Conception d’un bioréacteur pour améliorer l’acquisition de données et modéliser le débit des tissus cardiaques modifiés
Summary
Les tissus cardiaques tridimensionnels issus de la bio-ingénierie à l’aide de cardiomyocytes dérivés de cellules souches sont apparus comme des modèles prometteurs pour l’étude in vitro du myocarde humain sain et malade, tout en récapitulant les aspects clés de la niche cardiaque native. Ce manuscrit décrit un protocole de fabrication et d’analyse de tissus cardiaques artificiels à haut contenu générés à partir de cardiomyocytes induits pluripotents dérivés de cellules souches humaines.
Abstract
L’insuffisance cardiaque reste la principale cause de décès dans le monde, ce qui crée un besoin pressant de meilleurs modèles précliniques du cœur humain. L’ingénierie tissulaire est cruciale pour la recherche fondamentale en cardiologie. La culture de cellules humaines in vitro élimine les différences interspécifiques des modèles animaux, tandis qu’un environnement 3D plus semblable à celui des tissus (par exemple, avec une matrice extracellulaire et un couplage hétérocellulaire) simule les conditions in vivo dans une plus grande mesure que la culture bidimensionnelle traditionnelle sur des boîtes de Pétri en plastique. Cependant, chaque système modèle nécessite un équipement spécialisé, par exemple des bioréacteurs conçus sur mesure et des dispositifs d’évaluation fonctionnelle. De plus, ces protocoles sont souvent compliqués, laborieux et en proie à la défaillance des petits tissus délicats.
Cet article décrit un processus de génération d’un système modèle robuste de tissu cardiaque artificiel (hECT) utilisant des cardiomyocytes pluripotents induits dérivés de cellules souches pour la mesure longitudinale de la fonction tissulaire. Six hECT avec une géométrie linéaire de bande sont cultivés en parallèle, chaque hECT étant suspendu à une paire de poteaux en polydiméthylsiloxane (PDMS) à détection de force fixés à des racks PDMS. Chaque poste est recouvert d’un suivi de poste stable PDMS (SPoT) noir, une nouvelle fonctionnalité qui améliore la facilité d’utilisation, le débit, la rétention des tissus et la qualité des données. La forme permet un suivi optique fiable des déviations des poteaux, ce qui permet d’améliorer les tracés de la force de contraction avec une tension active et passive absolue. La géométrie du capuchon élimine les défaillances tissulaires dues au glissement des hECT des poteaux, et comme ils impliquent une deuxième étape après la fabrication du rack PDMS, les SPoT peuvent être ajoutés aux conceptions PDMS existantes basées sur les poteaux sans modifications majeures du processus de fabrication du bioréacteur.
Le système est utilisé pour démontrer l’importance de mesurer la fonction hECT à des températures physiologiques et montre une fonction tissulaire stable pendant l’acquisition des données. En résumé, nous décrivons un système modèle de pointe qui reproduit les conditions physiologiques clés pour faire progresser la biofidélité, l’efficacité et la rigueur des tissus cardiaques modifiés pour des applications in vitro .
Introduction
Les modèles de tissus cardiaques modifiés se présentent sous la forme d’un large éventail de géométries et de configurations permettant de récapituler divers aspects de la niche cardiaque native qui sont difficiles à atteindre avec la culture cellulaire bidimensionnelle traditionnelle. L’une des configurations les plus courantes est la bande de tissu linéaire, avec des ancrages flexibles à chaque extrémité pour induire l’auto-assemblage des tissus et fournir au tissu une précharge définie et une lecture des forces de contraction résultantes 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21
,22,23,24,25,26,27. La force générée peut être déterminée de manière robuste grâce au suivi optique du raccourcissement des tissus et à l’utilisation de la théorie des faisceaux élastiques pour calculer la force à partir des flèches mesurées et de la constante de ressort des ancrages 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,
21,22,25,26,28.
Cependant, l’ingénierie des tissus cardiaques est encore un domaine en constante évolution, et certains défis demeurent. Des équipements spécialisés, tels que des bioréacteurs sur mesure et des dispositifs d’évaluation fonctionnelle, sont nécessaires pour chaque système modèle 10,29,30,31. La taille et la complexité du microenvironnement de ces constructions sont souvent limitées par un faible débit en raison de protocoles à forte intensité de main-d’œuvre, d’un nombre élevé de cellules et de la fragilité des tissus. Pour y remédier, certains groupes se sont tournés vers la fabrication de microtissus ne contenant que des centaines ou des milliers de cellules afin de faciliter les tests à haut débit utiles à la découverte de médicaments. Cependant, cette échelle réduite complique l’évaluation précise de la fonction12, élimine des aspects clés de la niche cardiaque native (tels que les gradients de diffusion des nutriments et de l’oxygène et l’architecture complexe36) et limite la quantité de matériel disponible pour l’analyse moléculaire et structurale ultérieure (nécessitant souvent la mise en commun des tissus). Le tableau 1 résume certaines des configurations des modèles linéaires de bandelettes tissulaires dans la littérature 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15, 16,17,18,19,20,
21,22,23,24,25,26,37,38,39,40.
| Groupe | Cellules par tissu | Mouchoirs par plaque | Format de la plaque | Fonction d’ancrage | Procédé d’acquisition de données fonctionnelles | Bain multimédia partagé ? | Mesure fonctionnelle in situ ? |
||||
| Yoshida (ECT)38 | 4 millions | 6 | Plaque modifiée à 6 puits* | capteur de force | Mesure directe de la force | Non | Non | ||||
| Chan (hESC-CM-ECTs)26 | 310 millier | 6 | Plat personnalisé à 6 puits | Poteaux PDMS | Mesure directe de la force | oui | Non | ||||
| Feinberg (dyn-EHT)16 | 1,5 million | 6 | Plat personnalisé à 6 puits | Fil PDMS | forme des tissus | Non | oui | ||||
| RADISIC (BioWire)39, 40 | 110 millier | 8 | fil polymère | Forme du fil | oui | oui | |||||
| Costa (hECT simple)1, 2 | 1 à 2 millions | 4** | Boîte de Pétri de 10 cm** | Poteaux PDMS | Déviation optique (suivi des bords/objets) | oui | oui | ||||
| Costa (multi-hECT)3–9 | 500 k-1 million | 6 | Boîte de Pétri de 6 cm | Poteaux PDMS | Déviation optique (suivi des bords/objets) | oui | oui | ||||
| Costa (multi-hECT avec SPoT) | 1 million | 6 | Boîte de Pétri de 6 cm | Poteaux PDMS avec capuchons noirs | Déviation optique (suivi d’objet) | oui | oui | ||||
| Passier (EHT)17 | 245 millier | 36 | Plaque à 12 puits | Poteaux PDMS avec capuchons noirs | Déviation optique (suivi d’objet) | oui | oui | ||||
| Vunjak-Novakovic13, 18 | 1 million | 12 | Boîte de Pétri de 6 cm | Poteaux PDMS avec capuchons | Déviation optique (détection des bords) | oui | oui | ||||
| Vunjak-Novakovic (MilliPilier)14 | 550 millier | 6 | Plat personnalisé à 6 puits | Poteaux PDMS avec capuchons | déviation optique (suivi d’objet) ; Imagerie calcique | Non | oui | ||||
| Eschenhagen (EHT)10, 19–21 | 1 million | 12 | Plaque à 12 puits | Poteaux PDMS avec capuchons | déviation optique (détection des bords de la déviation post) ; Imagerie calcique | Non | oui | ||||
| Zandstra (CaMiRi)22 | 25 à 150 milles | 96 | Plaque à 96 puits | Poteaux PDMS avec crochets | Déviation optique (détection des bords) | Non | oui | ||||
| Murry23, 24 | 900 millier | 24 | Plaque à 24 puits | Poteaux PDMS avec capuchons, aimant intégré | Capteur magnétique | Non | oui | ||||
| Reich (μTUG)11, 12, 25 | indéfini | 156 | Antenne parabolique à 156 puits | Poteaux PDMS avec capuchons, aimant intégré | Suivi optique (bille fluorescente) | oui | oui | ||||
Tableau 1 : Caractéristiques de certains modèles linéaires de tissus cardiaques dans la littérature. Les modèles linéaires de tissus cardiaques varient en termes de taille, de débit, de conception des caractéristiques d’ancrage et de facilitation des bains moyens partagés, ainsi que des exigences d’un système de bain musculaire séparé pour la caractérisation fonctionnelle. * Les chercheurs ont utilisé un système de tissus artificiels disponible dans le commerce basé sur les dimensions d’une plaque standard à 6 puits. ** Un système modulaire dans lequel des bioréacteurs à tissu unique sont ancrés à n’importe quelle boîte de culture en plastique dans le nombre et l’emplacement souhaités.
Cet article décrit le dernier protocole pour la fabrication de notre modèle établi de tissu cardiaque linéaire d’ingénierie humaine (hECT)1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27 et des méthodes d’évaluation de la fonction contractile de l’hECT. Chaque bioréacteur multi-tissus peut accueillir jusqu’à six hECT dans un bain de milieu partagé et est composé de deux pièces « rack » en polydiméthylsiloxane élastomère de silicone (PDMS) montées sur un châssis rigide en polysulfone. Chaque rack PDMS contient six poteaux flexibles intégrés à détection de force de 0,5 mm de diamètre et de 3,25 mm de long, et ensemble, deux racks fournissent six paires de poteaux, chacun contenant un hECT. L’inversion du bioréacteur permet de surmonter tout obstacle à la visualisation des hECTs par le bas en raison de la condensation de l’eau du milieu de culture ou des distorsions du ménisque de l’interface air-liquide. Chaque contraction d’un hECT provoque une déviation des bornes intégrées, et la mesure optique du signal de déviation est traitée en un traçage de la force en fonction du temps représentant la fonction contractile de l’hECT 1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27 . Par rapport aux bioréacteurs à tissu unique généralement utilisés pour les tissus de cette taille, la conception multi-tissus améliore le débit expérimental et permet l’étude de la signalisation paracrine entre des tissus adjacents de composition cellulaire potentiellement différente. Ce système a été validé dans des études publiées décrivant des applications dans la modélisation des maladies 4,8, la signalisation paracrine 6,7, la culture hétérocellulaire 5,9 et le criblage thérapeutique 7,9.
Dans ce système, les hECT sont conçus pour avoir une longueur d’environ 6 mm et un diamètre de 0,5 mm afin de faciliter un suivi optique robuste des mesures de force avec un faible bruit. De plus, les aspects de la complexité tissulaire tels que les gradients de diffusion et l’organisation cellulaire sont équilibrés avec un besoin gérable de 1 million de cellules par tissu. Avec la technologie de caméra CCD standard, des forces aussi faibles que 1 μN (représentant moins de 5 μm après la déviation) génèrent un signal clair, garantissant que même une fonction contractile extrêmement faible, telle qu’observée avec certains modèles de maladie hECT, peut être mesurée avec précision. Cela facilite également l’analyse détaillée de la courbe de force de contraction, permettant ainsi l’analyse à haut contenu d’un maximum de 16 paramètres de contractilité41, y compris la force développée, les taux de contraction (+dF/dt) et de relaxation (−dF/dt), et la variabilité de la vitesse de battement.
Ce protocole commence par des instructions pour la fabrication des composants du bioréacteur. Une attention particulière est accordée aux étapes permettant de maximiser le rendement de l’hECT, de réduire la variabilité technique de la fonction tissulaire et d’optimiser la qualité et la profondeur de l’évaluation tissulaire. La plupart des études d’ingénierie des tissus cardiaques ne font pas état de taux de perte de tissus au cours de la fabrication et des tests à long terme, bien qu’il s’agisse d’un défi bien connu sur le terrain et qu’il réduise le débit et l’efficacité des études27. Les méthodes d’ingénierie tissulaire décrites ici ont été affinées au fil des ans pour assurer la rétention de tous les hECT dans la plupart des bioréacteurs (quelle que soit la façon dont les racks PDMS sont fabriqués). Cependant, même une perte de 5 à 20 % de tissus peut affecter considérablement la puissance statistique, en particulier dans les petites expériences limitées par le nombre de cardiomyocytes disponibles (par exemple, en raison de problèmes de différenciation avec certaines lignées cellulaires malades4 ou en raison du coût élevé des cardiomyocytes achetés dans le commerce), ou par les conditions de traitement (par exemple, la disponibilité limitée ou le coût élevé de divers composés de traitement).
Ce protocole décrit la fabrication de trackers de poteaux stables (SPoT), une nouvelle fonctionnalité des racks PDMS, qui fonctionnent comme des capuchons aux extrémités des poteaux de détection de force qui maintiennent les hECT27. Il est démontré comment la géométrie du capuchon réduit considérablement la perte d’hECT due à la chute ou à l’arrachement des poteaux, ouvrant ainsi de nouvelles possibilités pour la culture d’hECT avec une plus grande variété de rigidités et de tensions, qui sont difficiles à cultiver sur des poteaux non coiffés. De plus, les SPoT fournissent un objet à contraste élevé pour améliorer le suivi optique de la contraction de l’hECT grâce à une forme cohérente et bien définie27. Ceci est suivi d’une description de la culture des cellules souches pluripotentes induites humaines (CSPi) et de la différenciation des cardiomyocytes basée sur des protocoles publiés antérieurement 3,42,43 et d’une explication de la fabrication, de la culture et des mesures fonctionnelles de l’hECT.
Cet article traite également de la nécessité de mesurer la fonction tissulaire à la température physiologique. Le myocarde humain (tissus sains et malades du fœtus et de l’adulte), ainsi que le tissu cardiaque d’un large éventail d’espèces animales (y compris les rats, les chats, les souris, les furets et les lapins)44,45, présentent une augmentation marquée de la force de contraction adaptée à la fréquence à des températures de 28 °C à 32 °C par rapport à la température physiologique – un phénomène connu sous le nom d’inotropie hypothermique45, Chapitre 46. Cependant, les effets de la température sur la fonction du tissu myocardique artificiel restent peu étudiés. De nombreux modèles récents de tissus cardiaques modifiés dans la littérature sont conçus pour être évalués fonctionnellement à 37 °C afin de se rapprocher des conditions physiologiques 13,14,37. Cependant, à notre connaissance, les effets dépendants de la température sur la force générée par les tissus cardiaques modifiés n’ont pas été systématiquement étudiés. Ce protocole décrit une conception d’électrode de stimulation qui minimise les pertes de chaleur pendant les essais, tout en permettant l’incorporation d’un élément chauffant isolé dans l’installation pour les mesures fonctionnelles, ce qui peut maintenir les hECT à la température physiologique sans compromettre la stérilité27. Nous rapportons ensuite certains des effets observés de la température sur la fonction hECT, y compris sur la force développée, la fréquence des battements spontanés, +dF/dt et −dF/dt. Dans l’ensemble, cet article fournit les détails nécessaires à la fabrication de ce système de bioréacteur multi-tissu à détection de force pour fabriquer des tissus cardiaques modifiés chez l’homme et pour évaluer leur fonction contractile, et un ensemble de données est présenté qui fournit une base de comparaison pour les mesures à température ambiante et à 37 °C27.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il existe de nombreux modèles linéaires de tissus cardiaques modifiés publiés dans la littérature, dont certains sont décrits dans le tableau 1. Certains modèles impliquent la mesure directe de la force tissulaire, mais ceux-ci nécessitent généralement de transférer la construction dans un bain musculaire séparé38. La plupart des modèles sont conçus avec les tissus ancrés en permanence aux deux extrémités, le plus souvent aux poteaux PDMS …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient le Dr Timothy Cashman pour ses travaux antérieurs sur cette méthode. Cette étude a été financée par les National Institutes of Health (NIH) (R01-HL132226 et K01 HL133424) et le programme des réseaux d’excellence internationaux de la Fondation Leducq (CURE-PLaN).
Materials
| 0.25 mm diamete 304 Stainless Steel Wire | McMaster Carr | 6517K61 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| 1.7 mL Microtubes | Axygen | MCT-175-C | |
| 10 cm dishes (20 mm tall) | Corning | 353003 | |
| 10 mL Serological Pipette | Drummond | 6-000-010 | |
| 10 N NaOH | Fisher Scientific | SS225-1 | dilute 1:10 in sterile distilled water |
| 10X Modified Eagle Medium | Sigma Aldrich | M0275 | |
| 20 – 200 μL Micropipette | Eppendorf | 3123000055 | |
| 200 μL MicroPipette Tips | VWR | 76322-150 | |
| 5 mL Serological Pipette | Drummond | 6-000-005 | |
| 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | |
| 6 cm Petri Dish | Corning | 353002 | |
| 6 Watt LED Dual Gooseneck Illuminator | AmScope | LED-6W | |
| 6-Well Plates | Corning | 353046 | |
| 90 degree angle mirror | Edmund Optics | 45-594 | |
| Acrylic bonding glue | SCIGRIP | #4 | |
| Adjustable 10 cm x 10 cm jack | Fisher Scientific | 14-673-50 | |
| Aluminum 6061 | McMaster Carr | 9008K82 | |
| A-Plan 10X Objective Lens | ZEISS | 1020-863 | |
| Autoclave Bags | Propper | 21002 | |
| B-27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| B-27 supplement (without insulin) | ThermoFisher | A1895601 | |
| Benchtop Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Black ABS | Ultimaker | 2.85 mm wide | |
| Bovine Collagen I | Gibco | A1064401 | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
| Class II Biosafety Cabinet | Labconco | 3430009 | |
| Clear Acrylic Sheeting | estreetplastics | 1002502436 | 6.25 mm thick |
| CNC Vertical Mill | Haas | VF-1 | |
| Conductive Graphite Bars | McMaster Carr | 1763T33 | |
| Dissection microscope | Olympus | SZ61 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 Nutrient Mix | ThermoFisher | 11330032 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | A4094 | Dilute to 70% in water |
| EVE Automated Cell counter | NanoEntek | E1000 | |
| EVE Cell Counting Slide | NanoEntek | EVS-050 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10438026 | |
| Fine Curved Forceps | Fine Science Tools | 11253-25 | |
| Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Electron Corporation | 3110 | AKA "incubator". With HEPA class 100 filter |
| Fusion360 software | Autodesk | AKA "CAD software" | |
| Glass Hemocytometer | Reichert | 1475 | 0.1 mm deep |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3784 | |
| hESC qualified matrigel | Corning | 354277 | AKA "basement membrane matrix". Store in frozen aliquots |
| High Speed CCD Camera | PixelLINK | P7410 | |
| Inverted Microscope | Carl Zeiss Werk | Axiovert 40 CFL | 10X phase contrast objective |
| IWR-1 | Selleck Chem | S7086 | |
| LabView Software | National Instruments | 2016 | |
| Laminar flow clean bench | NuAire | NU-201-330 | necessary for hECT functional analysis |
| Laptop | AsusTek | Strix | Intel Core i& processor ,CPU 2.8GHz, 16GB RAM |
| Laser Cutting Machine | Epilog | Helix 24 | |
| Magnification headset | ExcelBlades | 70020 | Recommended for steps requiring fine manipulations |
| Matlab | Mathworks | Version 2019b or later | AKA "data analysis software" |
| Micro Vannas Scissors, 3 mm blade | WPI Instruments | 501839 | |
| Microscope Boom Stand | Olympus | SZ2-STU1 | |
| Penicillin-Streptomycin stock solution | ThermoFisher | 15140122 | 10,000 IU/ml penicillin; 10,000 μg/ml streptomycin |
| Phosphate-buffered saline without divalent cations | Sigma Aldrich | P3813 | Diluted in distilled water to 1X and 10X concentrations |
| Pipette Controller | Drummond | 4-000-100 | |
| PixelLINK Capture OEM | PixelLINK | 10.2.1.6 | AKA "Camera Software" |
| Polysulfone | McMaster Carr | 86735K73 | translucent amber color |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) | McMaster Carr | 8545K176 | Black, molded |
| ReLeSR | Stem Cell Technologies | 5872 | AKA "iPSC dissociation media" |
| Rosewell Park Memorial Institute 1640 Media | ThermoFisher | 11875135 | |
| Silicone Sheeting | SMI manufacturing | glossy, 0.02 in thickness, durometer 40 | |
| Size 10/0 Blue, Green, Red, and Yellow Glass Seed Beads | Michael's | color should withstand autoclaving | |
| Spatula | Fisher Scientific | 14-373 | used for mixing PDMS |
| Square Pulse Stimulator | Astro-Med / Grass Technologies | S88X | |
| Stainless Steel Razoblades | GEM | 62-0179-CTN | preferred over non-stainless steel due to lower hardness |
| Stemflex | ThermoFisher | A3349401 | AKA "iPSC culture media" |
| Sterile distilled water | ThermoFisher | 5230 | |
| Sylgard 170 - Silicone Elastomer Encapsulant Black 0.9 kg Kit | Dow | DOWSIL 170 2LB KIT | AKA black Polydimethylsiloxane (black PDMS) |
| Sylgard 184 – Silicone Elastomer Clear 1 lb Kit | Dow | DC 184 SYLGARD 0.5KG 1.1LB KIT | AKA Polydimethylsiloxane (PDMS) |
| Temperature-controlled heated stage | Okolab | H401-HG-SMU | Set height to 10 cm |
| Thermoplastic 3D printer | Ultimaker | Ultimaker 3 | |
| Thiazovivin | Selleck Chem | S1459 | |
| Trypan Blue | NanoEntek | EBT-001 | |
| Vacuum Chamber | Bel-Art Parts | F42027-0000 | |
| Variable Speed Mini Band Saw | Micro-Mark | 82203 | |
| Variable Speed Miniature Drill Press | Micro-Mark | 82959 | |
| Vibration Isolation Table | Labconco | 3618000 | |
| Weighing Boats | VWR | 10803-140 | |
| Talon Cylinder Bench Clamp | VWR | 97035-528 | AKA screw clamp |
Referências
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