设计生物反应器以改善工程心脏组织的数据采集和模型通量

Summary

使用干细胞来源的心肌细胞进行生物工程改造的三维心脏组织已成为在 体外 研究健康和患病人类心肌的有前途的模型，同时概括了天然心脏生态位的关键方面。该手稿描述了一种用于制造和分析由人类诱导的多能干细胞来源的心肌细胞产生的高内涵工程心脏组织的方案。

Abstract

心力衰竭仍然是全球死亡的主要原因，因此迫切需要更好的人类心脏临床前模型。组织工程对于基础科学心脏研究至关重要; 体外 人类细胞培养消除了动物模型的种间差异，而更像组织的 3D 环境（例如，具有细胞外基质和异细胞偶联）比塑料培养皿上的传统二维培养更能模拟 体内 条件。然而，每个模型系统都需要专门的设备，例如定制设计的生物反应器和功能评估设备。此外，这些方案通常很复杂，劳动密集型，并且受到小而脆弱组织的失败的困扰。

本文描述了一种使用诱导多能干细胞来源的心肌细胞生成强大的人类工程心脏组织 （hECT） 模型系统的过程，用于组织功能的纵向测量。并行培养六个具有线性条形几何形状的 hECT，每个 hECT 悬挂在连接到 PDMS 架上的一对力感应聚二甲基硅氧烷 （PDMS） 柱上。每个帖子都有一个黑色的PDMS稳定帖子跟踪器（SPoT），这是一项新功能，可提高易用性、通量、组织保留率和数据质量。该形状允许对柱子挠度进行可靠的光学跟踪，从而产生具有绝对主动和被动张力的改进的抽搐力跟踪。帽的几何形状消除了由于 hECT 从柱子上滑落而导致的组织失效，并且由于它们涉及 PDMS 支架制造后的第二步，因此可以将 SPoT 添加到现有的基于 PDMS 柱子的设计中，而无需对生物反应器制造过程进行重大更改。

该系统用于证明在生理温度下测量 hECT 功能的重要性，并在数据采集过程中显示稳定的组织功能。总之，我们描述了一种最先进的模型系统，该系统再现了关键的生理条件，以提高体 外 应用工程心脏组织的生物保真度、效率和严谨性。

Introduction

工程心脏组织模型具有多种几何形状和配置，用于概括传统二维细胞培养难以实现的天然心脏生态位的各个方面。最常见的配置之一是线性组织条^，两端都有柔性锚点以诱导组织自组装，并为组织提供定义的预紧力和由此产生的抽搐力的读数 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11，^{12、13、14、15、16、17、18、19、20、21
，}22,23,24,25,26,27.通过对组织缩短的光学跟踪，并使用弹性束理论根据测得的挠度和锚栓的弹簧常数计算力，可以稳健地确定产生的力 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11^{，12、13、14、15、16、17、18、19、20、}
21,22,25,26,28。

然而，心脏组织工程仍然是一个不断发展的领域，仍然存在一些挑战。每个模型系统^10,29,30,31都需要专用设备，例如定制的生物反应器和功能评估设备。由于劳动密集型方案、大量细胞和组织脆性，这些构建体的微环境的大小和复杂性通常受到低通量的限制。为了解决这个问题，一些研究小组已经转向制造仅包含数百或数千个细胞的微组织，以促进对药物发现有用的高通量测定。然而，这种缩小的规模使功能¹²的准确评估变得复杂，消除了天然心脏生态位的关键方面（如营养/氧扩散梯度和复杂结构³⁶），并限制了可用于后续分子和结构分析的材料数量（通常需要组织混合）。表1总结了文献1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15^， 16,17,18,19,20^，
21,22,23,24,25,26,37,38,39,40。

群		每个组织的细胞数	每块板的组织	板格式		锚定功能		功能数据采集方法		共享媒体浴？	功能测量- 原地？
吉田 （ECT）38		400万	6	改良的 6 孔板*		力传感器		直接力测量		不	不
陈 （hESC-CM-ECT）26		310 千米	6	定制 6 孔培养皿		PDMS帖子		直接力测量		是的	不
范伯格 （dyn-EHT）16		150万	6	定制 6 孔培养皿		PDMS线		组织形状		不	是的
RADISIC（生物线）39、40		110 千米	8			高分子线材		线材形状		是的	是的
Costa（单 hECT）1， 2		1-200万	4**	10 厘米培养皿**		PDMS帖子		光学偏转（边缘/物体跟踪）		是的	是的
Costa（多 hECT）3–9		500 K-100万	6	6厘米培养皿		PDMS帖子		光学偏转（边缘/物体跟踪）		是的	是的
Costa（多 hECT 带 SPoT）		100万	6	6厘米培养皿		带黑色大写字母的 PDMS 帖子		光学偏转（物体跟踪）		是的	是的
帕西尔掀背/两厢车（EHT）17		245 千米	36	12孔板		带黑色大写字母的 PDMS 帖子		光学偏转（物体跟踪）		是的	是的
Vunjak-Novakovic13， 18		100万	12	6厘米培养皿		带大盖的 PDMS 柱		光学偏转（边缘检测）		是的	是的
Vunjak-Novakovic（MilliPillar）14		550 千米	6	定制 6 孔培养皿		带大盖的 PDMS 柱		光学偏转（物体跟踪）;钙成像		不	是的
埃申哈根 （EHT）10， 19–21		100万	12	12孔板		带大盖的 PDMS 柱		光学偏转（后偏转的边缘检测）;钙成像		不	是的
赞德斯特拉 （CaMiRi）22		25-150 千米	96	96孔板		带钩子的PDMS柱		光学偏转（边缘检测）		不	是的
穆里23， 24		900 千米	24	24孔板		带盖的PDMS接线柱，集成磁铁		磁性传感器		不	是的
帝国 （μTUG）11， 12， 25		定义	156	156孔培养皿		带盖的PDMS接线柱，集成磁铁		光学跟踪（荧光珠）		是的	是的

表1：文献中一些线性工程心脏组织模型的特征。 线性工程心脏组织模型在大小、通量、锚定特征设计、共享介质浴的便利性以及对用于功能表征的单独肌肉浴系统的要求方面各不相同。* 研究人员使用了基于标准 6 孔板尺寸的市售工程组织系统。** 一种模块化系统，其中单组织生物反应器以所需的数量和位置锚定在任何塑料培养皿上。

本文描述了构建我们建立的线性人类工程心脏组织 （hECT） 模型的最新协议1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27 以及评估 hECT 收缩功能的方法。每个多组织生物反应器在共享培养基浴中最多可容纳 6 个 hECT，并由两个由有机硅弹性体聚二甲基硅氧烷 （PDMS） 制成的“架”件组成，安装在刚性聚砜框架上。每个PDMS机架包含六个直径为0.5 mm，长为3.25 mm的柔性集成力传感柱，两个机架共同提供六对立柱，每个柱可容纳一个hECT。生物反应器的倒置有助于克服由于培养基中的水冷凝或气液界面弯月面的变形而对hECT的可视化的任何障碍。hECT 的每次收缩都会导致集成端柱的偏转，并且偏转信号的光学测量被处理成表示 hECT 收缩函数的力与时间的追踪 1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27 .与通常用于这种大小组织的单组织生物反应器相比，多组织设计提高了实验通量，并能够研究具有潜在不同细胞组成的相邻组织之间的旁分泌信号传导。该系统已在已发表的研究中得到验证，这些研究描述了疾病建模 ^4,8、旁分泌信号转导 ^6,7、异细胞培养 ^5,9 和治疗筛查 ^7,9 中的应用。

在该系统中，hECT 设计为长约 6 mm，直径约 0.5 mm，以便以低噪声对力测量进行稳健的光学跟踪。此外，扩散梯度和细胞组织等组织复杂性的各个方面都与每个组织 100 万个细胞的可管理要求相平衡。使用标准CCD相机技术，低至1 μN的力（表示小于5 μm的偏转后）会产生清晰的信号，确保即使是极弱的收缩功能，如某些hECT疾病模型所观察到的那样，也可以准确测量。这也有助于对抽搐力曲线进行详细分析，从而能够对多达 16 个收缩力指标⁴¹ 进行高内涵分析，包括发展力、收缩率 （+dF/dt） 和松弛率 （−dF/dt） 以及节拍率变异性。

该协议从制造生物反应器组件的说明开始。特别注意最大限度地提高hECT产量，减少组织功能的技术差异，并优化组织评估的质量和深度的步骤。大多数心脏组织工程研究没有报告制造和长期测试期间的组织损失率，尽管这是该领域众所周知的挑战，并降低了研究的通量和效率²⁷。这里描述的组织工程方法经过多年的改进，以确保所有hECT在大多数生物反应器中保留（无论PDMS架是如何制造的）。然而，即使是 5%-20% 的组织损失也会显着影响统计功效，特别是在受可用心肌细胞数量限制的小型实验中（例如，由于某些患病细胞系的分化挑战⁴ 或由于商业购买的心肌细胞的高成本），或受治疗条件（例如，各种治疗化合物的可用性有限或成本高）。

该协议描述了稳定柱跟踪器（SPoTs）的制造，这是PDMS机架的一个新功能，其功能是固定hECT²⁷的力感应柱末端的盖子。它展示了帽的几何形状如何显着减少因掉落或拉下柱子而造成的 hECT 损失，从而为培养具有更多刚度和张力的 hECT 开辟了新的机会，这在无盖柱上培养具有挑战性。此外，SPoT提供了一个高对比度的物体，通过一致且定义明确的形状²⁷来改善hECT收缩的光学跟踪。接下来是根据先前发表的方案 ^3,42,43 描述培养人诱导多能干细胞 （iPSC） 和心肌细胞分化，并解释 hECT 制造、培养和功能测量。

本文还讨论了在生理温度下测量组织功能的必要性。人心肌（胎儿以及成人健康和患病组织）以及来自多种动物物种（包括大鼠、猫、小鼠、雪貂和兔子）的心脏组织^44,45，与生理温度相比，在28°C-32°C的温度下，频率匹配的抽搐力显着增加 – 这种现象称为低温正性肌力^45，46.然而，温度对工程心肌组织功能的影响仍未得到充分研究。文献中许多最近的工程心脏组织模型被设计为在37°C下进行功能评估，以接近生理条件13,14,37。然而，据我们所知，尚未系统地研究温度对工程心脏组织产生的力的影响。该协议描述了一种起搏电极设计，该设计可最大限度地减少测试期间的热损失，并允许将绝缘加热元件合并到设置中以进行功能测量，这可以将 hECT 保持在生理温度而不会影响无菌^{性 27}。然后，我们报告了温度对hECT功能的一些观察到的影响，包括对产生的力，自发跳动频率，+dF / dt和−dF / dt。总而言之，本文提供了制造这种多组织力感应生物反应器系统所需的细节，以制造人类工程心脏组织并评估其收缩功能，并提供了一组数据，为室温和 37 °C 下的测量结果提供了比较基础²⁷。

Protocol

该协议使用了去识别化的 iPSC 系 SkiPS 31.3（最初使用来自健康 45 岁男性的真皮成纤维细胞重新编程）47，因此，根据该机构的人类研究伦理委员会指南，免于特定的机构审查委员会批准。在无菌条件下，在HEPA过滤的II类生物安全柜或层流工作台中进行所有细胞和hECT操作。通过0.22μm过滤器过滤对所有非无菌溶液进行灭菌，并将所有细胞和hECT保持在37°C，95%相对湿度和5%CO2?…

Representative Results

按照上述方案，心肌细胞从我们 9,15 组先前使用的健康 iPSC 系中产生，并在培养 8-61 天后制成 hECT。图9A显示了从底部观察的hECT的代表性图像，这些图像是在没有（顶部）和（底部）SPoT的情况下创建的。在hECT制备后37天至52天之间，在室温（23°C）和生理温度（36°C）下进行功能测量。在PDMS机架的制造过程中，我们已经证明，有经?…

Discussion

文献中发表了许多线性工程心脏组织模型，其中一些在表1中进行了描述。一些模型涉及组织力的直接测量，但这些模型通常需要将结构转移到单独的肌肉浴³⁸中。大多数型号的设计将组织永久固定在两端，最常见的是PDMS柱1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 <sup class="xr…

Materials

0.25 mm diamete 304 Stainless Steel Wire	McMaster Carr	6517K61
0.25% trypsin-EDTA	Gibco	25200056
1.7 mL Microtubes	Axygen	MCT-175-C
10 cm dishes (20 mm tall)	Corning	353003
10 mL Serological Pipette	Drummond	6-000-010
10 N NaOH	Fisher Scientific	SS225-1	dilute 1:10 in sterile distilled water
10X Modified Eagle Medium	Sigma Aldrich	M0275
20 – 200 μL Micropipette	Eppendorf	3123000055
200 μL MicroPipette Tips	VWR	76322-150
5 mL Serological Pipette	Drummond	6-000-005
50 mL Conical Centrifuge Tubes	Falcon	352070
6 cm Petri Dish	Corning	353002
6 Watt LED Dual Gooseneck Illuminator	AmScope	LED-6W
6-Well Plates	Corning	353046
90 degree angle mirror	Edmund Optics	45-594
Acrylic bonding glue	SCIGRIP	#4
Adjustable 10 cm x 10 cm jack	Fisher Scientific	14-673-50
Aluminum 6061	McMaster Carr	9008K82
A-Plan 10X Objective Lens	ZEISS	1020-863
Autoclave Bags	Propper	21002
B-27 supplement	ThermoFisher	17504044
B-27 supplement (without insulin)	ThermoFisher	A1895601
Benchtop Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Black ABS	Ultimaker		2.85 mm wide
Bovine Collagen I	Gibco	A1064401
CHIR99021	Tocris	4423
Class II Biosafety Cabinet	Labconco	3430009
Clear Acrylic Sheeting	estreetplastics	1002502436	6.25 mm thick
CNC Vertical Mill	Haas	VF-1
Conductive Graphite Bars	McMaster Carr	1763T33
Dissection microscope	Olympus	SZ61
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 Nutrient Mix	ThermoFisher	11330032
Ethanol	Fisher Scientific	A4094	Dilute to 70% in water
EVE Automated Cell counter	NanoEntek	E1000
EVE Cell Counting Slide	NanoEntek	EVS-050
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	10438026
Fine Curved Forceps	Fine Science Tools	11253-25
Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator	Thermo Electron Corporation	3110	AKA "incubator". With HEPA class 100 filter
Fusion360 software	Autodesk		AKA "CAD software"
Glass Hemocytometer	Reichert	1475	0.1 mm deep
HEPES	Sigma Aldrich	H3784
hESC qualified matrigel	Corning	354277	AKA "basement membrane matrix". Store in frozen aliquots
High Speed CCD Camera	PixelLINK	P7410
Inverted Microscope	Carl Zeiss Werk	Axiovert 40 CFL	10X phase contrast objective
IWR-1	Selleck Chem	S7086
LabView Software	National Instruments	2016
Laminar flow clean bench	NuAire	NU-201-330	necessary for hECT functional analysis
Laptop	AsusTek	Strix	Intel Core i& processor ,CPU 2.8GHz, 16GB RAM
Laser Cutting Machine	Epilog	Helix 24
Magnification headset	ExcelBlades	70020	Recommended for steps requiring fine manipulations
Matlab	Mathworks	Version 2019b or later	AKA "data analysis software"
Micro Vannas Scissors, 3 mm blade	WPI Instruments	501839
Microscope Boom Stand	Olympus	SZ2-STU1
Penicillin-Streptomycin stock solution	ThermoFisher	15140122	10,000 IU/ml penicillin; 10,000 μg/ml streptomycin
Phosphate-buffered saline without divalent cations	Sigma Aldrich	P3813	Diluted in distilled water to 1X and 10X concentrations
Pipette Controller	Drummond	4-000-100
PixelLINK Capture OEM	PixelLINK	10.2.1.6	AKA "Camera Software"
Polysulfone	McMaster Carr	86735K73	translucent amber color
Polytetrafluoroethylene (PTFE)	McMaster Carr	8545K176	Black, molded
ReLeSR	Stem Cell Technologies	5872	AKA "iPSC dissociation media"
Rosewell Park Memorial Institute 1640 Media	ThermoFisher	11875135
Silicone Sheeting	SMI manufacturing		glossy, 0.02 in thickness, durometer 40
Size 10/0 Blue, Green, Red, and Yellow Glass Seed Beads	Michael's		color should withstand autoclaving
Spatula	Fisher Scientific	14-373	used for mixing PDMS
Square Pulse Stimulator	Astro-Med / Grass Technologies	S88X
Stainless Steel Razoblades	GEM	62-0179-CTN	preferred over non-stainless steel due to lower hardness
Stemflex	ThermoFisher	A3349401	AKA "iPSC culture media"
Sterile distilled water	ThermoFisher	5230
Sylgard 170 -  Silicone Elastomer Encapsulant Black 0.9 kg Kit	Dow	DOWSIL 170 2LB KIT	AKA black Polydimethylsiloxane (black PDMS)
Sylgard 184 – Silicone Elastomer Clear 1 lb Kit	Dow	DC 184 SYLGARD 0.5KG 1.1LB KIT	AKA Polydimethylsiloxane (PDMS)
Temperature-controlled heated stage	Okolab	H401-HG-SMU	Set height to 10 cm
Thermoplastic 3D printer	Ultimaker	Ultimaker 3
Thiazovivin	Selleck Chem	S1459
Trypan Blue	NanoEntek	EBT-001
Vacuum Chamber	Bel-Art Parts	F42027-0000
Variable Speed Mini Band Saw	Micro-Mark	82203
Variable Speed Miniature Drill Press	Micro-Mark	82959
Vibration Isolation Table	Labconco	3618000
Weighing Boats	VWR	10803-140
Talon Cylinder Bench Clamp	VWR	97035-528	AKA screw clamp