Projetando um Biorreator para Melhorar a Aquisição de Dados e Modelar o Rendimento de Tecidos Cardíacos Projetados

Summary

Tecidos cardíacos tridimensionais bioprojetados usando cardiomiócitos derivados de células-tronco têm emergido como modelos promissores para estudar o miocárdio humano saudável e doente in vitro , enquanto recapitulam aspectos-chave do nicho cardíaco nativo. Este manuscrito descreve um protocolo para fabricação e análise de tecidos cardíacos projetados de alto conteúdo gerados a partir de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos.

Abstract

A insuficiência cardíaca continua sendo a principal causa de morte em todo o mundo, criando uma necessidade premente de melhores modelos pré-clínicos do coração humano. A engenharia de tecidos é crucial para a pesquisa em ciência básica cardíaca; a cultura de células humanas in vitro elimina as diferenças interespécies de modelos animais, enquanto um ambiente 3D mais semelhante a tecidos (por exemplo, com matriz extracelular e acoplamento heterocelular) simula condições in vivo em maior extensão do que a cultura bidimensional tradicional em placas de Petri plásticas. No entanto, cada sistema modelo requer equipamentos especializados, por exemplo, biorreatores personalizados e dispositivos de avaliação funcional. Além disso, esses protocolos são muitas vezes complicados, trabalhosos e atormentados pela falha dos tecidos pequenos e delicados.

Este artigo descreve um processo para gerar um sistema modelo robusto de tecido cardíaco humano projetado (hECT) usando cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos para a medição longitudinal da função tecidual. Seis hECTs com geometria de tira linear são cultivadas em paralelo, com cada hECT suspensa de um par de postes de polidimetilsiloxano (PDMS) com sensor de força acoplados a racks PDMS. Cada postagem é coberta com um rastreador de postagem estável PDMS preto (SPoT), um novo recurso que melhora a facilidade de uso, a taxa de transferência, a retenção de tecido e a qualidade dos dados. A forma permite o rastreamento óptico confiável de deflexões de poste, produzindo traçados de força de contração aprimorados com tensão ativa e passiva absoluta. A geometria da tampa elimina a falha tecidual devido ao deslizamento de hECTs dos postes e, como eles envolvem uma segunda etapa após a fabricação do rack PDMS, os SPoTs podem ser adicionados aos projetos pós-baseados em PDMS existentes sem grandes alterações no processo de fabricação do biorreator.

O sistema é usado para demonstrar a importância de medir a função hECT em temperaturas fisiológicas e mostra função tecidual estável durante a aquisição de dados. Em resumo, descrevemos um sistema modelo de última geração que reproduz condições fisiológicas fundamentais para promover a biofidelidade, eficiência e rigor de tecidos cardíacos projetados para aplicações in vitro .

Introduction

Os modelos de tecido cardíaco projetados vêm em uma gama diversificada de geometrias e configurações para recapitular vários aspectos do nicho cardíaco nativo que são difíceis de alcançar com a cultura de células bidimensional tradicional. Uma das configurações mais comuns é a tira de tecido linear^, com âncoras flexíveis em cada extremidade para induzir a automontagem do tecido e fornecer ao tecido uma pré-carga definida e uma leitura das forças de contração resultantes ^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,} 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21
^,22,23,24,25,26,27. A força gerada pode ser determinada de forma robusta através do rastreamento óptico do encurtamento tecidual e utilizando a teoria do feixe elástico para calcular a força a partir das deflexões medidas e a constante de mola das âncoras 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11^, 12,13,14,15,16,17,18,19,20^,
21,22,25,26,28.

No entanto, a engenharia de tecidos cardíacos ainda é um campo em evolução, e alguns desafios permanecem. Equipamentos especializados, como biorreatores sob medida e dispositivos de avaliação funcional, são necessários para cada sistema modelo 10,29,30,31. O tamanho e a complexidade do microambiente dessas construções são frequentemente limitados pelo baixo rendimento devido a protocolos trabalhosos, alto número de células e fragilidade tecidual. Para resolver isso, alguns grupos se voltaram para a fabricação de microtecidos contendo apenas centenas ou milhares de células para facilitar ensaios de alto rendimento que são úteis para a descoberta de drogas. No entanto, essa escala reduzida dificulta a avaliação precisa da função¹², elimina aspectos importantes do nicho cardíaco nativo (como gradientes de difusão de nutrientes/oxigênio e arquitetura complexa³⁶) e limita a quantidade de material disponível para análises moleculares e estruturais subsequentes (muitas vezes exigindo o agrupamento dos tecidos). A Tabela 1 resume algumas das configurações dos modelos lineares de tiras de tecido na literatura 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15^, 16,17,18,19,20^,
21,22,23,24,25,26,37,38,39,40.

Grupo		Células por tecido	Tecidos por placa	Formato da chapa		Recurso de ancoragem		Método de aquisição de dados funcionais		Banho de mídia compartilhado?	Medida funcional- E in loco?
Yoshida (ECT)38		4 milhões	6	placa de 6 poços modificada*		transdutor de força		medição direta de força		Não	Não
Chan (hESC-CM-ECTs)26		310 mil	6	prato personalizado de 6 poços		Postagens do PDMS		medição direta de força		Sim	Não
Feinberg (dyn-EHT)16		1,5 milhão	6	prato personalizado de 6 poços		Fio PDMS		forma do tecido		Não	Sim
RADÍSICO (BioWire)39, 40		110 mil	8			fio de polímero		forma do fio		Sim	Sim
Costa (hECT simples)1, 2		1-2 milhões	4**	Placa de Petri de 10 cm**		Postagens do PDMS		deflexão óptica (rastreamento de borda/objeto)		Sim	Sim
Costa (multi-hECT)3–9		500 k-1 milhão	6	6 cm Placa de Petri		Postagens do PDMS		deflexão óptica (rastreamento de borda/objeto)		Sim	Sim
Costa (multi-hECT com SPoT)		1 milhão	6	6 cm Placa de Petri		Postes PDMS com tampas pretas		deflexão óptica (rastreamento de objetos)		Sim	Sim
Passier (EHT)17		245 mil	36	Placa de 12 poços		Postes PDMS com tampas pretas		deflexão óptica (rastreamento de objetos)		Sim	Sim
Vunjak-Novakovic13, 18		1 milhão	12	6 cm Placa de Petri		Postes PDMS com tampas		deflexão óptica (detecção de borda)		Sim	Sim
Vunjak-Novakovic (MilliPilar)14		550 mil	6	prato personalizado de 6 poços		Postes PDMS com tampas		deflexão óptica (rastreamento de objetos); imagem do cálcio		Não	Sim
Eschenhagen (EHT)10, 19–21		1 milhão	12	Placa de 12 poços		Postes PDMS com tampas		deflexão óptica (detecção de borda de pós deflexão); imagem do cálcio		Não	Sim
Zandstra (CaMiRi)22		25-150 mil	96	Placa de 96 poços		Postes PDMS com ganchos		deflexão óptica (detecção de borda)		Não	Sim
Murry23, 24		900 mil	24	Placa de 24 poços		Postes PDMS com tampas, ímã integrado		sensor magnético		Não	Sim
Reich (μTUG)11, 12, 25		indefinido	156	Prato de 156 poços		Postes PDMS com tampas, ímã integrado		rastreamento óptico (cordão fluorescente)		Sim	Sim

Tabela 1: Características de alguns modelos lineares de tecido cardíaco na literatura. Os modelos de tecido cardíaco de engenharia linear variam em tamanho, rendimento, projetos de recursos de ancoragem e a facilitação de banhos médios compartilhados, bem como os requisitos para um sistema de banho muscular separado para caracterização funcional. * Os pesquisadores usaram um sistema de tecido projetado comercialmente disponível com base nas dimensões de uma placa padrão de 6 poços. ** Um sistema modular no qual biorreatores de tecido único são ancorados a qualquer placa de cultura plástica no número e local desejados.

Este trabalho descreve o protocolo mais recente para a fabricação de nosso modelo estabelecido de tecido cardíaco humano linear projetado (hECT)1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27 e métodos de avaliação da função contrátil da hECT. Cada biorreator multitecidual acomoda até seis hECTs em um banho médio compartilhado e é composto por duas peças de “rack” feitas do elastômero de silicone polidimetilsiloxano (PDMS) montado em uma estrutura rígida de polissulfona. Cada rack PDMS contém seis pinos flexíveis integrados de detecção de força que têm 0,5 mm de diâmetro e 3,25 mm de comprimento e, juntos, dois racks fornecem seis pares de postes, cada um dos quais contém um hECT. A inversão do biorreator ajuda a superar qualquer obstáculo à visualização dos hECTs por baixo devido à condensação de água do meio de cultura ou distorções do menisco da interface ar-líquido. Cada contração de uma hECT causa deflexão dos postes terminais integrados, e a medida óptica do sinal de deflexão é processada em um traçado força versus tempo representando a função contrátil da hECT 1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27 . Comparado aos biorreatores de tecido único tipicamente usados para tecidos desse tamanho, o desenho multitecidual melhora o rendimento experimental e permite o estudo da sinalização parácrina entre tecidos adjacentes de composição celular potencialmente diferente. Esse sistema foi validado em estudos publicados descrevendo aplicações em modelagem de^doenças4,8, sinalização parácrina6,7, cultura ^{heterocelular5,9} e triagem^{terapêutica7,9}.

Neste sistema, os hECTs são projetados para ter aproximadamente 6 mm de comprimento e 0,5 mm de diâmetro para facilitar o rastreamento óptico robusto de medições de força com baixo ruído. Além disso, aspectos da complexidade tecidual, como gradientes de difusão e organização celular, são equilibrados com uma necessidade gerenciável de 1 milhão de células por tecido. Com a tecnologia de câmera CCD padrão, forças tão fracas quanto 1 μN (representando menos de 5 μm pós-deflexão) geram um sinal claro, garantindo que mesmo a função contrátil extremamente fraca, como observado com alguns modelos de doença hECT, possa ser medida com precisão. Isso também facilita a análise detalhada da curva de força de contração, permitindo a análise de alto conteúdo de até 16 métricas de contratilidade⁴¹, incluindo força desenvolvida, taxas de contração (+dF/dt) e relaxamento (−dF/dt) e variabilidade da taxa de batimento.

Este protocolo começa com instruções para a fabricação dos componentes do biorreator. Atenção especial é dada às etapas para maximizar o rendimento da hECT, reduzir a variabilidade técnica na função tecidual e otimizar a qualidade e a profundidade da avaliação tecidual. A maioria dos estudos de engenharia de tecidos cardíacos não relata taxas de perda tecidual durante a fabricação e testes de longo prazo, embora seja um desafio bem conhecido na área e reduza o rendimento e a eficiência dos estudos²⁷. Os métodos de engenharia de tecidos descritos aqui foram refinados ao longo dos anos para garantir a retenção de todos os hECTs na maioria dos biorreatores (independentemente de como os racks PDMS são fabricados). No entanto, mesmo uma perda de 5%-20% de tecidos pode afetar significativamente o poder estatístico, particularmente em experimentos menores limitados pelo número de cardiomiócitos disponíveis (por exemplo, devido a desafios de diferenciação com algumas linhagens celulares doentes⁴ ou devido ao alto custo dos cardiomiócitos comprados comercialmente), ou pela condição de tratamento (por exemplo, disponibilidade limitada ou alto custo de vários compostos de tratamento).

Este protocolo descreve a fabricação de rastreadores de poste estável (SPoTs), um novo recurso dos racks PDMS, que funcionam como tampas nas extremidades dos postes de detecção de força que seguram os hECTs²⁷. Demonstra-se como a geometria da tampa reduz significativamente a perda de hECT por queda ou arrancamento dos postes, abrindo assim novas oportunidades para a cultura de hECTs com uma maior variedade de rigidezes e tensões, que são desafiadoras para a cultura em pinos sem tampa. Além disso, os SPoTs fornecem um objeto de alto contraste para melhorar o rastreamento óptico da contração da hECT por meio de uma forma consistente e bem definida²⁷. Segue-se uma descrição da cultura de células-tronco pluripotentes induzidas humanas (iPSCs) e diferenciação de cardiomiócitos com base em protocolos previamente publicados ^3,42,43 e uma explicação da fabricação, cultura e medidas funcionais da hECT.

Este artigo também aborda a necessidade de medir a função tecidual em temperatura fisiológica. O miocárdio humano (tanto tecido fetal como adulto saudável e doente), bem como tecido cardíaco de uma ampla gama de espécies animais (incluindo ratos, gatos, camundongos, furões e coelhos)^44,45, exibe um aumento acentuado na força de contração compatível com a frequência em temperaturas de 28 °C-32 °C em comparação com a temperatura fisiológica – um fenômeno conhecido como inotropia hipotérmica^{45, 46º}. No entanto, os efeitos da temperatura sobre a função do tecido miocárdico modificado permanecem pouco estudados. Muitos modelos recentes de tecido cardíaco projetados na literatura são projetados para serem avaliados funcionalmente a 37 °C para aproximar condições fisiológicas 13,14,37. No entanto, até onde sabemos, os efeitos dependentes da temperatura sobre a força gerada pelos tecidos cardíacos modificados não têm sido sistematicamente investigados. Esse protocolo descreve um projeto de eletrodo de estimulação que minimiza a perda de calor durante o teste, além de permitir a incorporação de um elemento de aquecimento isolado no setup para medidas funcionais, o que pode manter os hECTs em temperatura fisiológica sem comprometer a esterilidade²⁷. Em seguida, relatamos alguns dos efeitos observados da temperatura na função hECT, incluindo sobre a força desenvolvida, frequência de batimento espontâneo, +dF/dt e −dF/dt. Em conjunto, este artigo fornece os detalhes necessários para fabricar este sistema de biorreator multitecidual com sensor de força para fabricar tecidos cardíacos humanos projetados e avaliar sua função contrátil, e um conjunto de dados é apresentado que fornece uma base de comparação para medições à temperatura ambiente e a 37 °C²⁷.

Protocol

Esse protocolo utilizou uma linha iPSC não identificada, SkiPS 31.3 (originalmente reprogramada com fibroblastos dérmicos de um homem saudável de 45 anos)47, sendo, portanto, isento de aprovação específica do Comitê de Ética em Pesquisa da instituição, em concordância com as diretrizes do comitê de ética em pesquisa com seres humanos da instituição. Realizar toda a manipulação celular e hECT em condições assépticas em um gabinete de segurança biológica classe II filtrado por …

Representative Results

Seguindo o protocolo acima, os cardiomiócitos foram gerados a partir de uma linhagem iPSC saudável usada previamente por nosso grupo 9,15 e fabricados em hECTs após 8-61 dias em cultura. A Figura 9A mostra imagens representativas de hECTs vistas de baixo, que foram criadas sem SPoTs (superior) e com SPoTs (inferior). Medidas funcionais foram realizadas à temperatura ambiente (23 °C) e fisiológica (36 °C) entre 37 dias e 52 dia…

Discussion

Existem inúmeros modelos lineares de tecido cardíaco modificados publicados na literatura, alguns dos quais estão descritos na Tabela 1. Alguns modelos envolvem a medida direta da força tecidual, mas estes tipicamente requerem a transferência do construto para um banho muscular separado³⁸. A maioria dos modelos é desenhada com os tecidos ancorados permanentemente em ambas as extremidades, mais comumente aos pinos do PDMS1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16<sup class="xref"…

Materials

0.25 mm diamete 304 Stainless Steel Wire	McMaster Carr	6517K61
0.25% trypsin-EDTA	Gibco	25200056
1.7 mL Microtubes	Axygen	MCT-175-C
10 cm dishes (20 mm tall)	Corning	353003
10 mL Serological Pipette	Drummond	6-000-010
10 N NaOH	Fisher Scientific	SS225-1	dilute 1:10 in sterile distilled water
10X Modified Eagle Medium	Sigma Aldrich	M0275
20 – 200 μL Micropipette	Eppendorf	3123000055
200 μL MicroPipette Tips	VWR	76322-150
5 mL Serological Pipette	Drummond	6-000-005
50 mL Conical Centrifuge Tubes	Falcon	352070
6 cm Petri Dish	Corning	353002
6 Watt LED Dual Gooseneck Illuminator	AmScope	LED-6W
6-Well Plates	Corning	353046
90 degree angle mirror	Edmund Optics	45-594
Acrylic bonding glue	SCIGRIP	#4
Adjustable 10 cm x 10 cm jack	Fisher Scientific	14-673-50
Aluminum 6061	McMaster Carr	9008K82
A-Plan 10X Objective Lens	ZEISS	1020-863
Autoclave Bags	Propper	21002
B-27 supplement	ThermoFisher	17504044
B-27 supplement (without insulin)	ThermoFisher	A1895601
Benchtop Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Black ABS	Ultimaker		2.85 mm wide
Bovine Collagen I	Gibco	A1064401
CHIR99021	Tocris	4423
Class II Biosafety Cabinet	Labconco	3430009
Clear Acrylic Sheeting	estreetplastics	1002502436	6.25 mm thick
CNC Vertical Mill	Haas	VF-1
Conductive Graphite Bars	McMaster Carr	1763T33
Dissection microscope	Olympus	SZ61
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 Nutrient Mix	ThermoFisher	11330032
Ethanol	Fisher Scientific	A4094	Dilute to 70% in water
EVE Automated Cell counter	NanoEntek	E1000
EVE Cell Counting Slide	NanoEntek	EVS-050
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	10438026
Fine Curved Forceps	Fine Science Tools	11253-25
Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator	Thermo Electron Corporation	3110	AKA "incubator". With HEPA class 100 filter
Fusion360 software	Autodesk		AKA "CAD software"
Glass Hemocytometer	Reichert	1475	0.1 mm deep
HEPES	Sigma Aldrich	H3784
hESC qualified matrigel	Corning	354277	AKA "basement membrane matrix". Store in frozen aliquots
High Speed CCD Camera	PixelLINK	P7410
Inverted Microscope	Carl Zeiss Werk	Axiovert 40 CFL	10X phase contrast objective
IWR-1	Selleck Chem	S7086
LabView Software	National Instruments	2016
Laminar flow clean bench	NuAire	NU-201-330	necessary for hECT functional analysis
Laptop	AsusTek	Strix	Intel Core i& processor ,CPU 2.8GHz, 16GB RAM
Laser Cutting Machine	Epilog	Helix 24
Magnification headset	ExcelBlades	70020	Recommended for steps requiring fine manipulations
Matlab	Mathworks	Version 2019b or later	AKA "data analysis software"
Micro Vannas Scissors, 3 mm blade	WPI Instruments	501839
Microscope Boom Stand	Olympus	SZ2-STU1
Penicillin-Streptomycin stock solution	ThermoFisher	15140122	10,000 IU/ml penicillin; 10,000 μg/ml streptomycin
Phosphate-buffered saline without divalent cations	Sigma Aldrich	P3813	Diluted in distilled water to 1X and 10X concentrations
Pipette Controller	Drummond	4-000-100
PixelLINK Capture OEM	PixelLINK	10.2.1.6	AKA "Camera Software"
Polysulfone	McMaster Carr	86735K73	translucent amber color
Polytetrafluoroethylene (PTFE)	McMaster Carr	8545K176	Black, molded
ReLeSR	Stem Cell Technologies	5872	AKA "iPSC dissociation media"
Rosewell Park Memorial Institute 1640 Media	ThermoFisher	11875135
Silicone Sheeting	SMI manufacturing		glossy, 0.02 in thickness, durometer 40
Size 10/0 Blue, Green, Red, and Yellow Glass Seed Beads	Michael's		color should withstand autoclaving
Spatula	Fisher Scientific	14-373	used for mixing PDMS
Square Pulse Stimulator	Astro-Med / Grass Technologies	S88X
Stainless Steel Razoblades	GEM	62-0179-CTN	preferred over non-stainless steel due to lower hardness
Stemflex	ThermoFisher	A3349401	AKA "iPSC culture media"
Sterile distilled water	ThermoFisher	5230
Sylgard 170 -  Silicone Elastomer Encapsulant Black 0.9 kg Kit	Dow	DOWSIL 170 2LB KIT	AKA black Polydimethylsiloxane (black PDMS)
Sylgard 184 – Silicone Elastomer Clear 1 lb Kit	Dow	DC 184 SYLGARD 0.5KG 1.1LB KIT	AKA Polydimethylsiloxane (PDMS)
Temperature-controlled heated stage	Okolab	H401-HG-SMU	Set height to 10 cm
Thermoplastic 3D printer	Ultimaker	Ultimaker 3
Thiazovivin	Selleck Chem	S1459
Trypan Blue	NanoEntek	EBT-001
Vacuum Chamber	Bel-Art Parts	F42027-0000
Variable Speed Mini Band Saw	Micro-Mark	82203
Variable Speed Miniature Drill Press	Micro-Mark	82959
Vibration Isolation Table	Labconco	3618000
Weighing Boats	VWR	10803-140
Talon Cylinder Bench Clamp	VWR	97035-528	AKA screw clamp