Summary
Dit protocol beschrijft een confocale beeldvormingstechniek om drie fusiemodi in boviene bijnierchromaffinecellen te detecteren. Deze fusiemodi omvatten 1) close-fusion (ook wel kiss-and-run genoemd), waarbij fusieporiën worden geopend en gesloten, 2) stay-fusion, waarbij fusieporie wordt geopend en de geopende porie wordt gehandhaafd, en 3) krimpfusie, waarbij gesmolten blaasjeskrimp betrokken zijn.
Abstract
Dynamische fusieporieopening en -sluiting bemiddelen exocytose en endocytose en bepalen hun kinetiek. Hier wordt in detail gedemonstreerd hoe confocale microscopie werd gebruikt in combinatie met patch-clamp-opname om drie fusiemodi in primaire cultuur bovine adrenal chromaffine cellen te detecteren. De drie fusiemodi omvatten 1) close-fusion (ook wel kiss-and-run genoemd), waarbij fusieporieopening en -sluiting betrokken is, 2) stay-fusion, waarbij fusieporie wordt geopend en de geopende porie wordt gehandhaafd, en 3) krimpfusie, waarbij het fusie-gegenereerde Ω-vormige profiel krimpt totdat het volledig samensmelt bij het plasmamembraan.
Om deze fusiemodi te detecteren, werd het plasmamembraan gelabeld door mNeonGreen te overexpresseren dat verbonden is met het PH-domein van fosfolipase C δ (PH-mNG), dat bindt aan fosfatidylinositol-4,5-bisfosfaat (PtdIns(4,5)P2) in de cytosolgerichte folder van het plasmamembraan; blaasjes werden geladen met de fluorescerende valse neurotransmitter FFN511 om vesiculaire inhoudsafgifte te detecteren; en Atto 655 werd opgenomen in de badoplossing om fusieporiënsluiting te detecteren. Deze drie fluorescerende sondes werden gelijktijdig in beeld gebracht met ~ 20-90 ms per frame in levende chromaffinecellen om fusieporieopening, inhoudsafgifte, fusieporiesluiting en veranderingen in de grootte van blaasjes te detecteren. De analysemethode wordt beschreven om drie fusiemodi van deze fluorescentiemetingen te onderscheiden. De hier beschreven methode kan in principe van toepassing zijn op veel secretoire cellen buiten chromaffinecellen.
Introduction
Membraanfusie bemiddelt veel biologische functies, waaronder synaptische transmissie, bloedglucosehomeostase, immuunrespons en virale entry 1,2,3. Exocytose, waarbij blaasjesfusie op het plasmamembraan betrokken is, geeft neurotransmitters en hormonen vrij om veel belangrijke functies te bereiken, zoals neuronale netwerkactiviteiten. Fusie opent een porie om vesiculaire inhoud vrij te maken, waarna de porie kan sluiten om het fuserende blaasje op te halen, dat kiss-and-run 1,4 wordt genoemd. Zowel onomkeerbare als omkeerbare fusieporieopening kan worden gemeten met celgebonden capaciteitsregistraties in combinatie met fusieporiegeleidingsopnamen van enkelvoudige blaasjesfusie.
Dit wordt vaak geïnterpreteerd als een weerspiegeling van volledige collapsfusie, waarbij de fusie wordt verwijd tot het afvlakken van het fuserende blaasje, en kiss-and-run, waarbij fusieporieopening en -sluiting betrokken zijn, respectievelijk 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Recente confocale en gestimuleerde emissiedepletie (STED) beeldvormingsstudies in chromaffinecellen hebben direct waargenomen dat fusieporieopening en -sluiting (kiss-and-run, ook wel close-fusion genoemd), fusieporieopening die lange tijd een Ω-vorm met een open porie handhaaft, genaamd stay-fusion, en krimpen van het fuserende blaasje totdat het volledig samensmelt met het plasmamembraan, dat volledige fusie vervangt voor het samenvoegen van fuserende blaasjes met het plasmamembraan4, 8,14,15,16,17.
In neuronen zijn het openen en sluiten van fusieporiën gedetecteerd met beeldvorming die de afgifte laat zien van quantum dots die vooraf zijn geladen in blaasjes die groter zijn dan de fusieporie en met fusieporiegeleidingsmetingen aan het afgiftevlak van zenuwterminals 5,18,19. Bijnierchromaffinecellen worden veel gebruikt als model voor de studie van exo- en endocytose20,21. Hoewel chromaffinecellen grote blaasjes met dichte kern bevatten, terwijl synapsen kleine synaptische blaasjes bevatten, zijn de exocytose- en endocytose-eiwitten in chromaffinecellen en synapsen vrij analoog 10,11,12,20,21,22,23.
Hier wordt een methode beschreven om deze drie fusiemodi te meten met behulp van een confocale beeldvormingsmethode in combinatie met elektrofysiologie in boviene bijnierchromaffinecellen (figuur 1). Deze methode omvat het laden van fluorescerende valse neurotransmitters (FFN511) in blaasjes om exocytose te detecteren; toevoeging van Atto 655 (A655) in de badoplossing om het door fusie gegenereerde Ω-vormige profiel te vullen, en etikettering van het plasmamembraan met het PH-domein van fosfolipase C δ (PH), dat bindt aan PtdIns(4,5)P2 op het plasmamembraan 8,15,24. Fusieporiëndynamiek kan worden gedetecteerd door veranderingen in verschillende fluorescerende intensiteiten. Hoewel beschreven voor chromaffinecellen, kan het principe van deze hier beschreven methode op grote schaal worden toegepast op veel secretoire cellen ver buiten chromaffinecellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: De procedure voor het gebruik van dieren volgde de NIH-richtlijnen en werd goedgekeurd door de NIH Animal Care and Use Committee.
1. Boviene chromaffine celcultuur
- Bereid Locke's oplossing (tabel 1) en autoclaafgereedschappen 1 dag vóór de chromaffinecelkweek.
- Verkrijg runderbijnieren uit een lokaal slachthuis op de cultuurdag en houd ze ondergedompeld in ijskoude Locke's oplossing voordat ze worden gedissectie.
OPMERKING: Bijnieren zijn van 21-27 maanden oud, gezonde, zwarte Angus van beide geslachten (voornamelijk mannelijk) met een lichaamsgewicht van ongeveer 1.400 pond (~ 635 kg). - Bereid 30 ml (voor 3 bijnieren) verse enzymoplossing die collagenase P, trypsineremmer en runderserumalbumine bevat (tabel 1) voor dissectie en houd het op kamertemperatuur.
- Kies 3 intacte klieren zonder snijwonden of bloedingen op het oppervlak en verwijder het vetweefsel met een schaar (figuur 1A). Was de klieren door perfusie met Locke's oplossing totdat er geen bloed uitkomt. Om dit te bereiken, blaast u de klier op door de bijnierader (figuur 1B) met behulp van een spuit van 30 ml die is bevestigd met een filter van 0,22 μm, zo vaak als nodigis 25.
OPMERKING: Ongeveer 150 ml Locke's oplossing is meestal nodig om 3 klieren te wassen. - Voor de spijsvertering injecteert u de enzymoplossing door de bijnierader met behulp van een spuit van 30 ml die is bevestigd met een filter van 0,22 μm totdat de klier begint op te zwellen. Laat de klieren vervolgens 10 min op 37 °C staan. Injecteer nogmaals en laat de klieren nog 10 minuten op 37 °C staan.
OPMERKING: Ongeveer 30 ml enzymoplossing is nodig om 3 klieren te verteren. - Snijd na de spijsvertering de klier in de lengterichting van de ader naar het andere uiteinde met een schaar om de klier te ontvouwen (figuur 1C). Isoleer de medullae door het witte medulla uit te tweeten in een petrischaaltje van 10 cm met locke's oplossing.
OPMERKING: De vergelijking van het inwendige van de klier voor en na de spijsvertering is weergegeven in figuur 1C. De details van de spijsvertering en medullae-isolatie zijn eerder gemeld 23,25. - Knip en gehakt het medulla in kleine stukjes met een schaar (figuur 1D). Filtreer de medulla suspensie met een nylon gaas van 80-100 μm in een bekerglas. Breng vervolgens het filtraat over in een conische buis van 50 ml voor centrifugatie bij 48 × g, kamertemperatuur, gedurende 3 minuten met een vertraging van 3.
OPMERKING: Het hakken van de medullae duurt meestal ~ 10 minuten. Om een goede opbrengst aan cellen te verkrijgen, moeten de gehakte stukjes erg klein zijn, totdat ze niet kunnen worden getweezed. - Verwijder na centrifugatie het supernatant en resuspenseer de celpellet met locke's oplossing door pipetteren. Filtreer de celsuspensie met een zeef van 80-100 μm en centrifugeer bij 48 x g, kamertemperatuur, gedurende 3 minuten met vertraging van 3.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet met 30 ml kweekmedium (tabel 1). Bepaal het celnummer met behulp van hemacytometertelkamers25.
2. Transfectie met elektroporatie
- Breng 2,8 × 106 cellen over in een buis van 15 ml. Pelleteer de cellen door centrifugering bij 48 × g gedurende 2 minuten met een vertraging van 3. Voeg 100 μL transfectiebuffer (zie de door de fabrikant verstrekte materiaaltabel) toe aan de celpellet en voeg vervolgens 2 μg PH-mNG-plasmide toe.
OPMERKING: Het PH-mNG-plasmide is gemaakt door het verbeterde groene fluorescerende eiwit (EGFP) te vervangen door mNG in PH-EGFP15 (zie de tabel met materialen). - Meng de suspensie voorzichtig door de oplossing op en neer te pipetteren en breng het mengsel onmiddellijk over in een elektroporatiecuvet (figuur 1E). Breng de cuvette onmiddellijk over naar de elektroporator (zie de tabel met materialen), selecteer het O-005-programma in de schermlijst en druk op Enter om elektroporatie uit te voeren.
OPMERKING: Bereid de celsuspensie voor op transfectie in een celkweekkap. Breng geen luchtbellen in de suspensie tijdens de mengstap. Ga zonder vertraging verder met de volgende stap. - Voeg na elektroporatie onmiddellijk 1,8 ml medium toe aan de cuvette en meng voorzichtig met een micropipettor uitgerust met een steriele punt. Voeg vervolgens 300 μL van de suspensie van de geëlektroporated cellen toe aan de coverslip (zie de tabel met materialen) in elke schotel, waarbij in totaal 5-6 schotels worden geplateerd voor één elektroporatiereactie.
- Breng de gerechten voorzichtig over naar een bevochtigde incubator bij 37 °C met 9% CO2 gedurende 30 minuten en voeg na 30 minuten voorzichtig 2 ml voorgewarmd medium toe aan elk gerecht.
- Bewaar de getransfecteerde cellen in de bevochtigde incubator bij 37 °C met 9% CO2 gedurende 2-3 dagen vóór het experiment.
OPMERKING: De gekweekte cellen gaan een week mee. Het is het beste om gekweekte cellen te gebruiken op dag 2-3.
3. Voorbereiding voor patch-clamp opname en confocale beeldvorming
OPMERKING: Dit protocol werd uitgevoerd met een laserscan confocale microscoop en patch-clamp versterker met spanning-klem opname samen met een lock-in versterker voor capaciteitsopname. Een XY-vlak confocale beeldvorming op een vast Z-vlak (XY/Zfixed scanning) werd gebruikt om alle drie de fluorescerende signalen tegelijkertijd in beeld te brengen. Het Z-vlak was gericht op de celbodem waar het plasmamembraan zich aan de coverslips hechtte.
- Observeer op de dag van het patch-clamp en imaging experiment de cellen onder een fluorescentiemicroscoop. Gebruik brightfield om ervoor te zorgen dat de celcultuur niet verontreinigd is (figuur 1F) en epifluorescentie om te controleren op de juiste expressie van het fluorescerende eiwit.
OPMERKING: PH-mNG wordt bijvoorbeeld uitgedrukt op het plasmamembraan van ~ 20-30% van de cellen. - Bereid patchpipetjes van borosilicaatglascapillairen. Om dit te doen, trekt u de pipetten met een pipettrekker, bedekt u hun uiteinden met vloeibare was en polijst u ze met een microforge (zie de materiaaltabel).
- Schakel de patchklem-opnameversterker in en start de patchklemregistratiesoftware (zie de Materiaaltabel). Stel de juiste parameters in voor de opname van calciumstroom en capaciteit in de software (zie de materiaaltabel).
- Stel een opnameprotocol in van in totaal 60 s, waarbij de stimulatie begint bij 10 s.
- Stel de houdpotentiaal voor spanningsklemregistratie in op -80 mV. Stel een depolarisatie van 1 s in van -80 mV naar 10 mV als de stimulans om calciuminstroom en capaciteitssprong te induceren.
- Stel voor capaciteitsmetingen de frequentie van de sinusoïdale stimulus in op een bereik van 1.000-1.500 Hz met een piek-tot-piekspanning van niet meer dan 50 mV.
- Sla het protocol op en maak een nieuw bestand voor opname.
- Schakel het confocale microscoopsysteem in en stel de juiste parameters in de software in (zie de materiaaltabel).
- Schakel de lasers in, waaronder 458 nm, 514 nm en 633 nm, en stel het emissieverzamelingsbereik voor elke laser in volgens elke fluorescentiesonde zoals hieronder. FFN511: excitatiegolflengte (EX), 458 nm; emissiegolflengte (EM), 468-500 nm. mNG: EX, 514 nm; EM, 524-560 nm. A655: EX, 633 nm; EM, 650-700 nm.
- Gebruik sequentiële beeldvorming voor FFN511 en mNG om kruisverwijzing tussen deze twee sondes te voorkomen. Stel een timelapse van 1 minuut in voor beeldopname (figuur 1G).
4. Patch-clamp opname en confocale beeldvorming
- Kies een gerecht met een goede celtoestand en de juiste expressie en voeg 2 μL fluorescerende valse neurotransmitter FFN511 (10 mM voorraad, 1:1.000 werkoplossing) toe aan het medium. Zet het gerecht 20 min terug in de couveuse. U kunt ook FFN511 laden na stap 3.2 en stappen 3.3-3.5 uitvoeren terwijl u wacht om tijd te besparen.
- Nadat het laden van FFN511 is voltooid, bereidt u de opnamekamer voor en voegt u 2 μL fluorescerende kleurstof A655 toe aan 500 μL van de badoplossing (figuur 2A en tabel 1). Breng de coverslip van de schaal over in de opnamekamer (zie de tabel met materialen) met een pincet en voeg onmiddellijk A655-bevattende badoplossing toe (figuur 2B).
OPMERKING: De A655 wordt in -20 °C gehouden met een concentratie van 10 mM en de werkconcentratie is 40 μM.
LET OP: Draag handschoenen om direct huidcontact met FFN511 of A655 te voorkomen. - Plaats een druppel olie (brekingsindex: 1,518; zie de tabel met materialen) op het 100x olie-onderdompelingsobjectief (numeriek diafragma = 1,4). Monteer de kamer in de microscoop en gebruik de instelknop om de olie gewoon contact te laten maken met de onderkant van de afdekplaat en dompel vervolgens de aardingsdraadpunt onder in de badoplossing (figuur 2C, D).
OPMERKING: Kies een dompelolie die geschikt is om bij kamertemperatuur te werken. Schakelen tussen de lens met lage en hoge vergroting is niet nodig. De kamertemperatuur wordt tijdens de opname rond de 20-22 °C gehouden. - Breng de cellen in beeld en gebruik brightfield en confocale beeldvorming om een goede cel met mNG-expressie te vinden. Zoom in op de geselecteerde cel en pas deze aan in het midden van de weergave om lege gebieden te minimaliseren.
OPMERKING: De schematische tekening van fluorescentielabeling is weergegeven in figuur 3A. Een goede cel heeft meestal een glad membraan en een schone rand (figuur 3B). Bij epifluorescentie of confocale beeldvorming lijkt een goede cel een grote en platte bodem te hebben met heldere mNG-expressie (figuur 3C).
De pixelgrootte is ~ 50 nm, binnen een bereik van ~ 40-80 nm volgens verschillende celgrootte en zoomfactor. - Stel parameters in voor XY-vlak confocale beeldvorming op een vast Z-vlak (XY/Zvast scannen) van FFN511, PH-mNG en A655, met een geminimaliseerd tijdsinterval. Pas de scherpstelling aan de onderkant van de cel aan met de fijnstelknop.
OPMERKING: PH-mNG signaleert de contour van het celplasmamembraan bij de confocale XY-vlakkruissectie (behalve de celbodem). In de buurt van de bodem van het celmembraan kunnen A655-vlekken worden waargenomen, die Ω- of Λ-vormige membraaninvaginaties weerspiegelen. Als het Z-focale vlak lager is dan de celbodem, zal de intensiteit van alle fluorescentie zwakker worden. - Pas het excitatielaservermogen in de software aan om een instelling te vinden om de beste signaal-ruisverhouding te krijgen en significante fluorescentiebleking te voorkomen. Om dit te doen, begint u met een initiële testwaarde van 2,5 mW vermogen voor FFN511 opgewonden bij 458 nm en 1 mW voor mNG geëxciteerd bij 514 nm. Voor A655 geëxciteerd bij 633 nm met een HeNe-laser, gebruik een hoog laservermogen, ~ 12-15 mW (d.w.z. 70% -80% van het maximum), dat, bij continue excitatie, alle fluorescerende A655 in een Ω-vormig profiel kan bleken wanneer de porie gesloten is.
OPMERKING: Als het laservermogen te hoog is, worden PH-mNG en FFN511 fluorescentie snel gebleekt. Als het laservermogen te laag is, zijn de signalen te zwak of luidruchtig om te worden geanalyseerd. - Voeg 9 μL interne oplossing (tabel 1) toe aan een patchpipet en bevestig de pipet aan de houder in de patchklemversterkertrap (zie de materiaaltabel).
- Breng een kleine hoeveelheid positieve druk aan met een spuit en beweeg de pipetpunt om de badoplossing aan te raken met een micromanipulator. Zorg ervoor dat de versterker laat zien dat de pipetweerstand ~ 2-4 MΩ is met een spanningspulstest. Druk op LJ/Auto om de vloeistofverbinding te annuleren.
- Verplaats de pipet naar de geselecteerde cel met de micromanipulator. Om een cel-attached modus te vormen, verplaatst u de pipetpunt om de cel aan te raken (de weerstand zal toenemen); voorzichtig onderdruk uitoefenen met de spuit (weerstand zal toenemen tot meer dan 1 GΩ), verander de houdkracht van 0 tot -80 mV.
- Zodra de weerstand 1 GΩ passeert, wacht u op ~ 30 s voordat de configuratie is gestabiliseerd. Druk op C-fast/Auto om de snelle capaciteit te compenseren.
- Om een hele celmodus te vormen, past u gepulseerde korte maar krachtige negatieve druk toe met de spuit om het membraan te scheuren (de vorm van de huidige puls verandert met een geladen en ontladen membraancondensator). Druk op C- slow/Auto om de trage capaciteit te compenseren.
- Pas de beeldfocus iets aan om scherp te stellen op de onderkant van de cel. Start confocale timelapse imaging en patch-clamp opname tegelijkertijd door tegelijkertijd op de Start-knoppen in de twee verschillende softwaretoepassingen te klikken.
OPMERKING: De confocale beeldvormingssoftware maakt een film met een snelheid van ~ 20-90 ms / frame. De patch-clamp-opname omvat de rusttoestand gedurende 10 s, de 1 s depolarisatiestimulatie en nog eens 49 s na stimulatie. De patch-clamp configuratie maakt het mogelijk om calciumstroom, capaciteitssprong en verval geïnduceerd door de 1 s depolarisatie van -80 tot +10 mV te registreren (figuur 3D). - Zodra de opname is voltooid, moet u ervoor zorgen dat de gegevens zijn opgeslagen. Wijzig de inhoudspotentiaal terug naar 0 mV. Haal de pipet uit de badoplossing en gooi deze weg.
- Herhaal stap 4.7-4.13 om een andere cel in het gerecht op te nemen. Na 1 uur opname, verander naar een andere schotel voor opname.
OPMERKING: Na 1 uur opname neemt het slagingspercentage van patchklemregistratie aanzienlijk af. Om de efficiëntie van gegevensverzameling te verhogen, wordt opname gedurende slechts 1 uur in elk gerecht aanbevolen.
5. Patch-clamp data-analyse
- Open geschikte software (zie de materiaaltabel) voor gegevensanalyse. Klik op de PPT-| Laad PULSE-bestand | Bestandsknoppen om het .dat bestand te laden. Klik op Doe het en vier sporen worden automatisch in één grafiek uitgezet, inclusief de calciumstroom- en capaciteitssporen.
- Klik op de Windows-| Nieuwe grafiekknoppen , kies de Pulse_1_1_1, de eerste golf in Y Wave(s), en klik op Doe het om de calciumstroomgrafiek te plotten. Klik op de Windows-| Nieuwe tabelknoppen , kies de Pulse_1_1_1 en klik op Doen om de onbewerkte gegevens van calciumstroom weer te geven, die kunnen worden gebruikt om het gemiddelde spoor van meerdere cellen te plotten.
- Teken een vierkant dienovereenkomstig in de calciumstroomgrafiek, klik met de rechtermuisknop en vouw het huidige signaal uit om de basislijn en de piek van de calciumstroom op te nemen. Klik op Graph | Toon Info om cursors A en B weer te geven en deze respectievelijk naar de basislijn en de piek te verplaatsen. De grafiekinformatie wordt onderaan weergegeven en parameters kunnen worden geschat.
- Herhaal stap 5.2, maar kies de Pulse_1_1_1_Cm, de tweede golf in Y Wave(s), om het capaciteitsspoor uit te zetten. Herhaal stap 5.3 en plaats de A- en B-cursors op de juiste positie om de capaciteitsparameters te meten, zoals basislijn, amplitude en vervalsnelheid.
- Kopieer onbewerkte gegevens in stap 5.2 naar een spreadsheet, bereken de gemiddelde en standaardfout van het gemiddelde voor een groep geregistreerde cellen en plot de gemiddelde sporen van calciumstroom en membraancapaciteit (figuur 3E) in een geschikte software.
6. Confocale beeldvorming data analyse
- Open de ONBEWERKTE beeldbewerkingsbestanden met alle door de fabrikant geleverde software (zie de tabel met materialen).
OPMERKING: Sommige andere gratis programma's, zoals ImageJ of Fiji, kunnen worden gebruikt voor gegevensverwerking en het kwantificeren van de afbeeldingen die zijn verkregen in sectie 4. - Klik op | Verwerken ProcessTools en gebruik de tools om voortschrijdend gemiddelde (bijvoorbeeld voortschrijdend gemiddelde voor elke 4 afbeeldingen) bestanden te genereren voor elke timelapse-afbeelding en die bestanden op te slaan.
OPMERKING: Na het voortschrijdend gemiddelde kan de juiste aanpassing van de helderheid en achtergrond worden gedaan om de fluorescentieveranderingen van drie kanalen beter weer te geven, wat kan helpen om fusiegebeurtenissen te identificeren. Controleer de fluorescerende intensiteit in sommige regio's zonder fusiegebeurtenis kan helpen om het fluorescerende signaal van fusiegebeurtenissen te onderscheiden van achtergrondsignalen. - Klik op de knoppen Quantify | Gereedschap | Stack Profile, controleer tijdspunten voor en na stimulatie om fluorescentieveranderingen in elk kanaal te identificeren. Klik op de knop Ellips tekenen om de interessante regio's (ROI's) voor fusiegebeurtenissen te omcirkelen. Klik met de rechtermuisknop op de afbeelding en klik op ROIs opslaan om de ROI's op te slaan.
OPMERKING: De grootte van ROI, die alle drie de fluorescerende signalen omvat, was vergelijkbaar met de grootte van blaasjes in chromaffinecellen24. Ruwe gegevens werden gebruikt voor de analyse, terwijl de rolling averaging-gegevens die de signaal-ruisverhouding verhogen, werden verstrekt om de drie signalen duidelijk weer te geven. - Klik op Projecten openen om het RAW-bestand te zoeken, klik met de rechtermuisknop op de afbeelding en klik op ROIs laden om het ROI-bestand in de RAW-afbeeldingsbestanden te laden om de fluorescentie-intensiteiten te meten.
OPMERKING: Het ruwe fluorescerende signaal wordt gebruikt om sporen van verschillende kanalen te plotten. Voor elke ROI wordt de basislijn gedefinieerd als de intensiteit vóór stimulatie en kunnen de intensiteitssporen worden genormaliseerd naar de basislijn. - Klik op Extra | Sorteer ROI's in de software en plot de sporen voor alle drie de kanalen van elke ROI. Klik op Rapport om de ROI-gegevens, inclusief zowel digitale gegevens als beeldtraceringen voor elke ROI, op te slaan in een bestandsmap.
- Identificeer een fusiegebeurtenis door de gelijktijdige toename van de intensiteit van PH-mNG (FPH) en A655 (F655) spotfluorescentie (binnen een enkel frame), vergezeld van een afname van FFN511-spotfluorescentie (FFFN).
- Zoek naar het uiterlijk van FPH en F655, wat wijst op PH-mNG / A655-spotvorming als gevolg van een Ω-profiel gegenereerd door fusie, waardoor de diffusie van PH-mNG uit het plasmamembraan en aanhoudende diffusie van A655 uit het bad mogelijk is.
- Zoek naar FFFN-afname , die aangeeft dat het vrijkomt uit een blaasje als gevolg van fusieporiënopening en de mogelijkheid uitsluit dat FPH en F655 verschijnen van membraaninatie veroorzaakt door endocytose.
- Inspecteer de timelapse XY/Zvaste afbeeldingen die fusiegebeurtenissen laten zien die plaatsvinden op de celbodem. Analyseer drie manieren van fusiegebeurtenissen: 1) close-fusion, 2) stay-fusion en 3) shrink-fusion.
OPMERKING: Fusiegebeurtenissen werden zelden waargenomen vóór depolarisatie, terwijl tientallen fusiegebeurtenissen konden worden waargenomen na depolarisatie. Na fusie kan het Ω-profiel zijn porie sluiten, zijn open porie behouden of krimpen om op te gaan in het plasmamembraan.- Om nauwe fusie te identificeren, zoekt u naar het dimmen van F655 , omdat fusieporiënsluiting de uitwisseling van bad A655 voorkomt, terwijl FPH onderhoudt, wat de voortdurende omzetting van PtdIns (4,5) P2 in PtdIns (4) P, of FPH vervalt met een vertraging, reflecterende blaasjes knijpen (close-fusion, figuur 4A, B).
- Zoek naar aanhoudende FPH en F655 om verblijfsfusie te identificeren (figuur 4C).
- Zoek naar parallelle dalingen van FPH en F655, wat wijst op Ω-profielkrimp om krimpfusie te identificeren (figuur 4D).
OPMERKING: Controleer de originele afbeeldingsbestanden om de beeldsporen te inspecteren als u niet zeker bent van het gebeurtenistype. Het controleren van de fluorescerende intensiteit in sommige regio's zonder fusiegebeurtenis kan helpen om het fluorescerende signaal van fusiegebeurtenissen te onderscheiden van achtergrondsignalen.
- Plot representatieve sporen van intensiteitsveranderingen voor deze drie kanalen: FFN511, PH-mNG en A655. Kwantificeer het percentage verschillende fusiemodi in elke cel en plotcijfers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Volgens de experimentele procedures in figuur 1 en figuur 2 werden chromaffinecellen uit runderbijnieren getransfecteerd met PH-mNG om het plasmamembraan te labelen; A655 werd toegevoegd aan de badoplossing om fusieporiënsluiting te detecteren; en fluorescerende valse neurotransmitter FFN511 werd geladen in blaasjes voor detectie van afgifte. Vervolgens werd XY-plane confocale timelapse beeldvorming van FFN511, PH-mNG en A655 elke 20-90 ms aan de celbodem uitgevoerd (Z-focale vlak ~ 100-200 nm boven het celmembraan). Whole-cell patch-clamp registratie en toepassing van een 1 s depolarisatie van -80 tot +10 mV werd uitgevoerd om exo- en endocytose op te roepen (figuur 3A-C). Deze depolarisatie veroorzaakte een inwaartse calciumstroom, een capaciteitssprong die exocytose aangeeft en een capaciteitsverval na de sprong die endocytose aangeeft (figuur 3D, E).
Met timelapse XY/Zvaste beeldvorming aan de celbodem werden veel individuele fusiegebeurtenissen waargenomen 8,24 na depolarisatie (figuur 4A), terwijl zeldzame fusiegebeurtenissen werden waargenomen vóór depolarisatie. Fusiegebeurtenissen geïnduceerd door het 1 s depolarisatieprotocol werden geïdentificeerd als FFN511 spotfluorescentie (FFFN) afname als gevolg van FFN511 release, vergezeld van FPH en A655 spot fluorescentie (F655) toename die PH-mNG en A655 diffusie van het plasmamembraan en de badoplossing in het fuserende blaasje (het fusie-gegenereerde Ω-profiel)15.
Na fusie kan het Ω-profiel gegenereerd door blaasjesfusie met het plasmamembraan 1) zijn porie sluiten, close-fusion genoemd, 2) een open fusieporie behouden, stay-fusion genoemd, of 3) krimpen om op te gaan in het plasmamembraan, krimpfusie genoemd. Close-fusion werd geïdentificeerd als F655 dimming terwijl FPH met een vertraging aanhield of verviel (figuur 4B). Stay-fusion werd gedetecteerd als de aanhoudende aanwezigheid van zowel PH-mNG- als A655-vlekken (figuur 4C). Krimpfusie werd gedetecteerd als parallel FPH- en F655-verval, vergezeld van een parallelle verkleining van de PH-mNG-spot en de A655-spot (figuur 4D)8,15,16,24.
Figuur 1: Schematische weergave van het experimentele protocol. (A, B) Runderbijnieren worden bijgesneden met een schaar om vetweefsel (A) te verwijderen, gespoeld met locke's oplossing en verteerd door bijnierader (B). (C) Het inwendige van een bijnier zonder spijsvertering (links) of na een goede spijsvertering (rechts). (D) Na te zijn gewassen en verteerd, worden de medullae geïsoleerd en in kleine stukjes gehakt, en chromaffinecellen worden gescheiden van gehakte medullae na filtering en centrifugeren. (E) Chromaffinecellen worden geëlektropoeerd en verguld op coverslips voor incubatie. (F) Controleer op dag 2-3 de chromaffinecellen onder een microscoop voordat u gaat experimenteren. (G) Het celmonster is ingebed in de kamer voor patch-clamp-opname en confocale beeldvorming. Veranderingen in calciumstroom en capaciteit worden geregistreerd, versterkt en weergegeven op de monitor. Fluorescentieveranderingen bij stimulatie worden gedetecteerd en weergegeven op de monitor. Schaalstaven = 40 mm (A), 20 mm (B-D), 20 μm (F). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Patch-clamp en confocale opstelling. (A) Op de dag van het experimenteren worden de chromaffinecellen die op coverslips worden gekweekt gedurende 20 minuten geïncubeerd met FFN511. De kleurstof A655 wordt toegevoegd aan de badoplossing. (B) Chromaffinecellen op de coverslip worden overgebracht naar een opnamekamer en de badoplossing met A655 wordt aan de kamer toegevoegd. (C) Na het toevoegen van een druppel olie op het 100x olie-onderdompelingsobjectief, wordt de kamer gemonteerd op het podium van een omgekeerde confocale microscoop. De punt van de aardingsdraad wordt ondergedompeld in badoplossing. De pipet wordt na het laden met pipetoplossing op zijn plaats gebracht en vastgehouden door een pipethouder, die aan een kopstuk is bevestigd. Het hoofdpodium wordt bestuurd door een gemotoriseerde micromanipulator. (D) Nadat u een goede cel hebt gevonden, verplaatst u de pipetpunt in de badoplossing met de micromanipulator om de opname van de hele celpleisterklem en confocale beeldvorming te starten. Schaalstaven = 10 mm (A), 5 mm (B). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Gehele cel spanningsklemregistraties van calciumstromen en capaciteitsveranderingen veroorzaakt door depolarisatie. (A) Opstellingstekening van chromaffinecellen tijdens de registratie van de spanningsklem van de hele cel. De chromaffinecel wordt ondergedompeld in A655-bevattende badoplossing (rood) en het celmembraan en de blaasjes zijn gelabeld met respectievelijk PH-mNG (groen) en FFN511 (cyaan). Deze afbeelding is met toestemming van 24 aangepast. (B) Een representatief beeld van een patch-clamped chromaffine cel waargenomen door brightfield. (C) Representatieve beelden van PH-mNG (groen), A655 (rood) en FFN511 (cyaan) in een cel met een goede focus op de celvoetafdruk. (D) Een voorbeeld van calciumstroom- en capaciteitsveranderingen geïnduceerd door 1 s depolarisatie van -80 tot +10 mV. (E) De gemiddelde sporen van calciumstromen (ICa) en capaciteit (Cm) veranderingen verzameld uit 20 chromaffinecellen. Deze afbeelding is met toestemming van 26 aangepast. Schaalstaven = 5 μm (B, C). Afkortingen: ICa = calciumstroom; Cm = capaciteit; Depol = depolarisatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Visualisatie van fusiegebeurtenissen onder de confocale microscoop. (A) Veel fusievlekken kunnen worden gedetecteerd met confocale XY-vlak beeldvorming van PH-mNG (groen), A655 (rood) en FFN511 (cyaan) aan de celbodem. Fusie werd opgeroepen door een 1 s depolarisatie van -80 tot +10 mV (depol1s). FFN-spots ondergingen release en close-fusion (cirkels). Afbeeldingen voor (-1 s) en na (+1 s en +10 s) depolarisatie worden getoond. (B) Een voorbeeld van nauwe fusie. (C) Een voorbeeld van stay-fusion. (D) Een voorbeeld van krimpfusie. Deze afbeelding is met toestemming van 24 aangepast. Schaalstaven = 1 μm (A), 0,5 μm (B-D). Afkortingen: Depol = depolarisatie; F = fluorescerende intensiteit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Medium/Oplossing | Beschrijving | ||
| Locke's oplossing | 145 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 2,2 mM Na2HPO4, 0,9 mM NaH2PO4, 5,6 mM glucose en 10 mM HEPES, pH 7,3, afgesteld met NaOH | ||
| Enzymoplossing | 1,5 mg/ml collagenase P, 0,325 mg/ml trypsineremmer en 5 mg/ml runderserumalbumine in locke's oplossing | ||
| Cultuurmedium | DMEM medium aangevuld met 10% foetaal runderserum | ||
| Interne oplossing | 130 mM Cs-glutamaat, 0,5 mM Cs-EGTA, 12 mM NaCl, 30 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 2 mM ATP en 0,5 mM GTP, pH 7,2, afgesteld met CsOH | ||
| Badoplossing | 125 mM NaCl, 10 mM glucose, 10 mM HEPES, 5 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 4,5 mM KCl en 20 mM THEE, pH 7,3, afgesteld met NaOH | ||
Tabel 1: Details over de samenstelling van cultuurmedium en oplossingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een confocale microscopische beeldvormingsmethode wordt beschreven om de dynamiek van fusieporie en zenderafgifte te detecteren, evenals drie fusiemodi, close-fusion, stay-fusion en shrink-fusion in bovine adrenal chromaffin cells 4,24. Een elektrofysiologische methode om de cel te depolariseren en daarbij exo- en endocytose op te roepen wordt beschreven. Systematische confocale beeldverwerking biedt informatie over verschillende vormen van poriegedrag voor fusie- en splijtingsgebeurtenissen.
Gelijktijdige monitoring van calciumstroom- en capaciteitsveranderingen in dezelfde cel met de configuratie van de hele cel levert aanvullende informatie op over exo- en endocytose, wat de verhouding van porieopening en -sluiting op een heel-celniveau op een bepaald moment impliceert. Deze methoden zijn in principe toepasbaar op andere exciteerbare cellen en niet-elektrisch prikkelbare cellen in primaire cultuur of in cellijnen die blaasjes van ~200-1.600 nm15 bevatten. Naast chromaffinecellen is de hier beschreven methode toegepast op een bètacellijn van de alvleesklier van een rat, INS-1-cellen4.
In principe kan de methode ook worden toegepast op secretoire cellen die blaasjes kleiner dan 200 nm bevatten. Naarmate de grootte van de blaasjes afneemt, kan de signaal-ruisverhouding echter te laag zijn voor betrouwbare detectie. Beeldvorming met superresolutie in plaats van confocale beeldvorming kan nodig zijn. Tot nu toe zijn de hier beschreven methoden niet toegepast op synapsen die ~40 nm synaptische blaasjes bevatten.
Succesvolle implementatie van de hier beschreven methode hangt kritisch af van verschillende algemene stappen, zoals de kwaliteit van de kweekcellen, de efficiëntie van plasmidetransfectie en het succespercentage van elektrofysiologische registratie. Ten eerste zijn gezonde cellen van vitaal belang voor zowel patch-clamp-opname als confocale beeldvorming. Het wordt niet geadviseerd om antibacteriële of antischimmelmiddelen te gebruiken tijdens het kweken, omdat deze chemicaliën de prikkelbaarheid van chromaffinecellen kunnen beïnvloeden. Daarom zijn zorgvuldige uitoefening van steriele techniek en het gebruik van vers bereide media belangrijk. Hoewel primaire kweekchromaffinecellen minstens een week25 in gerechten kunnen overleven, is het belangrijk voor nieuwe gebruikers om cellen op dag 2 tot 3 te gebruiken voor de experimenten. Naarmate fibroblasten geleidelijk groeien, wordt het moeilijker om de hele cel patch-clamp configuratie vast te stellen. Ten tweede is de elektroporatie-efficiëntie van plasmiden in chromaffinecellen ongeveer 20-30%. De elektroporatie-efficiëntie moet worden geoptimaliseerd als deze te laag is of ph-mNG-fluorescentie te zwak is. Ten derde werden cellen op hun bodem afgebeeld met een 100x oliedoelstelling om substantiële gebeurtenissen te verkrijgen die worden aangegeven door veranderingen in drie fluorescerende sondes: FFN511, PH-mNG en A655. Hoewel DIC een duidelijker beeld biedt dan bright field of naked-eye imaging bij het vaststellen van de configuratie van de hele cel, is elke visualisatietechniek waarmee de gebruiker de configuratie kan vaststellen voldoende.
De juiste laserkrachtsterkte is van vitaal belang voor confocale beeldvorming in levende cellen. Omdat FFN511 en mNG kunnen worden gebleekt door een hoog laservermogen, is het beter om te zoeken naar een goede cel met epifluorescentie voor visualisatie met confocale lasers. Voor A655 is krachtige laserexcitatie nodig om de kleurstof in de blaasjes te bleken. Bovendien is de meest voorkomende reden waarom dit experiment niet succesvol is, een falen van patch-clamp-opname. Een schone en gepolijste pipetpunt van de juiste grootte en de praktijk die de hele celconfiguratie op chromaffinecellen genereert, zijn belangrijke factoren. Hoewel het enige tijd en moeite kan kosten om te slagen, bieden deze experimenten, eenmaal vastgesteld, substantiële gegevens over zowel fusie- als splijtingsgebeurtenissen, wat wijst op het openen en sluiten van membraanporiën op een enkel gebeurtenisniveau.
Het hier beschreven protocol kan worden gebruikt met enkele wijzigingen om verschillende experimentele doelen verder te bereiken. Ongeacht de experimentele doelen is het echter raadzaam om eerst een oplossing met een hoog kaliumgehalte (zoals 70 mM KCl) te gebruiken als een stimulans om de veranderingen te zien die het membraan ondergaat bij depolarisatie, zodat de intensiteitsveranderingen in deze drie kleurstoffen, FFN, PH en A655, kunnen worden gevisualiseerd. Het plasmamembraan kan worden gelabeld met andere membraanbindende fluoroforen, zoals mCLING (membraanbindende fluorofoor-cysteïne-lysine-palmitoylgroep)4,27 of CAAX (een eiwitmotief dat zich richt op cytosol-faced plasmamembraan via cysteïneresidu isopreflatie)4,28. A655 kan worden vervangen door andere kleurstoffen met andere spectra, zoals Atto 532 (A532), afhankelijk van de combinatie van fluorescerende moleculen die in bepaalde experimenten wordt gebruikt15. Neuropeptide Y kan worden gebruikt in plaats van fluorescerende valse neurotransmitters16.
FFN511 werd in dit experiment opgewonden bij 458 nm in plaats van 405 nm, hoewel het piekexcitatiespectrum van FFN511 ongeveer 405 nm is. Onderzoek met capaciteitsregistratie toonde geen significant verschil in chromaffinecellen met of zonder PH-mNG, wat aangeeft dat overexpressie van PH-mNG geen invloed heeft op exocytose en endocytose15,24. Vergelijkbare percentages voor fusiegebeurtenissen werden geverifieerd in chromaffinecellen die alleen met PH-mNG en A532 of met FFN511 waren gelabeld, wat aantoont dat het laden van FFN511 in chromaffineblaasjes geen invloed heeft op de inhoudsafgifte en verschillende fusiemodi16. De 1 s depolarisatiestimulatie kan worden vervangen door een hoog kaliumoplossing of andere pattens van depolarisatie. Deze aanpassingen kunnen worden gebruikt om zich aan te passen aan verschillende experimentele doelen.
Ondanks de voordelen van deze krachtige methode, heeft het enkele beperkingen. De grootste beperking is gerelateerd aan de diffractie-beperkte resolutie (~ 230 nm) van confocale microscopie, die kan worden overwonnen door meer geavanceerde superresolutiemicroscopietechnieken29. De korreldiameter in runderchromaffinecellen is ~ 300 nm6, waardoor het mogelijk is om het openen en sluiten van membraanporiën te observeren binnen de ruimtelijke resolutie van confocale microscopie. Synaptische blaasjes zijn echter ~ 30-60 nm30, wat meer is dan confocale resolutie. Het uitbreiden van deze live-cell imaging metingen naar kleine synaptische blaasjes blijkt moeilijk te zijn met confocale beeldvorming.
Live-cell imaging technieken met een betere temporele en/of ruimtelijke resolutie, zoals STED-microscopie, stochastische optische reconstructiemicroscopie (STORM), fotoactivated localization microscopie (PALM), total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopie en minimal photon fluxes (MINFLUX) nanoscopie zijn ontwikkeld en kunnen op deze methode worden toegepast 31,32,33,34 . Inderdaad, STED-microscopie is gebruikt om fusieporiëndynamiek in chromaffinecellen te onthullen. De verschillende manieren van fusiegebeurtenissen en voorgevormde Ω-profielsluiting kunnen verder worden geverifieerd met behulp van superresolutiemicroscopie zoals STED-microscopie24. Andere beperkingen zijn fotobleaching en cytotoxiciteit van fluorescerende eiwitten en kleurstoffen.
Deze combinatie van elektrofysiologie en confocale microscopie kan op grote schaal worden toegepast op veel secretoire cellen. De combinatie van superresolutiemicroscopie met de hier beschreven methoden zou in de toekomst een waardevol hulpmiddel zijn voor het meten van fusieporiëndynamiek in neurale circuits, op voorwaarde dat superresolutiemicroscopie zich zodanig zal ontwikkelen dat het de fusieporie op zenuwterminals kan oplossen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Acknowledgments
We danken de NINDS Intramurale Onderzoeksprogramma's (ZIA NS003009-13 en ZIA NS003105-08) voor het ondersteunen van dit werk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187-500MG | ATP for preparing internal solution |
| Atto 655 | ATTO-TEC GmbH | AD 655-21 | Atto dye to label bath solution |
| Basic Nucleofector for Primary Neurons | Lonza | VSPI-1003 | Electroporation transfection buffer along with kit |
| Boroscilicate capillary glass pipette | Warner Instruments | 64-0795 | Standard wall with filament OD=2.0 mm ID=1.16 mm Length=7.5 cm |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153-50G | Reagent for gland digestion |
| Calcium Chloride 2 M | Quality Biological | 351-130-721 | Reagent for preparing bath solution |
| Cell Strainers, 100 µm | Falcon | 352360 | Material for filtering chromaffin cell suspension |
| Cesium hydroxide solution | Sigma | 232041 | Reagent for preparing internal solution and Cs-glutamate/Cs-EGTA stock buffer |
| Collagenase P | Sigma | 11213873001 | Enzyme for gland digestion |
| Coverslip | Neuvitro | GG-14-Laminin | GG-14-Laminin, 14 mm dia.#1 thick 60 pieces Laminin coated German coverslips |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270-1KG | Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11885092 | Reagent for preparing culture medium |
| EGTA | Sigma | 324626-25GM | Reagent for preparing Cs-EGTA stock buffer for bath solution |
| Electroporation and Nucleofector | Amaxa Biosystems | Nucleofector II | Transfect plasmids into cells |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 10082147 | Reagent for preparing culture medium |
| FFN511 | Abcam | ab120331 | Fluorescent false neurotransmitter to label vesicles |
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma | G8877-250MG | GTP for preparing internal solution |
| HEPES | Sigma | H3375-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Igor Pro | WaveMetrics | Igor pro | Software for patch-clamp analysis and imaging data presentation |
| Leica Application Suite X software | Leica | LAS X software | Confocal software for imaging data collection and analysis |
| Leica TCS SP5 Confocal Laser Scanning Microscope | Leica | Leica TCS SP5 | Confocal microscope for imaging data collection |
| L-Glutamic acid | Sigma | 49449-100G | Reagent for preparing Cs-glutamate stock buffer for bath solution |
| Lock-in amplifier | Heka | Lock-in | Software for capacitance recording |
| Magnesium Chloride 1 M | Quality Biological | 351-033-721EA | Reagent for preparing internal solution and bath solution |
| Metallized Hemacytometer Hausser Bright-Line | Hausser Scientific | 3120 | Counting chamber |
| Microforge | Narishige | MF-830 | Polish pipettes to enhance the formation and stability of giga-ohm seals |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Millipore | SLGPR33RB | Material for glands wash and digestion |
| mNG(mNeonGreen) | Allele Biotechnology | ABP-FP-MNEONSB | Template for PH-mNeonGreen construction |
| Nylon mesh filtering screen 100 micron | EIKO filtering co | 03-100/32 | Material for filtering medulla suspension |
| Patch clamp EPC-10 | Heka | EPC-10 | Amplifier for patch-clamp data collection |
| PH-EGFP | Addgene | Plasmid #51407 | Backbone for PH-mNeonGreen construction |
| Pipette puller | Sutter Instrument | P-97 | Make pipettes for patch-clamp recording |
| Potassium Chloride | Sigma | P5404-500G | Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution |
| Pulse software | Heka | Pulse | Software for patch-clamp data collection |
| Recording chamber | Warner Instruments | 64-1943/QR-40LP | coverslip chamber, apply patch-clamp pipette on live cells |
| Sodium chloride | Sigma | S7653-1KG | Reagent for preparing Locke’s solution, bath solution and internal solution |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S0876-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S8282-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Stirring hot plate | Barnsted/Thermolyne | type 10100 | Heater for pipette coating with wax |
| Syringe, 30 mL | Becton Dickinson | 302832 | Material for glands wash and digestion |
| Tetraethylammonium chloride | Sigma | T2265-100G | TEA for preparing bath solution |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T9253-5G | Reagent for gland digestion |
| Type F Immersion liquid | Leica | 195371-10-9 | Leica confocal mounting oil |
References
- Wu, L. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. C. Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms. Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).
- Chang, C. W., Chiang, C. W., Jackson, M. B. Fusion pores and their control of neurotransmitter and hormone release. Journal of General Physiology. 149 (3), 301-322 (2017).
- Harrison, S. C.
- Zhao, W. D., et al. Hemi-fused structure mediates and controls fusion and fission in live cells. Nature. 534 (7608), 548-552 (2016).
- Klyachko, V. A., Jackson, M. B. Capacitance steps and fusion pores of small and large-dense-core vesicles in nerve terminals. Nature. 418 (6893), 89-92 (2002).
- Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).
- He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse. Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).
- Chiang, H. C., et al. Post-fusion structural changes and their roles in exocytosis and endocytosis of dense-core vesicles. Nature Communications. 5, 3356 (2014).
- Sharma, S., Lindau, M. The fusion pore, 60 years after the first cartoon. Federation of European Biochemical Societies Letters. 592 (21), 3542-3562 (2018).
- Jorgacevski, J., et al. Munc18-1 tuning of vesicle merger and fusion pore properties. Journal of Neuroscience. 31 (24), 9055-9066 (2011).
- Rituper, B., et al. Vesicle cholesterol controls exocytotic fusion pore. Cell Calcium. 101, 102503 (2021).
- Gucek, A., et al. Dominant negative SNARE peptides stabilize the fusion pore in a narrow, release-unproductive state. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3719-3731 (2016).
- Grabner, C. P., Moser, T. Individual synaptic vesicles mediate stimulated exocytosis from cochlear inner hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), 12811-12816 (2018).
- Wen, P. J., et al. Actin dynamics provides membrane tension to merge fusing vesicles into the plasma membrane. Nature Communications. 7, 12604 (2016).
- Shin, W., et al. Visualization of Membrane Pore in Live Cells Reveals a Dynamic-Pore Theory Governing Fusion and Endocytosis. Cell. 173 (4), 934-945 (2018).
- Shin, W., et al. Vesicle Shrinking and Enlargement Play Opposing Roles in the Release of Exocytotic Contents. Cell Reports. 30 (2), 421-431 (2020).
- Ge, L., Shin, W., Wu, L. -G. Visualizing sequential compound fusion and kiss-and-run in live excitable cells. bioRxiv. , (2021).
- Zhang, Q., Li, Y., Tsien, R. W. The dynamic control of kiss-and-run and vesicular reuse probed with single nanoparticles. Science. 323 (5920), 1448-1453 (2009).
- He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse. Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).
- Androutsellis-Theotokis, A., Rubin de Celis, M. F., Ehrhart-Bornstein, M., Bornstein, S. R. Common features between chromaffin and neural progenitor cells. Molecular Psychiatry. 17 (4), 351 (2012).
- Bornstein, S. R., et al.
- Park, Y., Kim, K. T. Short-term plasticity of small synaptic vesicle (SSV) and large dense-core vesicle (LDCV) exocytosis. Cellular Signalling. 21 (10), 1465-1470 (2009).
- Thahouly, T., et al. Bovine Chromaffin Cells: Culture and Fluorescence Assay for Secretion. Exocytosis and Endocytosis. Methods in Molecular Biology. Niedergang, F., Vitale, N., Gasman, S., et al. 2233, Springer US. (2021).
- Shin, W., et al. Preformed Omega-profile closure and kiss-and-run mediate endocytosis and diverse endocytic modes in neuroendocrine chromaffin cells. Neuron. 109 (19), 3119-3134 (2021).
- O'Connor, D. T., et al.
- Wu, X. S., et al. Membrane Tension Inhibits Rapid and Slow Endocytosis in Secretory Cells. Biophysical Journal. 113 (11), 2406-2414 (2017).
- Revelo, N. H., et al. A new probe for super-resolution imaging of membranes elucidates trafficking pathways. Journal of Cell Biology. 205 (4), 591-606 (2014).
- Gao, J., Liao, J., Yang, G. -Y. CAAX-box protein, prenylation process and carcinogenesis. American journal of translational research. 1 (3), 312-325 (2009).
- Schermelleh, L., et al.
- Ceccarelli, B., Hurlbut, W. P., Mauro, A. Depletion of vesicles from frog neuromuscular junctions by prolonged tetanic stimulation. Journal of Cell Biology. 54 (1), 30-38 (1972).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Fish, K. N. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 12 Unit12 18 (2009).
- Schmidt, R., et al. MINFLUX nanometer-scale 3D imaging and microsecond-range tracking on a common fluorescence microscope. Nature Communications. 12 (1), 1478 (2021).
