Summary
Her presenterer vi en enkel protokoll for ikke-invasiv genetisk prøvetaking av sommerfuglpopulasjoner basert på feltinnsamling av gjenværende eggrester. Den kan brukes til å bekrefte artsidentitet og kvantifisere genetisk variasjon. Denne protokollen kan enkelt tilpasses bredere grupper for samfunnsvitenskapelig engasjement.
Abstract
Globale insektnedganger fortsetter å akselerere. Effektiv genetisk prøvetaking er kritisk nødvendig for å fremme forståelsen av mange taxa og adressere eksisterende kunnskapshull. Denne protokollen representerer en demonstrert metode for ikke-destruktiv prøvetaking av sjeldne sommerfugler for populasjonsgenetisk struktur eller DNA-strekkodingsanalyser. Den bruker korionen av klekket sommerfuglovae for å gi tilstrekkelig høy mengde og kvalitets-DNA for vellykket gensekvensering for å bekrefte artsidentitet og kvantifisere genetisk variasjon. Det kan være spesielt nyttig når andre vevsprøvetakingsteknikker er upraktiske eller utilgjengelige. Selv om den er utviklet for en lepidopteran, kan den likevel lett tilpasses for bruk med andre insektarter. Den ble spesielt designet med brukervennlighet som et mål å bidra til å maksimere bred implementering av personer med varierende erfaring og ferdighetsnivå, for eksempel samfunnsforskere, bevaringsutøvere og studenter, og for bruk over store geografiske områder for å lette bred befolkningsprøvetaking. Dataene som genereres kan bidra til å informere taksonomiske og noteringsbeslutninger, bevarings- og forvaltningshandlinger og forbedre grunnleggende økologisk forskning.
Introduction
Effektiv populasjonsgenetisk prøvetaking av sjeldne, synkende og / eller oppførte insektskatta er ofte kritisk for å bidra til å informere bevarings- og forvaltningshandlinger. Dødelige eller skadelige vevsprøvetakingsmetoder brukes rutinemessig for mange genetiske analyser. Disse metodene er imidlertid uønskede eller ikke tillatt fordi de kan forårsake skade på sårbare eksisterende populasjoner eller påvirke atferd og kondisjon negativt. Ulike ikke-dødelige eller ikke-invasive prøvetakingsteknikker som involverer vev som hele ben, antenne- eller vingeklipp, larveeksuviae eller hemolymfe fra defensive sekreter og andre produkter, som frass, har vært egnet for insektgenetisk forskning 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Den generelle gjennomførbarheten og anvendeligheten av disse forskjellige vevsprøvetakingsteknikkene varierer betydelig basert på biologi, økologi, oppførsel, størrelse og sjeldenhet av fokalorganismen, situasjonen og individene som samler materialet. For eksempel krever hele ben eller appendage klipping midlertidig fangst og forsiktig håndtering av flere personer i et passende livsstadium, vanligvis av erfarent personell. På samme måte vil vevskilder, som larve exuviae eller frass, sannsynligvis bare være praktiske hvis organismene er i fangenskap eller midlertidig holdt i en tilstrekkelig periode.
For forskningsspørsmål som stilles på befolkningsnivå, for eksempel spørsmål om potensiell taksonomisk differensiering eller genetisk struktur, er det ofte nødvendig med prøvetaking på bredere tidsmessig eller geografisk skala (dvs. regional eller kontinental). Som et resultat kan visse ikke-invasive vevskilder være helt upraktiske eller i det minste ineffektive å samle i mengde. Prøvetaking på slike skalaer kan i tillegg være logistisk eller økonomisk upraktisk eller uoverkommelig for enkeltforskere eller enda mindre feltteam å gjennomføre. Mens direkte engasjement fra samfunnsforskere i økende grad har blitt vedtatt av forskningsmiljøet for å bidra til å løse mange av disse utfordringene og akselerere stor datadrevet innsamling, har adopsjon vært begrenset for studier som involverer ikke-destruktiv, ikke-invasiv eller eDNA-prøvetaking10,11,12.
For å bidra til å overvinne noen av disse potensielle begrensningene, viste vi at korionen fra klekket sommerfuglovae kunne gi tilstrekkelig høy mengde og kvalitets-DNA for vellykket gensekvensering for å bekrefte artsidentitet og kvantifisere genetisk variasjon. Vi testet deretter ulike innsamlingsprotokoller ved hjelp av denne teknikken13. Dette pilotarbeidet tjente som grunnlag for videre metodisk forbedring. Dette papiret beskriver i detalj den resulterende enkle, men omfattende reviderte feltsamlingsprotokollen som ble rullet ut for samfunnsforskere og annet ikke-ekspertpersonell. Denne protokollen er en del av en populasjonsstrukturanalyse av den frostede elfinsommerfuglen (Callophrys irus) for å bidra til å informere fremtidige bevaringsaksjoner og en føderal bestemmelse av muligens notering i henhold til US Endangered Species Act. Selv om det potensielt er mer arbeidskrevende enn noen ikke-invasive metoder, gjør mangelen på nødvendig organismekontakt og brukervennlighet det til en potensielt levedyktig modell som kan brukes på andre populasjonsgenetiske forskningsprogrammer rettet mot et utvalg av både vanlige insekter og bevaringsproblemer, som etterlater gjenværende eggrester fra nylig klekkede nymfer eller larver. Protokollspråket som presenteres her ble spesielt utviklet for sommerfugler i familien Lycaenidae og for bruk av ikke-eksperter definert her som samfunnsforskere eller andre individer (f.eks. Byråbiologer, praktikanter) med begrenset entomologisk erfaring.
Protocol
1. Formidling av forsyninger til samfunnsforskere
- Gå nøye gjennom og samle den fullstendige listen over innsamlingsrelaterte forsyninger som trengs ved å konsultere hele materialtabellen.
- Hvis prøveinnsamlingen skal foregå på flere steder og/eller av flere personer/team, samler og organiserer du alle forsyninger som trengs i separate deployerbare enheter (figur 1 og figur 2).
- Transport forsyninger (deployerbare enheter) til samfunnsforskere eller annet personell som er ansvarlig for feltinnsamling.
- Hvis personalet ikke er lokalt, pakk forsiktig forsyninger (hver deployerbar enhet) i en separat pappforsendelseseske med en komplett fraktetikett og sende.
MERK: Rask levering er ikke nødvendig på dette stadiet.
2. Forberedelse av samfunnsforskersamling
- Ved mottak av innsamlingsforsyninger, inkludert innsamlingstakleboksen, må du nøye gjennomgå den laminerte forsyningslisten og gjennomføre en full beholdning. Gi beskjed til prosjektleder hvis det mangler forsyninger.
- Fyll 1,5 ml mikrosentrifugerør med 180 μL lysisbuffer, påfør etiketter med en forhåndstrykt unik ID-etikett på hvert mikrosentrifugerør, og plasser alle rørene i oppbevaringsboksen med 64-brønns mikrosentrifugerør. Fest lokket godt etter lasting.
MERK: Hvis etikettskrivere ikke er tilgjengelige, påfør unike ID-numre på siden og lokket på hvert hetteglass ved hjelp av en etanolsikker markør. - Sørg for at alt digitalt utstyr (f.eks. smarttelefon eller kamera) er fulladet, og at eventuelle reservebatterier er pakket.
- Fyll delvis en liten kjøler med is for feltlagring og lokal transport av de innsamlede prøvene.
- Pakk alle innsamlingsrekvisita i innsamlingsutstyret eller lignende solid, værbestandig beholder for sikker transport og konsolidert lagring.
- Gjennomgå den ikke-destruktive genetiske prøveinnsamlingsprotokollen i detalj før du går inn i feltet.
MERK: Bruk den laminerte og kondenserte, illustrerte protokollen for ytterligere veiledning i feltet (tilleggsfigur S1 og tilleggsfigur S2).
3. Prøveinnsamling i feltet
- Når du ankommer feltområdet, bruk en blyant eller allværspenn for å registrere i den værbestandige feltnotatboken tidspunktet på dagen, datoen, det generelle eiendomsnavnet (f.eks. Apalachicola National Forest), spesifikt feltstedsstedsnavn eller beskrivelse, og GPS-lesing hvis tilgjengelig, og fullt navn og roller til alle personer som er til stede.
- Finn et passende habitat med tilstedeværelse av larvalvert plantearter som er spesifikke for målfuglen.
MERK: Vær forsiktig for å unngå eller minimere påvirkning på følsomme habitater, plantepopulasjoner og dyreliv. I tillegg må du sørge for å sikre alle passende grunneiertillatelser og / eller tillatelser før du får tilgang til et nettsted og prøveinnsamlingshendelser. - Bruk en smarttelefon eller et kamera til å ta detaljerte bilder av alle feltsteder, prøveinnsamlingssteder, vertsplanter og annen informasjon som kan være relevant for prosjektet. Bruk smarttelefoner eller andre kameraer som registrerer GPS-koordinater.
MERK: Photo Geotagging må være aktivert på alle smarttelefoner. - Omfattende søk i alle larvevertsplantedelene, for eksempel blader, blomsterknopper, blomster eller utvikling av frukt, kjent for å bli valgt ved ovipositing (egglegging) voksne kvinnelige sommerfugler for klekkede egg. For de fleste Lycaenidae, se etter hvite, klekkede egg med et tydelig hull i midten som ligner en smultring som den nyfødte larven dukket opp fra (figur 3). Se etter uklipte egg som er noe mørkere i fargen, ofte grønne eller blålige, og vil være helt intakte uten hull i midten (figur 4). Bruk en håndlinse eller annen forstørrelsesenhet for å inspisere hvert egg nøye.
- Når et klekket egg er funnet, legg nitrilhansker på begge hender.
- Bruk ren, steril, spiss tang, grip og trekk forsiktig det klekkede egget av vertsplanten og legg det direkte inn i et merket mikrosentrifugerrør som er forhåndsfylt med lysisbuffer tatt fra oppbevaringsboksen med 64 brønner.
MERK: Noe vertsplanteoverføringsmateriale (mindre enn 15 mm i diameter) er akseptabelt og normalt under innsamling. - Samle minst totalt 5 prøver per vertsplanteplaster / sted (hver inneholder 1-20 klekkede egg), med sikte på > 50 egg totalt på et sted hvis tilgjengelig.
MERK: Dette vil bidra til å sikre at minst noe vev samles inn ved hver prøveplante / og øke sjansene for å oppdage DNA (personlig observasjon). - Etter hver egginnsamling, rengjør tangspissene forsiktig ved å dyppe dem i et hetteglass med 95% etanol eller ved å dousing med 95% etanol fra en klemmeflaske eller ved å bruke alkoholservietter.
MERK: Dette vil bidra til å minimere vevsoverføring mellom prøvetakingshendelser. - Hvis tilgjengelig, samle flere klekkede egg (1-20 egg) fra flere planter i samme vertsplaster i et enkelt mikrosentrifugerør og lukk lokket godt. For sommerfuglarter som bruker større urteaktige eller treaktige vertsarter, samle flere egg fra forskjellige steder på samme plante hvis vertsplaster er begrenset.
MERK: Planter er i samme vertsplaster hvis bladene berører hverandre. Hvis det er en merkbar fysisk separasjon mellom planter eller flekker, bør dette betraktes som en annen prøve. Hvis du samler en annen vevstype, for eksempel larve exuviae eller et enkelt ben, plasser bare et enkelt ben, benfragment eller larve exuvia i et mikrocentrifugerør (en prøve per person). - Forsikre deg om at alt oppsamlet materiale er helt nedsenket i lysebufferen i hvert 1,5 ml mikrosentrifugerør. Trykk på bunnen av det aktuelle røret på en hard overflate for å senke eventuelle prøver om nødvendig.
- Tørk tangen til tørk med en ren engangs laboratorieserviett.
MERK: Forsiktig rengjøring av tang er viktig for å unngå krysskontaminering mellom prøvene. - Når du samler inn en ny prøve, kast brukte nitrilhansker og erstatt dem med et rent par.
- I en værbestandig feltnotatbok bruker du en blyant eller allværspenn for å registrere den unike ID-etiketten som er tildelt fra mikrosentrifugerøret sammen med typen prøve (f.eks. egg, larve exuviae eller ben), omtrentlig antall klekkede egg og innsamlingsinformasjon som samlernavn (er), dato, plassering, vertsplantearter og eventuelle tilleggsnotater (figur 2).
- Plasser det lukkede mikrosentrifugerøret med eggrestprøve tilbake i lagringsboksen med 64-brønns mikrosentrifuge.
- Oppretthold oppbevaringsboksen med 64-brønners mikrosentrifuger i en kjøler med is mens du er i felten.
- Vedlikehold alle andre innsamlingsforsyninger i innsamlingstakleboksen mens du er i felten for sikker og konsolidert lagring og transport mellom steder.
4. Når feltinnsamlingen er fullført
- Sørg for at alle mikrosentrifugerør som inneholder prøver er i lagerboksen med 64-brønns mikrosentrifuge i en kjøler med is for transport.
- Plasser alle feltinnsamlingsrekvisita tilbake i samlingstakleboksen.
- Transport alle prøver tilbake til kontoret eller laboratoriet og dobbeltsjekk nøye hvert mikrosentrifugerrør for å sikre at alt prøvemateriale er helt nedsenket i lysisbufferen.
- Plasser lagringsboksen med 64-brønners mikrosentrifuge med prøver i en fryser til forsendelse eller behandling.
MERK: En gjennomsnittlig kommersiell fryser på -18 °C er akseptabelt for kortvarig lagring. - Vurder nøye alle forsyninger i innsamlingsverktøykassen og bytt ut etter behov.
MERK: Dette er spesielt viktig hvis flere feltsamlingshendelser er planlagt. - Oppbevar samlingstakleboksen på et sikkert sted til neste feltsamlingshendelse.
- Last ned alle digitale bilder og sørg for at alle er sikkerhetskopiert sikkert på en server eller et skybasert lagringssystem.
- Skann eller fotografer de opprinnelige værbestandige, feltnotatblokksidene eller feltdatabladene som inneholder innsamlingsdata, til all informasjon kan legges inn i et prosjektregneark eller en database.
5. Sende inn prøver og data
- Fjern alle 64-brønns mikrocentrifuge oppbevaringsbokser med prøver fra fryseren.
- Pakk forsiktig de 64-brønns mikrosentrifuge-oppbevaringsboksene med prøver og feltnotatboken eller feltdatabladene i en standard frakteske, fest den medfølgende fraktetiketten med den opprinnelige avsenderens kontonummer, og send via ekspressoperatør-garantert, over natten, neste dag levering til prosjektdirektøren.
- Send pakkesporingsnummeret og en kopi av de skannede notatblokksidene eller feltdatabladene til prosjektdirektøren via e-post.
6. DNA-ekstraksjon
- Når de 64-brønns mikrocentrifuge lagringsboksene er mottatt, lagre dem ved -20 ° C for bevaring av DNA i prøver til de er klare for DNA-ekstraksjon.
- I laboratoriet trekker man ut DNA ved å male insektvev lagret i lysisbuffer etter tining fra -20 °C. Tilsett 20 μL proteinase K og la prøven trekke over natten ved 56 ° C i en oppvarmet inkubator i ikke mer enn 24 timer.
- Legg til passende rengjørings- og vaskebuffere, i henhold til den spesifikke produsentens anbefaling13.
- Overfør prøven suspendert i buffer til en spinnkolonne festet til et 2 ml oppsamlingshetteglass.
- Spinn ned ved 6,021 × g i 60 s ved hjelp av en sentrifuge. Legg til passende vaskebuffere og spinn ned på riktig måte.
- Frigjør bundet DNA ved hjelp av unnvikelsesbuffer (30 μL) og spinn ned prøven til et nytt 1,5 ml mikrosentrifugerør. Oppbevares ved -20 °C.
MERK: Fortsett til sekvensering hvis DNA-konsentrasjonen overstiger 0,010 ng / ml. Se figur 5 for DNA-konsentrasjon etter vevstype.
7. Dataanalyse av DNA-sekvenser
- Trim eller rediger basekall av lav kvalitet i resulterende sekvenser.
- Spørringssekvenser mot offentlige databaser for bekreftelse av artsidentifikasjon.
- Juster sekvenser til hverandre for sammenligning av forskjeller mellom individer.
Representative Results
Materialer for innsamling av opptil 563 prøver ble sendt til åtte bevarings- og samfunnsforskere fra ni stater over artsområdet i østlige Nord-Amerika. Materiell ble sendt ut over tre måneder i løpet av 2021 før lokale rushtider. Til nå har vi mottatt totalt 160 C. irus vevsprøver som er samlet inn (tab 1). Genomisk DNA ble ekstrahert etter en protokoll for denne prøvetypen beskrevet av Storer et al.14. Av disse 160 prøvene ble DNA vellykket ekstrahert fra 88 med en gjennomsnittlig konsentrasjon på 1,67 ng / μL (SE ± 2,98), og det høyeste DNA-utbyttet var 26,8 ng / μL. Konsentrasjonene ble kvantifisert ved hjelp av et høysensitivt analysesett i henhold til produsentens instruksjoner med 2 μL ekstrakt.
Mens det totale antallet mottatte prøver er vesentlig lavere enn det totale antallet materialer som er distribuert for innsamling, er dette hovedsakelig en artefakt for å gi en overflod av samlingsmaterialer til den primære samleren eller teamlederen for å gjøre det mulig for dem å ha maksimal fleksibilitet for å inkludere flere innsamlingssteder og / eller samfunnsforskere involvert om ønskelig. Videre er C. iris et sjeldent og fallende takson representert av begrensede og ofte relativt små populasjoner i hele sitt eksisterende utbredelsesområde. Til tross for denne begrensningen er det totale antallet mottatte vevsprøver betydelig, spesielt sammenlignet med det som forventes med en mer tradisjonell prøvetaking av individuelle voksne sommerfugler.
Figur 1: Individuelle deployerbare enheter av alle nødvendige forsyninger som venter på forsendelse til samfunnsforskere eller annet personell som er ansvarlig for feltinnsamling. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Individuell deployerbar enhet inkludert alle forsyninger, klar plastinnsamlingstakleboks og utfylt ekspressbæreretikett som venter på forsendelse til samfunnsforskere eller annet personell som er ansvarlig for feltinnsamling. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Bilde av klekket frostet elfin sommerfugl (Callophrys irus) egg på vill lupin (Lupinus perennis) som viser et tydelig hull i midten som den nyfødte larven kom fra. Legg merke til at den generelle fargen på det klekkede egget er hvitt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Bilde av uklekkede klekkede frostede elfinsommerfugler (Callophrys irus) egg på vill lupin (Lupinus perennis). Legg merke til at uklipte egg mangler et merkbart sentralt hull, og at deres generelle farge er blågrønn. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: DNA-konsentrasjon etter vevstype. Boksen midtlinjer representerer medianen, hver boks utvider IQR, og boksen whiskers er 1,5 × IQR, med eventuelle poeng utenfor å være outliers. Prøver som inneholdt en enkelt eggkasse hadde bare ett eggtilfelle, og prøver som inneholdt flere eggkasser hadde minst to tilfeller, med antall tilfeller fra 2 til 20 (gjennomsnitt = 5,3) per prøve. Forkortelse: IQR = interkvartilområde. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Tilstand | Egg-saken | Egg tilfeller | Frass | Bein | Molt | Totalsum |
| Arkansas | 2 | 2 | ||||
| Florida | 3 | 10 | 7 | 22 | 42 | |
| Michigan | ||||||
| New Hampshire | 24 | 6 | 15 | 45 | ||
| Oslo | 30 | 30 | ||||
| Ohio | ||||||
| Wisconsin | 9 | 5 | 5 | 19 | ||
| Oklahoma | 16 | 6 | 22 | |||
| Totalsum | 36 | 21 | 16 | 65 | 22 | 160 |
Tabell 1: Antall og type vevsmateriale samlet inn etter stat.
Tilleggsfigur S1: Forsiden av tosidig, laminert, kondensert og illustrert protokoll til bruk i felt. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur S2. Bakside av tosidig, laminert, kondensert, illustrert protokoll til bruk i felt. Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Denne protokollen beskriver en feltmetode for ikke-destruktiv prøvetaking av sjeldne sommerfugler for populasjonsgenetisk struktur eller DNA-strekkodingsanalyser. De generelle fordelene med denne protokollen er spesielt utviklet for å bidra til å maksimere bred implementering av personer med varierende erfaring og ferdighetsnivå som samfunnsforskere, bevaringsutøvere og studenter. Disse inkluderer relativt lave totalkostnader, forsyninger og utstyr som er enkle å anskaffe, en enkel og tilgjengelig metode uten mange altfor komplekse trinn, og enkel distribusjon over et bredt geografisk område. Det retter seg i tillegg mot gjenværende organisk materiale som eliminerer behovet for midlertidig å fange eller manipulere, og i prosessen potensielt skade levende organismer for å skaffe genetiske prøver. Videre utvider det den potensielle perioden som er tilgjengelig for prøveinnsamling utover den tradisjonelle fenologien eller levetiden til et bestemt livsstadium, og forbedrer fleksibiliteten og den generelle innsamlingsmuligheten for å maksimere utvalgstallene.
Mens fokustaksonet for denne innsatsen var den frostede elfinsommerfuglen, en utbredt, men avtagende habitatspesialist, kan denne protokollen brukes bredere på mange andre insekter, inkludert de av bevaringsbekymring. På samme måte, mens protokollen retter seg mot innsamling av klekkede egg som kilde til genetisk materiale, kan den lett tilpasses andre, potensielt mer tradisjonelle prøver (f.eks. Ben, vingefragmenter, antenneklemmer) eller til og med hele organismer. Dette aspektet er imidlertid også en potensiell begrensning av protokollen. Selv om de aller fleste trinnene er designet for å være relativt enkle og raske å oppnå, er det tids- og arbeidskrevende å søke flekker av larvevertsplanter for klekkeegg, som hver for seg vanligvis er <1,0 mm i diameter. Ikke desto mindre er en så omfattende prøvetakingsaktivitet spesielt ideell for et større nettverk av deltakere som samfunnsforskere.
Som med andre feltbaserte prosjekter er det viktig med nøye forberedelser. Dette inkluderer å gjennomføre en full oversikt over forsyningene som trengs for å sikre at ingen varer mangler, alt nødvendig forberedelsesarbeid er fullført, og de er godt organisert, sikkert pakket og klare for feltdistribusjon. I tillegg bør alt feltpersonell, spesielt de som utfører vevsinnsamlingen, gjennomgå innsamlingsprotokollen i detalj før en innsamlingshendelse og ta opp eventuelle spørsmål til enkeltpersoner som fører tilsyn med prosjektet. Når du er i feltet, krever prøveinnsamlingsdelen av protokollen nøye oppmerksomhet på detaljer. Dette inkluderer å lokalisere og nøye inspisere eventuelle ovae for å sikre at de klekkes ut og dermed er egnet for oppsamling, grundig rengjøring av tang, utskifting av hansker for å redusere vevsoverføring mellom prøvetakingshendelser, og sikre at vevsprøver er helt nedsenket i lysisbuffer innenfor hvert 1,5 ml mikrosentrifugerør. Til slutt er det viktig å registrere nøyaktige og detaljerte data, som inkluderer kobling av den unike ID-etiketten som er tildelt fra mikrosentrifugerøret sammen med den spesifikke prøven som er tatt og all annen relevant innsamlingsinformasjon. Selv om dette trinnet er rutine i vitenskapelig forskning, må det ofte avklares grundig og forsterkes for et samfunnsvitenskapelig publikum.
Her demonstrerer vi potensiell utnyttelse av samfunnsforskere for ikke-dødelig prøveinnsamling fra små, sjeldne og truede arter. Det er imidlertid noen potensielle begrensninger å huske på når du analyserer eventuelle resulterende genetiske data. For eksempel, mens samling av prøver fra en enkelt øker sjansene for å gjenopprette nok DNA for deteksjon, introduserer det også potensielt heterozygositet. I tillegg, da protokollen innebærer å samle chorionen fra klekket ovae, kan bare kvinnelige sommerfugler, som representerer foreldrenes DNA, prøves i en populasjon. Likevel, da ingen tidligere genetiske data på populasjonsnivå var tilgjengelige for C. irus, kan den resulterende innsikten bare være til nytte for bevaring og forvaltning av arter. For eksempel, mens en grundig, detaljert studiedesign og nøye markørvalg vil være nødvendig for å tilstrekkelig vurdere populasjonsstrukturen, kan prøvetakingsprotokollen som er skissert her og bruken av cytokrom c oksidase underenhet 1 (CO1) DNA-strekkoding brukes til å oppdage forekomsten av sjeldne eller truede taxa. Ytterligere diskusjon av nytten og anvendelsen av DNA-sekvensering fra ikke-dødelig prøvetaking beskrevet her er detaljert av Storer et. al.14.
Utover det primære målet om å samle prøver for genetisk analyse, legger protokollen også vekt på at deltakerne tar detaljerte digitale fotografier av alle feltsteder, samlingssteder, larvevertsplanter som er tilstede og andre elementer i det omkringliggende habitatet som kan være relevante. Slik dokumentasjon bidrar til å gi en generell habitatvurdering som er nyttig for å illustrere eksisterende stedsforhold som plantefenologi, vertsressurstetthet og forvaltningshistorie (f.eks. Nylig foreskrevet brann). Slik informasjon er spesielt nyttig for prosjekter der feltprøver tas over en lengre tidsperiode for å muliggjøre mer detaljerte miljøsammenligninger.
Til slutt, ettersom den globale insektnedgangen fortsetter å akselerere, er det kritisk behov for utvidet artsvurdering og overvåkingsinnsats15,16. Bruken av mer utbredt deltakende engasjement fra samfunnsforskere, studenter (f.eks. US Fish and Wildlife Service praktikanter og stipendiater) og bevaringsutøvere tilbyr stadig mer levedyktige alternativer for omfattende datainnsamling av mange typer, inkludert DNA-prøver. Følgelig har dataene som genereres fra denne protokollen mange mulige bruksområder. Disse inkluderer å bidra til å informere bevaringshandlinger (f.eks. Planlegging, gjenoppretting og forvaltning), noteringsbeslutninger eller artsstatusvurderinger, og økologisk, populasjons- og taksonomisk forskning.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse om.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke David Cuthrell, Amanda Dillon, Steve Fuller, Neil Gifford, Heidi Holman, Dean Jue, Sally Jue, Daniel Kennedy, Genevieve Kozak, Rebecca Longenecker, Maureen McClung, Matt Moran, Robin Niver, Brenda Smith, Hunter Trowbridge og Jessup Weichelt for hjelp med ulike aspekter av prosjektet, inkludert logistikk, koordinering, tillatelse og / eller prøveinnsamling. Denne forskningen ble finansiert gjennom et tilskudd fra US Fish and Wildlife Service (Federal Award Identification Number F20AC00356) administrert av Wildlife Management Institute (tilskudd SA 2021-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 quart Igloo Playmate Cooler | Amazon | NA | portable cooler Amount per deployable unit: 1 cooler |
| 250 DNeasy Mini Spin Columns, Proteinase K, Buffers, Collection Tubes (2 mL) | Qiagen | 69506 | Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit Amount per deployable unit: NA |
| Andwin Scientific Supplier Diversity Partner LAB MARKERS BLACK | FisherSci | NC9280166 | ethanol proof lab marker Amount per deployable unit: 2 markers |
| Cardboard shipping box | shipping box Amount per deployable unit: as needed |
||
| Eisco Polyethylene Wash Bottles, LDPE | FisherSci | S14091 | lab grade spray or squirt bottle (for ethanol or alcohol) Amount per deployable unit: 1 bottle |
| FedEx U.S. express airbill | FedEx | NA | shipping return label Amount per deployable unit: 2 labels |
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | FisherSci | NC9386261 | sterile 1.5 mL microcentrifuge tubes Amount per deployable unit: 128 tubes |
| Forceps, #4a, very fine yet extra strong tips (33 mm), 4-3/8" (111 mm) long | Bioquip | 4523 | straight tip forceps Amount per deployable unit: 2 straight forceps |
| Forceps, #7, curved tips (13 mm), very fine points, 4-1/2" (114 mm) long | Bioquip | 4527 | curved tip forceps Amount per deployable unit: 2 curved forceps |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply | FisherSci | 06-666A | kimwipes (or other sterile wipe) Amount per deployable unit: 1 box |
| Laminated Illustrated field collection protocol | NA | NA | abbreviated protocol Amount per deployable unit: 1 protocol |
| Laminated list of materials | NA | NA | supply list Amount per deployable unit: 1 list |
| Lily Sugar 'N Cream The Original Solid Yarn, 2.5 oz, Medium 4 Gauge, 100% Cotton - Hot Pink - Machine Wash & Dry | Amazon | NA | pink yarn (to secure to forceps for visibility) Amount per deployable unit: 2 yards |
| Loupe by Bausch & Lomb, 10x Coddington Magnifier | Amazon | NA | hand lens Amount per deployable unit: 2 hand lenses |
| MyGift Clear Plastic 2-Tier Trays Craft Supply Storage Box/First Aid Carrying Case w/Top Handle & Latch Lock | Amazon | NA | supply storage box Amount per deployable unit: 1 box |
| Nitrile, Disposable Gloves, L, Powder-Free, 2.8 mil Palm Thickness | Grainger | 60NU14 | nitrile lab gloves (large) Amount per deployable unit: 1 box |
| Nitrile, Disposable Gloves, M, Powder-Free, 2.8 mil Palm Thickness | Grainger | 60NU13 | nitrile lab gloves (medium) Amount per deployable unit: 1 box |
| Qiagen, Inc. BUFFER ATL (200 ML) | Qiagen | 19076 | Qiagen ATL lysis buffer Amount per deployable unit: 180 µl/tube; 128 tubes |
| Rite In The Rain Weatherproof Side Spiral Notebook, Yellow Cover, Universal Page Pattern (No. 373-MX), 11 x 8.75 x 0.5 | Amazon | NA | weatherproof field notebook Amount per deployable unit: 1 notebook |
| Showgard Professional Stamp Tongs 6" 904 Round Tip Tweezers | Amazon | NA | 6" spade tip forceps Amount per deployable unit: 2 long spade forceps |
| Texwipe PolySat Pre-Wetted Wipers | FisherSci | 18-366-231 | alcohol wipes Amount per deployable unit: 100 wipes |
| Thermo Scientific CryoBoxes | FisherSci | 12-565-227 | 64 well microcentrifuge tubes collection/storage boxes Amount per deployable unit: 2 boxes |
| packing material Amount per deployable unit: as needed |
References
- Donald, H. M., Wood, C. W., Benowitz, K. M., Johnson, R. A., Drodie, E. D. Nondestructive sampling of insect DNA from defensive secretion. Molecular Ecology Resources. 12 (5), 856-860 (2012).
- Feinstein, J. DNA sequence from butterfly frass and exuviae. Conservation Genetics. 5 (1), 103-104 (2004).
- Hamm, C. A., Aggarwal, D., Landis, D. A. Evaluating the impact of non-lethal DNA sampling on two butterflies, Vanessa cardui and Satyrodes Eurydice. Journal of Insect Conservation. 14, 11-18 (2010).
- Holehouse, K. A., Hammond, R. L., Bourke, A. F. G. Non-lethal sampling of DNA from bumblebees for conservation genetics. Insectes Sociaux. 50 (3), 277-285 (2003).
- Lushai, G., et al. Application of molecular techniques to non-lethal tissue samples of endangered butterfly population (Parnassius apollo L.) in Norway for conservation management. Biological Conservation. 94 (1), 43-50 (2000).
- Monroe, E. M., Lynch, C., Soluk, D. A., Britten, H. B. Nonlethal tissue sampling techniques and microsatellite markers used for first report of genetic diversity in two populations of the endangered Somatochlora hineana (Odonata: Corduliidae). Annals of the Entomological Society of America. 103 (6), 1012-1017 (2010).
- Oi, C. A., López-Uribe, M. M., Cervini, M., Del Lama, M. A. Non-lethal method of DNA sampling in euglossine bees supported by mark-recapture experiments and microsatellite genotyping. Journal of Insect Conservation. 17 (5), 1071-1079 (2013).
- Scriven, J. J., Woodall, L. C., Goulson, D. Nondestructive DNA sampling from bumblebee feces. Molecular Ecology Resources. 13 (2), 225-229 (2013).
- Watts, P. C., Thompson, D. J., Daguet, C., Kemp, S. J. Exuviae as a reliable source of DNA for population-genetic analysis of odonates. Odonatologica. 34 (2), 183-187 (2005).
- Andrews, K., et al. All hands on deck: local ecological knowledge and expert volunteers contribute to the first delisting of a marine fish species under the Endangered Species Act. Citizen Science: Theory and Practice. 4 (1), 37 (2019).
- Buxton, A., Groombridge, J., Griffiths, G. Comparison of two citizen scientist methods for collecting pond water samples for environmental DNA studies. Citizen Science: Theory and Practice. 3 (2), 2 (2018).
- Granroth-Wilding, H., et al. Non-invasive genetic monitoring involving citizen science enables reconstruction of current pack dynamics in a re-establishing wolf population. BMC Ecology. 17 (1), 44 (2017).
- Qiagen, DNeasy Blood & Tissue Kit Quick Start Protocol. , Available from: https://www.qiagen.com/us/resources/download.aspx?id=63e22fd7-6eed-4bcb-8097-7ec77bcd4de6&lang=en (2016).
- Storer, C., Daniels, J., Xiao, L., Rossetti, K. Using noninvasive genetic sampling to survey rare butterfly populations. Insects. 10 (10), 311 (2019).
- Wagner, D. L., et al. Insect decline in the Anthropocene: Death by a thousand cuts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (2), 20239891 (2021).
- Montgomery, G. A., et al. Is the insect apocalypse upon us? How to find out. Biological Conservation. 241, 108327 (2020).
