष रूप से सामुदायिक वैज्ञानिकों, संरक्षण चिकित्सकों और छात्रों जैसे अलग-अलग अनुभव और कौशल स्तरों के व्यक्तियों द्वारा व्यापक कार्यान्वयन को अधिकतम करने में मदद करने के लिए डिज़ाइन किए गए हैं। इनमें अपेक्षाकृत कम समग्र लागत, आसानी से प्राप्त आपूर्ति और उपकरण, कई अत्यधिक जटिल चरणों के बिना एक सरल और सुलभ विधि और एक व्यापक भौगोलिक क्षेत्र पर आसान तैनाती शामिल है। यह अवशिष्ट कार्बनिक पदार्थ को भी लक्षित करता है जो अस्थायी रूप से पकड़ने या हेरफेर करने की आवश्यकता को समाप्त करता है, और इस प्रक्रिया में, आनुवंशिक नमूने प्राप्त करने के लिए जीवित जीवों को संभावित रूप से नुकसान पहुंचाता है। इसके अलावा, यह पारंपरिक फेनोलॉजी या किसी विशेष जीवन स्तर के जीवनकाल से परे नमूना संग्रह के लिए उपलब्ध संभावित अवधि का विस्तार करता है, नमूना संख्याओं को अधिकतम करने में मदद करने के लिए लचीलापन और समग्र संग्रह के अवसर को बढ़ाता है।
जबकि इस प्रयास के लिए फोकल टैक्सन फ्रॉस्टेड एल्फिन तितली था, जो एक व्यापक लेकिन घटते आवास विशेषज्ञ थे, इस प्रोटोकॉल को संरक्षण चिंता सहित कई अन्य कीड़ों पर अधिक व्यापक रूप से लागू किया जा सकता है। इसी तरह, जबकि प्रोटोकॉल आनुवंशिक सामग्री के स्रोत के रूप में हैच किए गए अंडे के संग्रह को लक्षित करता है, इसे आसानी से अन्य, संभावित रूप से अधिक पारंपरिक नमूनों (जैसे, पैर, पंख के टुकड़े, एंटीनल क्लिप) या यहां तक कि पूरे जीवों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। हालांकि, यह पहलू प्रोटोकॉल की एक संभावित सीमा भी है। यद्यपि अधिकांश चरणों को अपेक्षाकृत सरल और त्वरित रूप से पूरा करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, हैच अंडे के लिए लार्वा मेजबान पौधों के व्यापक रूप से खोज पैच, जो व्यक्तिगत रूप से आमतौर पर <1.0 मिमी व्यास के होते हैं, समय और श्रम-गहन हैं। बहरहाल, इस तरह की व्यापक नमूना गतिविधि विशेष रूप से सामुदायिक वैज्ञानिकों जैसे प्रतिभागियों के एक बड़े नेटवर्क के लिए आदर्श है।
अन्य क्षेत्र-आधारित परियोजनाओं के साथ, सावधानीपूर्वक तैयारी आवश्यक है। इसमें यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक आपूर्ति की पूरी सूची का संचालन करना शामिल है कि कोई आइटम गायब नहीं है, कोई आवश्यक तैयारी कार्य पूरा हो गया है, और वे अच्छी तरह से व्यवस्थित, सुरक्षित रूप से पैक किए गए हैं, और क्षेत्र तैनाती के लिए तैयार हैं। इसके अलावा, सभी क्षेत्र कर्मियों, विशेष रूप से ऊतक संग्रह का संचालन करने वालों को किसी भी संग्रह घटना से पहले संग्रह प्रोटोकॉल की विस्तार से समीक्षा करनी चाहिए और परियोजना की देखरेख करने वाले व्यक्तियों को किसी भी प्रश्न को संबोधित करना चाहिए। एक बार क्षेत्र में, प्रोटोकॉल के नमूना संग्रह भाग को विस्तार से सावधानीपूर्वक ध्यान देने की आवश्यकता होती है। इसमें यह सुनिश्चित करने के लिए किसी भी ओवा का पता लगाना और सावधानीपूर्वक निरीक्षण करना शामिल है कि वे हैच किए गए हैं और इस प्रकार संग्रह के लिए उपयुक्त हैं, पूरी तरह से सफाई करना, नमूना घटनाओं के बीच ऊतक कैरीओवर को कम करने में मदद करने के लिए दस्ताने को बदलना, और यह सुनिश्चित करना कि ऊतक के नमूने प्रत्येक 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब के भीतर लाइसिस बफर में पूरी तरह से डूबे हुए हैं। अंत में, सटीक और विस्तृत डेटा रिकॉर्ड करना आवश्यक है, जिसमें माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब से असाइन किए गए अद्वितीय आईडी लेबल को विशिष्ट नमूने और अन्य सभी प्रासंगिक संग्रह जानकारी के साथ जोड़ना शामिल है। हालांकि यह कदम वैज्ञानिक अनुसंधान में नियमित है, इसे अक्सर सामुदायिक विज्ञान दर्शकों के लिए पूरी तरह से स्पष्ट और प्रबलित करने की आवश्यकता होती है।
यहां, हम छोटे, दुर्लभ और खतरे वाली प्रजातियों से गैर-घातक नमूना संग्रह के लिए सामुदायिक वैज्ञानिकों के संभावित लाभ का प्रदर्शन करते हैं। हालांकि, किसी भी परिणामी आनुवंशिक डेटा का विश्लेषण करते समय ध्यान में रखने के लिए कुछ संभावित सीमाएं हैं। उदाहरण के लिए, जबकि एक ही पैच से नमूने पूल करने से पता लगाने के लिए पर्याप्त डीएनए पुनर्प्राप्त करने की संभावना बढ़ जाती है, यह संभावित रूप से हेटरोजाइगोसिटी का भी परिचय देता है। इसके अलावा, जैसा कि प्रोटोकॉल में हैच ओवे से कोरियन एकत्र करना शामिल है, केवल मादा तितलियों, माता-पिता के डीएनए का प्रतिनिधित्व करते हुए, आबादी के भीतर नमूना लिया जा सकता है। बहरहाल, जैसा कि सी इरस के लिए कोई पिछला जनसंख्या-स्तरीय आनुवंशिक डेटा उपलब्ध नहीं था, परिणामस्वरूप प्राप्त अंतर्दृष्टि केवल प्रजातियों के संरक्षण और प्रबंधन को लाभ पहुंचा सकती है। उदाहरण के लिए, जबकि जनसंख्या संरचना का पर्याप्त रूप से आकलन करने के लिए एक गहन, विस्तृत अध्ययन डिजाइन और सावधानीपूर्वक मार्कर चयन की आवश्यकता होगी, यहां उल्लिखित नमूना प्रोटोकॉल और साइटोक्रोम सी ऑक्सीडेज सबयूनिट 1 (सीओ 1) डीएनए बारकोडिंग का उपयोग दुर्लभ या संकटग्रस्त टैक्सा की घटना का पता लगाने के लिए किया जा सकता है। यहां वर्णित गैर-घातक नमूने से डीएनए अनुक्रमण की उपयोगिता और अनुप्रयोग की अतिरिक्त चर्चा स्टोरर एट द्वारा विस्तृत है। अल.14.
आनुवंशिक विश्लेषण के लिए नमूने एकत्र करने के प्राथमिक लक्ष्य से परे, प्रोटोकॉल यह भी जोर देता है कि प्रतिभागी सभी क्षेत्र स्थलों, संग्रह स्थानों, लार्वा मेजबान पौधों की विस्तृत डिजिटल तस्वीरें लेते हैं, और आसपास के निवास स्थान के किसी भी अन्य तत्व जो प्रासंगिक हो सकते हैं। इस तरह के प्रलेखन एक सामान्य निवास मूल्यांकन प्रदान करने में मदद करते हैं जो मौजूदा साइट स्थितियों जैसे प्लांट फेनोलॉजी, मेजबान संसाधन घनत्व और प्रबंधन इतिहास (जैसे, हाल ही में निर्धारित आग) को चित्रित करने के लिए उपयोगी है। ऐसी जानकारी विशेष रूप से उन परियोजनाओं के लिए उपयोगी है जहां अधिक विस्तृत पर्यावरणीय तुलना को सक्षम करने के लिए व्यापक अस्थायी अवधि में क्षेत्र के नमूने लिए जाते हैं।
अंत में, जैसा कि वैश्विक कीट गिरावट में तेजी जारी है, विस्तारित प्रजातियों के मूल्यांकन और निगरानी प्रयासोंकी गंभीर रूप से आवश्यकता है। सामुदायिक वैज्ञानिकों, छात्रों (जैसे, अमेरिकी मछली और वन्यजीव सेवा इंटर्न और अध्येताओं) और संरक्षण चिकित्सकों से अधिक व्यापक भागीदारी जुड़ाव का उपयोग डीएनए नमूनों सहित कई प्रकार के व्यापक डेटा संग्रह के लिए तेजी से व्यवहार्य विकल्प प्रदान करता है। तदनुसार, इस प्रोटोकॉल से उत्पन्न डेटा के कई संभावित उपयोग हैं। इनमें संरक्षण कार्यों (जैसे, योजना, वसूली और प्रबंधन) को सूचित करने में मदद करना, निर्णय या प्रजातियों की स्थिति के आकलन को सूचीबद्ध करना, और पारिस्थितिक, जनसंख्या और वर्गीकरण अनुसंधान शामिल हैं।
Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।
Acknowledgments
लेखक डेविड कुथेरेल, अमांडा डिलन, स्टीव फुलर, नील गिफोर्ड, हेदी होल्मन, डीन जू, सैली जू, डैनियल कैनेडी, जेनेवीव कोज़क, रेबेका लोंगेनेकर, मॉरीन मैकक्लंग, मैट मोरन, रॉबिन निवर, ब्रेंडा स्मिथ, हंटर ट्रोवब्रिज और जेसप वीचेल्ट को परियोजना के विभिन्न पहलुओं में मदद के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं, जिसमें रसद, समन्वय, अनुमति और / या नमूना संग्रह शामिल हैं। इस शोध को वन्यजीव प्रबंधन संस्थान (अनुदान एसए 2021-01) द्वारा प्रशासित अमेरिकी मछली और वन्यजीव सेवा (संघीय पुरस्कार पहचान संख्या एफ 20एसी 00356) से अनुदान के माध्यम से वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 quart Igloo Playmate Cooler | Amazon | NA | portable cooler Amount per deployable unit: 1 cooler |
| 250 DNeasy Mini Spin Columns, Proteinase K, Buffers, Collection Tubes (2 mL) | Qiagen | 69506 | Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit Amount per deployable unit: NA |
| Andwin Scientific Supplier Diversity Partner LAB MARKERS BLACK | FisherSci | NC9280166 | ethanol proof lab marker Amount per deployable unit: 2 markers |
| Cardboard shipping box | shipping box Amount per deployable unit: as needed |
||
| Eisco Polyethylene Wash Bottles, LDPE | FisherSci | S14091 | lab grade spray or squirt bottle (for ethanol or alcohol) Amount per deployable unit: 1 bottle |
| FedEx U.S. express airbill | FedEx | NA | shipping return label Amount per deployable unit: 2 labels |
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | FisherSci | NC9386261 | sterile 1.5 mL microcentrifuge tubes Amount per deployable unit: 128 tubes |
| Forceps, #4a, very fine yet extra strong tips (33 mm), 4-3/8" (111 mm) long | Bioquip | 4523 | straight tip forceps Amount per deployable unit: 2 straight forceps |
| Forceps, #7, curved tips (13 mm), very fine points, 4-1/2" (114 mm) long | Bioquip | 4527 | curved tip forceps Amount per deployable unit: 2 curved forceps |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply | FisherSci | 06-666A | kimwipes (or other sterile wipe) Amount per deployable unit: 1 box |
| Laminated Illustrated field collection protocol | NA | NA | abbreviated protocol Amount per deployable unit: 1 protocol |
| Laminated list of materials | NA | NA | supply list Amount per deployable unit: 1 list |
| Lily Sugar 'N Cream The Original Solid Yarn, 2.5 oz, Medium 4 Gauge, 100% Cotton - Hot Pink - Machine Wash & Dry | Amazon | NA | pink yarn (to secure to forceps for visibility) Amount per deployable unit: 2 yards |
| Loupe by Bausch & Lomb, 10x Coddington Magnifier | Amazon | NA | hand lens Amount per deployable unit: 2 hand lenses |
| MyGift Clear Plastic 2-Tier Trays Craft Supply Storage Box/First Aid Carrying Case w/Top Handle & Latch Lock | Amazon | NA | supply storage box Amount per deployable unit: 1 box |
| Nitrile, Disposable Gloves, L, Powder-Free, 2.8 mil Palm Thickness | Grainger | 60NU14 | nitrile lab gloves (large) Amount per deployable unit: 1 box |
| Nitrile, Disposable Gloves, M, Powder-Free, 2.8 mil Palm Thickness | Grainger | 60NU13 | nitrile lab gloves (medium) Amount per deployable unit: 1 box |
| Qiagen, Inc. BUFFER ATL (200 ML) | Qiagen | 19076 | Qiagen ATL lysis buffer Amount per deployable unit: 180 µl/tube; 128 tubes |
| Rite In The Rain Weatherproof Side Spiral Notebook, Yellow Cover, Universal Page Pattern (No. 373-MX), 11 x 8.75 x 0.5 | Amazon | NA | weatherproof field notebook Amount per deployable unit: 1 notebook |
| Showgard Professional Stamp Tongs 6" 904 Round Tip Tweezers | Amazon | NA | 6" spade tip forceps Amount per deployable unit: 2 long spade forceps |
| Texwipe PolySat Pre-Wetted Wipers | FisherSci | 18-366-231 | alcohol wipes Amount per deployable unit: 100 wipes |
| Thermo Scientific CryoBoxes | FisherSci | 12-565-227 | 64 well microcentrifuge tubes collection/storage boxes Amount per deployable unit: 2 boxes |
| packing material Amount per deployable unit: as needed |
References
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